基于高通量測定肉雞回腸微生物多樣性及PICRUSt基因預測分析

徐　帥　林奕岑　周夢佳　倪學勤　曾　東　曾　燕

(四川農業大學動物醫學院動物微生態研究中心，成都611130)

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基于高通量測定肉雞回腸微生物多樣性及PICRUSt基因預測分析

徐帥林奕岑*周夢佳倪學勤**曾東**曾燕

(四川農業大學動物醫學院動物微生態研究中心，成都611130)

本試驗旨在研究健康肉雞回腸的微生物群落結構及功能。采用高通量測序技術對15只雞的回腸內容物進行測序，按照97%的相似度歸類操作分類單元(OTUs)，去除序列數量少的OTUs(n<2)，然后進行生物信息學分析及PICRUSt基因預測。結果表明：1)共獲得424 062條tags，并歸類于1 002個非單OTUs，樣品平均tags為(28 271±8 855)條，平均OTUs為(261±82)個。2)所有樣品共含有20個菌門，160個菌屬。其中，共享核心菌門4個，分別是厚壁菌門(85.35%)、變形菌門(6.09%)、藍細菌門(2.15%)和放線菌門(0.16%)；共享核心菌屬19個，占樣品微生物總量的93.75%。3)雞回腸樣品預測得出328個功能。從前20個功能熱圖可知，各樣品的效能存在差異。由此可見，雞回腸微生物群落復雜，但主要菌群相對穩定。本試驗為進一步研究雞回腸微生物群落結構與功能提供了參考依據。

肉雞；回腸；高通量測序；核心菌群；PICRUSt

雞的腸道是一個巨大的生態系統，腸道微生物對雞的營養、免疫等功能有著重要的影響。雞腸道的不同部位具有不同的作用，其中回腸是營養物質吸收的關鍵部位，且微生物多樣性較高被人們廣泛關注[1]。雞腸道微生物多樣性的研究方法有很多，早期主要采用傳統培養的方法[2]，但腸道中厭氧細菌居多，因此大量微生物未被分離培養。隨著分子指紋圖譜方法的出現，如末端限制性片段長度多態性(terminal-restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)分析[3]、變性梯度凝膠電泳[4](denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)和溫度梯度凝膠電泳[5](temperature gradient gel electrophoresis,TTGE)，使一些厭氧細菌能夠在RNA水平上被檢測，但研究技術的局限使獲

得的信息量少且不夠深入。近年來，高通量測序技術因其準確性高、快速和信息量大等優點，被廣泛的應用于人[6]、林麝[7]、兔子[8]等的微生物研究中。但是，利用高通量測序技術對健康雞回腸微生物進行研究，在國內鮮有報道。本試驗通過Illumina MiSeq平臺進行Paired-end測序，快速、全面地測定健康雞回腸微生物并通過KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)數據庫進行PICRUSt(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)基因預測，揭示腸道菌群在回腸中的作用，為進一步研究雞回腸微生物的結構與其在腸道中的功能提供參考依據。

1　材料與方法

1.1試驗動物與飼養管理

選取15只同日孵化的1日齡健康科寶500肉雞(購于成都溫江正大有限公司)，飼養21 d。飼養條件為24 h光照，自由采食和飲水，試驗飼糧由玉米(51.64%)、豆粕(39.60%)、菜籽油(4.30%)、磷酸氫鈣(1.85%)、碳酸鈣(1.30%)、DL-蛋氨酸(0.20%)、食鹽(0.40%)、膽堿(0.18%)、多維(0.03%)和微量元素預混料(0.50%)組成，每天觀察雞群的采食、飲水與健康情況。

1.2樣品采集

1.3細菌總DNA的提取

取雞回腸內容物樣品(100±10) mg，用OmegaD40-15糞樣試劑盒，按操作手冊要求提取總DNA，存放于-30 ℃冰箱中備用。

1.4基于16S rRNA的V4區細菌樣品檢測、文庫建立及上機測序

DNA樣品送至中國科學院成都生物研究所檢驗、測序，利用Illumina MiSeq平臺進行Paired-end測序，對樣品16S rRNA的V4區建立文庫并上機測序。具體操作如下：選擇16S rDNA的V4區作為目的擴增區域，用引物對515F/806R目的片段進行擴增。根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。對目的條帶使用E.Z.N.A.TM公司的Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒切膠回收。用純化后的樣品基于Illumina MiSeq平臺Paired-end測序技術建立文庫，并進行測序。

1.5數據分析

測序數據利用FastQC軟件評價測序的數量和質量，通過perl腳本去除連續低于20的堿基以及順序掉轉的reads，在Mothur 1.31.2中將處理后的數據合并成一條一條完整的目的片段；利用Usearch 7.0.1001去掉純化后數據的嵌合體[9]，利用Qiime 1.8.0合并去掉嵌合體的數據，并將數據按照uclust算法將序列相似性≥97%的操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，進行OTUs聚類[10]，同時去掉序列數少的OTUs(OTUs中序列數<2)。

