產γ-氨基丁酸屎腸球菌的篩選及γ-氨基丁酸的定量

朱　泉　程金龍　朱元召　尹　龍　倪晉東　程茂基　楊章平

(1.安徽農業大學動物科技學院，合肥230061；2.江蘇優仕生物科技發展有限公司，宿遷223831；3.安徽科技學院動物科學學院，鳳陽233100；4.揚州大學動物科學與技術學院，揚州225009)

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產γ-氨基丁酸屎腸球菌的篩選及γ-氨基丁酸的定量

朱泉1程金龍2朱元召3*尹龍2倪晉東2程茂基1楊章平4

(1.安徽農業大學動物科技學院，合肥230061；2.江蘇優仕生物科技發展有限公司，宿遷223831；3.安徽科技學院動物科學學院，鳳陽233100；4.揚州大學動物科學與技術學院，揚州225009)

本試驗旨在利用分子生物學方法鑒定分離得到1株產γ-氨基丁酸(GABA)屎腸球菌，并定量測定所產GABA的量。從泡菜、酸奶、土壤、新鮮牛奶樣品中篩選出一目標菌株F6，進行形態學特征與革蘭氏染色鑒定；再擴增菌株F6的16S rDNA基因，然后測定該基因序列和構建系統發育樹；同時采用高效液相色譜(HPLC)法定量測定菌株F6發酵液中的GABA含量。結果表明：菌株F6菌落大而光滑、圓形、直徑1～2 mm、邊緣整齊、乳白色；在分離培養基上菌落周圍形成透明圈，使分離培養基呈黃色；在MRS固體培養基上菌落不透明，周圍有透明圈。革蘭氏染色鑒定菌株F6為陽性菌。分子生物學鑒定分析顯示，菌株F6的16S rDNA基因序列與GenBank數據庫中屎腸球菌(Enterococcusfaecium)的相似性大于99%。HPLC法測定得到GABA標準曲線線性方程為Y=7 080 733.139 5X-4 511.692 7(R2=0.999 4)，通過方程得出菌株F6發酵液中的GABA含量為7.1 g/L，保留時間為7～10 min。結果提示，本試驗篩選得到1株高產GABA的屎腸球菌F6。

屎腸球菌；γ-氨基丁酸；16S rDNA基因序列；高效液相色譜法定量；篩選

乳酸菌具有調節機體胃腸道微生態平衡、有益于畜禽健康、改善畜禽生產性能、減少環境污染、替代飼用抗生素等重要作用，在動物生產中的應用日益廣泛。然而，乳酸桿菌為厭氧菌，抗逆性差、不耐氧、易失活，應用效果不穩定，而球菌較桿菌具有更強的抗逆性，菌株活性損失較低，未來球菌尤其是腸球菌的應用將更普遍。

γ-氨基丁酸(GABA)又稱氨酪酸[1]，分子式為C4H9NO2，是哺乳動物中樞神經系統一種主要的抑制性神經遞質，介導40%以上的抑制性神經傳導[2-3]。GABA對人具有調節血壓、改善腦部機能、增強記憶力、抗焦慮、鎮痛等生理活性，對畜禽具有促進采食、抗應激、鎮靜、改善生產性能等功效[4]，尤其是抗熱應激作用顯著。GABA合成制備的方法主要有化學合成、微生物發酵等，目前畜禽生產上應用的GABA多為化學合成提純品，成本昂貴，頗少見應用微生物發酵產生的GABA[5]。

長期以來，學者致力于研究乳酸菌等單一功能的微生態制劑與化學合成提純的GABA，已清楚乳酸菌和GABA均是重要的功能性添加劑[6]。但有關能分泌GABA的乳酸菌的研究較少。屎腸球菌(Enterococcusfaecium)屬腸球菌屬，又稱屎鏈球菌，可分成許多群，屎腸球菌屬于D群，D群鏈球菌中的腸球菌包括糞腸球菌、屎腸球菌和堅忍腸球菌。自然界存在的腸球菌所能分泌的GABA量很少或不能分泌，需要摸索適宜生長條件以提高其GABA產量，目前對產GABA屎腸球菌的研究頗少。為此，本試驗開展高產GABA屎腸球菌的篩選與鑒定，既能應用綠色微生態和微生物發酵所產天然GABA，降低GABA添加成本，又能疊加發揮GABA抗應激與乳酸菌微生態平衡調控的雙重功效，旨在為開發功能性微生態制劑及其在養殖中的應用提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1菌株及培養基

菌株來自泡菜(購自農貿市場)、酸奶(蚌埠市雙華乳品有限公司產品)、土壤(取自安徽科技學院西校區)、新鮮牛奶(購自安徽科技學校畜牧科技園)。

MRS固體培養基制備[7]：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖20 g、三水合醋酸鈉5 g、檸檬酸二胺2 g、吐溫80.1 g、磷酸氫二鉀2 g、七水硫酸鎂0.58 g、四水硫酸錳0.25 g、碳酸鈣7.5 g、瓊脂22.5 g，用去離子水定容至1 000 mL，pH 6.5，121 ℃滅菌40 min。

MRS液體培養基：除不含碳酸鈣、瓊脂外，其他成分與MRS固體培養基相同，再用蒸餾水定容至1 000 mL，pH 6.5。

分離培養基：牛肉膏10 g、酵母膏10 g、蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、吐溫80.5 g、番茄汁200 g、溴甲酚綠0.1 g、碳酸鈣20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 6.5。

1.2目的菌株的分離、純培養與活化傳代

取泡菜、酸奶、土壤、新鮮牛奶樣品各1 g，分別接種于裝有MRS液體培養基的150 mL三角燒瓶中，35 ℃靜止培養48 h；無菌操作將培養液接種于分離培養基中，35 ℃條件下靜止培養48 h；無菌操作挑取分離培養基中周圍呈現黃色的疑似單個菌落，接種于MRS液體培養基中，37 ℃靜止培養48 h。

取1 mL MRS液體培養液與無菌生理鹽水10倍梯度稀釋成10-6、10-7、10-83個濃度梯度，取100 μL 10-8濃度梯度溶液均勻涂布MRS固體培養基平板，37 ℃培養48 h。無菌操作挑取出現圓形乳白色并有溶鈣圈的單個菌落，進行分離純化。

將所篩菌株接種于MRS斜面培養基上，35 ℃培養48 h，4 ℃保存，菌株每20 d傳代1次。將保藏菌株接種于MRS固體培養基中，35 ℃培養48 h，再轉接至MRS液體培養基中培養22 h用作發酵種子菌株。

1.3目的菌株的革蘭氏染色鑒定

對目的菌株進行革蘭氏染色，觀察菌株的形態特征。

1.4目的菌株的分子生物學鑒定

取10 mL菌株培養液，低速離心獲得菌體。用細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302，上海生工生物工程有限公司)提取細菌總DNA。以10 ng純化的細菌總DNA作為模板，擴增16S rDNA基因。所用引物為原核生物16S rDNA基因的通用引物：上游引物為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物為5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴增體系為50 μL，包括：1.0 μL DNA模板，5.0 μL 10×Buffer，2.0 μL dNTP，1.0 μL上游引物(10 pmol/μL)，1.0 μL下游引物(10 pmol/μL)，1.0 μL Taq DNA聚合酶，1.4 μL Mg2+，補重蒸水(ddH2O)至50 μL。擴增條件：94 ℃，5 min；94 ℃，1 min，56 ℃，1 min，72 ℃，2 min，30個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃終止反應。PCR產物全序列由上海生工生物工程有限公司測定。

1.5序列分析及系統發育樹的構建

根據16S rDNA基因測序結果，使用核算序列對比檢索(nucleotide basic local alignment search tool，N-BLAST)比對初步確定菌種。結合GenBank中乳酸菌屬(Lactobacillus)中其他菌種的16S rDNA基因序列，利用MEGA 3.0軟件繪制系統發育樹。

1.6目的菌株所產GABA的定性測定

將上述所得種子液以3.5%接種量無菌操作接種于發酵培養基中，37 ℃恒溫培養48 h，取發酵液5 mL，4 500 r/min離心5 min，取上清采用改良紙層析法檢測發酵液中是否含有GABA。改良紙層析的測定方法是：按0.55%的比例將顯色劑茚三酮加入展開劑中，展開劑組成為正丁醇∶冰醋酸∶水=5∶3∶1(體積比)，取待測液10 μL進行點樣，GABA配成濃度5 g/L做參比，展開后85 ℃顯色8 min。若紙層析反應體系中存在與GABA標準品相對遷移率一致的茚三酮顯色斑點，說明樣品中含有GABA，則該菌即為篩選到的產GABA的菌株，將篩選得到的產GABA目的菌株進行保藏。