按照慣例，中國與BPC之間的大貿合同談判價格，對于中國市場及中國與其他國際供應商之間的談判價格，具有引領作用。目前，正值市場變化關鍵期，國際鉀肥市場形勢和大合同談判價格備受關注。日前，在2018鉀鹽鉀肥大會上，白俄羅斯鉀肥公司首席代表基里爾·辛克維奇坦誠地接受了中國農資傳媒記者獨家采訪。

通過Qiime 1.8.0對每個樣品進行物種分類，并統計信息[11]?；跇悠稯TUs數量與測試的深度變化的關系，通過不同生物信息學算法計算alpha多樣性(樣品內部的生物多樣性)，并繪畫稀釋曲線。進行物種注釋和核心菌群分析，統計各水平信息，按照樣品規定最低比例與OTUs數目之間的關系制作核心菌群數量變化曲線圖，通過軟件制作門水平所有樣品共同含有的核心菌門百分含量熱圖，在屬水平制作所有樣品共同含有的核心菌屬柱狀圖。通過KEGG數據庫進行PICRUSt基因預測，利用軟件R 3.1.1根據數量排列前20的預測結果制作基因預測熱圖。通過SPSS 19.0進行標準誤計算。

2　結果與分析

2.1各樣品序列及OTUs信息

本研究基于Illumina高通量測序技術對15只健康雞的回腸內容物菌群V4區進行測序，按照97%的相似度對OTUs進行歸類，去除序列數量少的OTUs(OTUs中序列數<2)后，共獲得424 062條tags，被歸類于1 002個OTUs，樣品平均tags為(28 271±8 855)條，平均OTUs為(261±82)個。其中，tags數量最高的是樣品H7，最低的是H8，相差35 100條tags。OTUs含量最高的是H1，最低的是H8，相差328個OTUs。

2.2Alpha多樣性分析

采用alpha多樣性指數對各樣品的豐富度和多樣性進行比較。從圖1可以看出，物種觀察指數稀釋曲線隨著測試深度的不斷加深逐漸增加，但沒有達到飽和，說明雖然大多數菌群被覆蓋，但仍有少量細菌未被測出。Alpha多樣性指數分析結果(表1)表明，樣品H1的物種豐富度和多樣性相對較高。

2.3物種注釋

在門水平和屬水平對樣品進行物種注釋分析。15個樣品共獲得20個菌門，160個菌屬。樣品中微生物主要為細菌，占所有微生物的99.54%，其余為古生菌和未被歸類的微生物。

門水平含量大于0.1%有5個菌門，分別為：厚壁菌門(Firmicutes)，平均含量為89.83%；變形菌門(Proteobacteria)，平均含量為6.28%；藍細菌門(Cyanobacteria)，平均含量為2.16%；擬桿菌門(Bacteroidetes)，平均含量為1.08%；放線菌門(Actinobacteria)，平均含量為0.16%。

圖1　觀察指數稀釋曲線

項目Items樣品編號SamplenumberH1H2H3H4H5H6H7H8H9H10H11H12H13H14H15標準誤StandarderrorACE656.06558.81474.92420.47339.53551.91312.78244.45505.48427.40377.50542.01389.04467.70602.1429.52Shan-non3.933.452.832.692.303.820.812.362.562.632.562.632.802.483.210.19Simpson0.820.830.730.740.630.860.200.610.700.740.750.670.580.620.800.04

屬水平含量大于1%的菌屬共有8個，乳桿菌屬(Lactobacillus)平均含量為76.77%，鏈球菌屬(Streptococcus)平均含量為2.29%，乳酸乳球菌(Lactococcus)平均含量為2.14%，腸球菌屬(Enterococcus)平均含量為1.36%，Solibacillus平均含量為1.07%。其余3種在屬水平未被命名，分別歸屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)(平均含量為5.22%)、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)(平均含量為2.83%)、Streptophyta(平均含量為2.15%)。

2.4核心菌群分析

核心菌群是基于OTUs通過Qiime 1.8.0軟件篩選、統計，獲得存在于樣品規定最低百分含量中所含的OTUs，然后按照各分類水品進行分類。表2為樣品規定最低比例與OTUs數目之間的關系表。從表中可以看出，隨著樣品規定最低比例的增加，共同OTUs的數目呈階梯形減少。當樣品規定最低百分含量為50%時，共含有146個OTUs。規定最低百分含量為100%時，OTUs為30個。