1.7目的菌株所產GABA的定量測定

高效液相色譜(HPLC)法定量測定菌液中GABA含量的原理：在菌液中加β-巰基乙醇，使GABA與鄰苯二甲醛迅速反應，生成鄰苯二甲醛(OPA)衍生物；在紫外區338 nm處，根據OPA衍生物的吸收峰，通過測定其吸光度值精確測定樣品中的GABA含量。

GABA標準溶液的配制：用電子天平準確稱量GABA標準品，配制濃度分別為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的標準GABA溶液。

HPLC檢測條件如下：儀器型號為Waters-1525；色譜柱為Hypersil ODS-2 C18(150 mm×4.0 mm，5 μm及相應的保護柱)；檢測器為紫外檢測器；進樣量為20 μL；流動相A為20 mmol/L醋酸鈉緩沖液(醋酸鈉2.72 g、三乙胺200 μL，加超純水至1 L，調節pH為7.3)，0.22 μm濾膜過濾，脫氣；流動相B為乙腈，流動相A∶流動相B=4∶1；流速為1 mL/min；柱溫為40 ℃；衍生試劑為OPA 20 mg，加β-巰基乙醇20 μL、乙腈5 mL混勻即可。衍生反應：取硼酸緩沖液100 μL(硼酸24.7 g，加超純水1 L，調節pH至10.4)，OPA衍生劑20 μL，樣品20 μL，混合均勻后室溫反應5 min后開始測定。

2　結果與分析

2.1目的菌株的菌落特征

從泡菜、酸奶、土壤、新鮮牛奶中分離得到多個菌株，選取其中的1個菌株F6進行形態學觀察鑒定。菌株F6菌落光滑、圓形、直徑1～2 mm、邊緣整齊、乳白色，表面細膩(圖1)。在分離培養基上培養生長的F6菌落使其周邊的培養基變成黃色，菌落周圍形成透明圈(圖1-A)，這是由于乳酸菌生長過程中產生乳酸，能使含有溴甲酚綠的分離培養基變成黃色，推測F6是一株乳酸菌。在MRS固體培養基上培養生長的F6菌落不透明，周圍有透明圈(圖1-B)。

圖1　菌株F6的菌落形態

2.2目的菌株所產GABA的定性測定

改良紙層析法分析結果顯示，目的株菌F6具有與GABA標準品相同Rf值(即指比移值，斑點中心距原點的距離與溶劑展開前沿距原點距離的比值)的斑點，層析斑點較深，表明GABA產量較高，圖2為目的株菌的改良紙層析圖譜。

2.3目的菌株的形態特征

菌株F6的染色結果如圖3所示，菌體形態呈圓或橢圓形，直徑0.5～1.0 μm，大多數呈雙或短鏈狀排列，通常不運動，革蘭氏染色呈陽性。

圖2　菌株F6的發酵液改良紙層析圖譜

圖3　菌株F6的顯微結構圖

2.416S rDNA基因序列分析與系統發育樹構建

菌株F6的16S rDNA基因測序后，提交到DNA序列數據庫GenBank。將測得的菌株F6的16S rDNA序列在美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)主頁上進行N-BLAST分析比對，結果如圖4所示。菌株F6的16S rDNA基因序列與GenBank數據庫中屎腸球菌的相似性大于99%，表明兩者均為屎腸球菌的不同菌株。

圖4　菌株F6的16S rDNA基因序列

菌株F6的16S rDNA基因序列與NCBI主頁GenBank數據庫中部分細菌的16S rDNA基因序列進行同源性比對，為顯示菌株F6與相似菌種之間的親緣關系及其系統地位，用MEGA 3.0軟件構建系統發育樹(圖5)。結果顯示，菌株F6與屎腸球菌的親緣關系最近，其次是堅忍腸球菌。由此確定菌株F6為屎腸球菌。

2.5目的菌株所產GABA的定量測定

2.5.1標準曲線繪制

采用HPLC法精確測定標準液中GABA含量[8-9]，GABA標準液中的GABA峰形如圖6所示。以峰面積對GABA含量作圖，準確繪制出標準曲線(圖7)。結果顯示，峰面積和GABA含量呈強相關的線性關系，線性方程為：Y=7 080 733.139 5X-4 511.692 7(R2=0.999 4)。