表2　最低百分含量與OTUs數目之間的關系

在門水平上，共享核心菌門共有4個，按含量從高到底分別為：厚壁菌門(Firmicutes)，平均含量為85.35%；變形菌門(Proteobacteria)，平均含量為6.09%；藍細菌門(Cyanobacteria)，平均含量為2.15%；放線菌門(Actinobacteria)，平均含量為0.16%。通過表3可以看出，除樣品H13中的厚壁菌門、變形菌門和樣品H11中厚壁菌門外，樣品在門水平的差異性較小。

表3　共享核心菌門百分含量

在屬水平上，共享核心菌屬共有19個，分別為乳桿菌屬(Lactobacillus)平均含量為76.77%，鏈球菌屬(Streptococcus)平均含量為2.29%，乳酸乳球菌(Lactococcus)平均含量為2.14%，腸球菌屬(Enterococcus)平均含量為1.36%，Solibacillus屬平均含量為1.07%，芽孢桿菌屬(Bacillus)平均含量為0.96%，假單孢菌屬(Pseudomonas)平均含量為0.33%，桿菌屬(Lysinibacillus)平均含量為0.10%，Ewingella屬平均含量為0.05%，Brochothrix屬平均含量為0.04%，明串珠菌屬(Leuconostoc)平均含量為0.04%，Enhydrobacter屬平均含量為0.03%，其余7種細菌在屬水平未被分類，其總共占樣品微生物的含量為8.57%。共享核心菌屬占樣品總微生物的93.75%。共享核心菌屬物種注釋柱狀圖(圖2)表明，雖然這些菌屬是各樣品共同含有，但其百分含量在各樣品中差異較大，其中樣品H13與其他樣品差異最明顯。

圖2　核心菌屬柱狀圖

2.5PICRUSt基因預測

PICRUSt是通過微生物群落的豐富度與數據庫比，從而在不可觀測的情況下推測出生物群落的功能信息。結果獲得328個預測的功能，數量前20的功能分別為轉運因子、一般功能預測、ABC轉運體、DNA修復和重組蛋白、核糖體、嘌呤代謝、蛋白酶、嘧啶代謝、轉錄因子、染色體、氨基糖和核苷酸糖代謝、未知功能、雙組分系統、核糖體生物合成、糖酵解/糖異生、其他離子偶聯轉運體、氨酰tRNA生物合成、磷酸轉移酶系統、DNA復制蛋白和分泌系統。PICRUSt基因預測熱圖(圖3)結果表明，各樣品的效能存在一定差異。

圖3　PICRUSt基因預測聚類熱圖

3　討　論

本試驗通過16S rRNA V4區基因擴增子技術，在Illumina Miseq測序平臺上對健康雞的回腸菌群進行高通量測序。與以往的腸道微生物檢驗方法相比，高通量測序具有檢測數據完整性好、測量快速、測定信息量大等優點[12-13]。

15只健康雞回腸微生物的種類和數量不完全相同，可能由個體身體狀況、飲食量等試驗樣品本身差異造成。Alpha稀釋曲線是否達到平臺期，可以反映測試樣品是否達到了測試深度，即樣品測試是否足以覆蓋所有微生物，通過alpha稀釋曲線可以看出高通量測序并沒有完全覆蓋所有菌群，測試結果具有一定的隨機性。研究表明，腸道微生物的種類和數量與剛出生的環境有關，出生環境也可能是造成差異的原因[14]。即使嚴格控制飼養環境做重復試驗，雞的腸道微生物測試結果仍然會出現差異[15]。本次試驗重復數多達15個，且檢測結果覆蓋了大多數的菌種，所以本次試驗具有較好的代表性。

共享核心菌群與物種注釋相比，其歸類依據在物種分類水平上更高，所以在統計樣品微生物百分含量時更加準確，代表性更強。通過物種注釋可以看出，含量排在前五的門分別是厚壁菌門、變形菌門、藍細菌門、擬桿菌門和放線菌門，與Shaufi等[13]人的研究結果相似。共享核心菌群比較，除藍細菌門外，其他菌門都是共享核心菌門。從菌門百分含量可以看出，共享核心菌門中菌門百分含量小于物種注釋中的百分含量。以厚壁菌門為例，厚壁菌門是健康雞的回腸中含量最多的菌群。厚壁菌門在腸道或糞便中作為主要菌門在貓[16]、狗[17]、馬[18]等動物中也有報道。據報道，厚壁菌門與粗飼料的消化有關，雞作為以植物為主要食物禽類，厚壁菌門對其營養消化吸收有幫助作用。物種注釋中顯示厚壁菌門含量高達89.83%，核心菌群中顯示其含量為85.35%，兩者相差4.48%。造成差異的原因是物種注釋中歸于厚壁菌門的OTUs并非所有樣品都含有。由此可見，利用共享核心菌群分析百分含量其更準確，但受個體差異影響更大。通過共享核心菌門百分含量表可知，不同個體門水平微生物百分比差異較小。在屬水平上，物種注釋和共享核心菌屬在含量高的菌屬中差異不大，因為兩者歸類參照的物種分類水平更相似。但定量上看，物種注釋在屬水上顯示共含有160個屬，而共享核心菌屬僅有19個，造成差異的原因是樣品個體差異影響。但共同含有的核心菌屬在樣品微生物總量的93.75%，已經表現了樣品的大多數微生物。本次試驗測得到的共享核心菌種與周小娟等[19]研究北京油雞和艾拔益加肉雞回腸優勢菌種的結果存在差異，大腸埃希菌和糞鏈球菌并不是優勢菌種。造成差異的原因除飼養環境、肉雞品種和研究方法不同外，也可能是飼糧配方不同造成的差異。研究表明，飼糧的種類不僅對雞的健康和代謝有影響[20]，而且可以改變雞的腸道微生物[21-22]。從核心菌屬柱狀圖可以看出，樣品之間菌屬含量差異較大，此結果與Buffie等[23]、Gulino等[24]研究動物腸道菌群的結果相似。