Bacillussp.：芽孢桿菌；Enterococcusfaecium：屎腸球菌；Bacterium：細菌；Enterococcusdurans：堅忍腸球菌；Leuconostocmesenteroides: 腸系膜明串珠菌；strain：品種。

圖5以菌株F6的16S rDNA基因序列為基礎的系統發育樹

Fig.5Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of bacterial strain F6

圖6　標準液中GABA的HPLC檢測圖

圖7　HPLC法建立的GABA的標準曲線

2.5.2目的菌株所產GABA的定量

采用HPLC法精確測定菌株F6發酵液的色譜圖峰面積，如圖8所示。根據上述得到的線性方程Y=7 080 733.139 5X-4 511.692 7，計算出菌株F6發酵液中GABA含量為7.1 g/L，保留時間為7～10 min，峰面積為50 268 693.6，吸光度值為0.12。

3　討　論

3.1產GABA屎腸球菌的篩選

從酸奶、土壤、牛奶、泡菜中均分離得到產GABA的菌株，其中自酸奶樣品中篩選得到的一菌株產GABA量相對較高，命名F6，表明從自然界中篩選高產GABA目的菌株是可行的。本試驗在對目的菌株傳統表型特征、生物學特性等進行快速篩選的基礎上，采用改良紙層析法對目的菌株代謝產物GABA進行定性檢測，準確、快速確定了菌株產GABA的能力。改良后紙層析法為按0.55%的比例將顯色劑茚三酮加入展開劑中，展開劑組成為正丁醇∶冰醋酸∶水=5∶3∶1(體積比)，展開后85 ℃顯色8 min，相比一般紙層析法顯色時間15～20 min有明顯優勢[10]，對快速篩選高產GABA目的菌株有一定參考價值。本試驗通過分子生物學方法，將菌株F6的16S rDNA基因序列與GenBank數據庫中部分細菌的16S rDNA基因序列進行同源性比對，其與屎腸球菌的相似性大于99%，確定目的菌株F6為屎腸球菌，這為通過基因工程菌大量制備GABA提供了目的菌株。

圖8　菌株F6發酵液中GABA的HPLC檢測圖

3.2GABA的制備方法

GABA的制備方法有化學合成法和生物合成法2種[10]?；瘜W合成法成本較高，得率較低，并且在生產工藝中使用危險溶劑，甚至是有毒溶劑，因此化學合成法制備的GABA不能用于食品和飼料，也不能認為是一種天然的食品或飼料添加劑[11-12]。生物合成GABA是應用純的微生物技術，通過篩選優良高產的安全菌種發酵生產得到，是天然食品與飼料添加劑，公認使用的安全菌為乳酸菌，如短小乳桿菌[10]，而篩選的產GABA屎腸球菌頗少。生物合成法獲得的GABA雖然純度不高，但動物的吸收率比高純度化學合成法的GABA有較大提高，并且產GABA乳酸菌可不經提純,直接添加到動物飼糧中。本試驗以屎腸球菌為目標菌株，較乳酸桿菌的抗逆性更強，因此可發揮乳酸菌的微生態平衡調控和GABA抗應激的雙重作用，功效疊加。

3.3乳酸菌的GABA產量

自然界中直接篩選的乳酸菌合成GABA產量一般都不高，為5～7 g/L[13-14]，所用菌株多為乳酸桿菌類。馮志彬等[15]研究短小乳桿菌A8菌株后發現，初始pH 4.5、溫度33 ℃、接種量20%、發酵時間3 d為該菌株的最佳發酵條件，GABA產量最高可達19.2 g/L，并發現培養基的pH是影響GABA產量的主要因素。本試驗目的菌株為屎腸球菌，發酵液中GABA含量為7.1 g/L；最佳發酵條件為發酵溫度36 ℃、原始pH 6.4、接種量4.5%、種齡20～23 h、發酵時間60 h，在最佳培養、發酵條件下，屎腸球菌F6發酵液中GABA的含量可提高到9.5 g/L，這可能與不同培養條件影響目的菌株谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)的活性有關。