腸道中微生物的對免疫功能、營養物質的吸收、甚至酶的代謝作用等有一定的影響[25]。研究表明，人類腸道中微生物異?？梢詫е逻^敏、肥胖和糖尿病等[25]。由此可見，腸道微生物對機體的生理功能有一定的影響。PICRUSt將不可視的微生物，通過與數據庫比對和生物功能聯系起來。PICRUSt基因預測表明，雞回腸微生物與分子和蛋白質的生成和代謝等基礎生命功能有關。PICRUSt基因預測熱圖顯示，相同功能各樣品間熱圖顏色有變化，說明各樣品雖然都具有相同的功能，但是由于每個樣品中所含微生物的種類和數量有區別，所以各樣品的效能存在差異。這與測定樣品tags和OTUs的結果吻合。

4　結　論

① 15只健康雞回腸共獲得424 062條tags和1 002個非單OTUs，樣品平均tags為(28 271±8 855)條，平均OTUs為(261±82)個。

② 通過物種注釋和核心菌群比較可知，兩者在種類和含量上存在差異。

③ 樣品個體間菌群百分含量在門水平差異不大，但在屬水平存在一定差異。

④ 各樣品的效能差異，可能與樣品菌群含量和種類有關。

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*Contributed equally

(責任編輯田艷明)

s: NI Xueqin, professor, E-mail: xueqinni@foxmail.com; ZENG Dong, professor, E-mail: zend@sicau.edu.cn

Analyzing of Ileum Microbial Diversity of Chickens by High-Throughput Sequencing and PICRUSt Predicted

XU ShuaiLIN Yicen*ZHOU MengjiaNI Xueqin**ZENG Dong**ZENG Yan

(Animal Microecology Institute, College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130, China)

The aim of this study was to analyze the composition and function of ileum microbial community of healthy chickens. The samples of ileum contents of 15 chickens were investigated by high-throughput sequencing. Operational taxonomic units (OTUs) were picked with a 97% similarity threshold and the sequences less than two in all samples were removed. Than the results were analyzed by bioinformation software and PICRUSt functional profiles. The results showed as follows: 1) a total of 424 062 tags were assigned to 1 002 non-singleton OTUs from all samples. Each sample had (28 271±8 855) tags and (261±82) OTUs on average. 2) In total, 20 phyla and 160 genera were detected, and 4 shared core phyla were contained in all samples. They were Firmicutes (85.35%), Proteobacteria (6.09%), Cyanobacteria (2.15%) and Actinobacteria (0.16%). Nineteen shared core genera were contained in all samples, which consisted 93.75% of the overall bacteria community. 3) Three hundred and twenty-eight functions were detected in all ileum samples. Heat-map of the first 20 functions showed that there were some differences in efficiency of each sample. Therefore, our research reveals that the chicken ileum is complex for the phylogenetic diversity of the microbial communities, but the main microbial communities are relatively stable. The findings of this study will provide basic information and lay the foundation of the research in composition and function of the microbiota of chicken ileum.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(8)：2581-2588]

chicken; ileum; high-throughput sequencing; core-microbiome; PICRUSt

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.08.031

2016-03-01

四川省科技廳國際合作項目(2013HH0055)

徐帥(1992—)，男，遼寧營口人，碩士研究生，從事動物微生態研究。E-mail: elixuone@foxmail.com

S811.6

A

1006-267X(2016)08-2581-08

*同等貢獻作者

**通信作者：倪學勤，教授，博士生導師，E-mail： xueqinni@foxmail.com；曾東，教授，博士生導師，E-mail: zend@sicau.edu.cn