利用傳統誘變技術篩選能夠提高乳酸菌的GABA產量。夏江等[16]先后使用紫外線和γ-射線對產GABA的短乳桿菌進行誘變處理，使GABA平均產量提高142.9%，經誘變處理的短乳桿菌雖然GABA產量提高，但乳酸菌的固有功能作用降低，并且因不確定性、盲目性和遺傳不穩定性，利用誘變乳酸菌所產GABA尚有潛在安全風險。

近幾年，有文獻報道利用重組大腸桿菌表達提取GAD，以固定化酶的方式生產GABA，但是轉化效率普遍不高[17]。已清楚GABA的生物合成途徑是谷氨酸脫羧酶將L-谷氨酸轉化為GABA。本后續試驗擬通過增加現有菌株F6中GAD基因表達盒的數量，提高菌株細胞內GAD的表達，進而提高GABA的合成量[18-20]，這尚在研究中。

3.4屎腸球菌所產GABA的定量測定

本試驗首先對發酵液中GABA進行定性測定，即采用改良紙層析法檢測發酵液中是否含有GABA。按0.55%的比例將顯色劑茚三酮加入到展開劑中，展開后85 ℃顯色8 min，通過觀察斑點快速定性確定GABA的存在。

本試驗采用HPLC法測定發酵液中GABA的含量，GABA在β-巰基乙醇存在條件下能與鄰苯二甲醛迅速反應，生成OPA衍生物，而OPA不會干擾檢測，色譜圖基線較穩定，標準曲線的R2為0.999 4，因此本試驗采用的HPLC法簡單、快速、靈敏，得到的結果可靠。

4　結　論

本試驗篩選得到的菌株F6為屎腸球菌，是一株功能性乳酸菌，具有高產GABA的能力。

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(責任編輯菅景穎)

, professor, E-mail: zhuyuanzhao111@163.com.cn

Screening ofEnterococcusfaeciumProducing γ-Amminobutyric Acid and Quantitative Detection of γ-Amminobutyric Acid

ZHU Quan1CHENG Jinlong2ZHU Yuanzhao3*YIN Long2NI Jindong2CHENG Maoji1YANG Zhangping4

(1. College of Animal Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230061, China; 2. Jiangsu Unison Biotechnology Development Co., Ltd., Suqian 223831, China; 3. College of Animal Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China ; 4. College of Animal Science and Technology,Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

This study was aimed to isolate and identify anEnterococcusfaeciumby molecular biological methods which produced γ-aminobutyric acid (GABA), moreover, the amount of GABA was also quantitatively determined. One target strain ofEnterococcusfaeciumF6 was screened out from the samples of pickles, yogurt, soil and fresh milk, and was identified according the morphological characters and Gram stain methods. After the 16S rDNA gene of bacterial strain F6 was amplified, the gene sequence and phylogenetic tree were analyzed. Meanwhile, the GABA content in the fermented solution of bacterial strain F6 was quantitatively determined by high performance liquid chromatography (HPLC) method. The results showed that the bacterial strain F6 took a large, smooth, round and a neat edge of shape with a diameter of 1 to 2 mm and in a milky white color. A transparent circle was formed around the colony on the separating medium which changed to be yellow. On the MRS solid medium, the colony was opaque with a transparent circle around. Gram stain was used to identify F6 as a positive strain. The 16S rDNA gene sequence of bacterial strain F6 was more than 99% similarity to that ofEnterococcusfaeciumin GenBank showed by molecular biological analysis. HPLC method was used to draw out the GABA standard curve linear equation as follows:Y=7 080 733.139 5X-4 511.692 7 (R2=0.999 4), and the content of 7.1 g/L of GABA with 7 to 10 minutes of retention time was determined in the fermented solution of F6 according to linear equation. The results indicate that a high yield GABA ofEnterococcusfaeciumF6 is finally obtained.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(8)：2504-2511]

Enterococcusfaecium; γ-aminobutyric acid; 16S rDNA sequence; quantitative detection by high performance liquid chromatography method; screening

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.08.022

2016-02-24

安徽高校自然科學研究項目計劃(KJ2015A247)；宿遷市農業科技支撐項目(L201405)；宿遷市產業發展引導資金項目(M201512)

朱泉(1994—)，男，安徽全椒人，碩士研究生，從事動物營養與飼料科學研究。E-mail: zhudtq@163.com

朱元召，教授，碩士生導師，E-mail: zhuyuanzhao111@163.com

S816.7

A

1006-267X(2016)08-2504-08