中華絨螯蟹和克氏原螯蝦細菌性敗血癥病原學研究

姜光明，錢彩源，顧雪林，魏賓，徐樂，宋學宏（.蘇州市吳中區水產技術推廣站，江蘇　蘇州　58；.蘇州大學基礎醫學與生物科學學院，江蘇　蘇州　53）

中華絨螯蟹和克氏原螯蝦細菌性敗血癥病原學研究

姜光明1，錢彩源1，顧雪林1，魏賓1，徐樂2，宋學宏2
（1.蘇州市吳中區水產技術推廣站，江蘇蘇州215128；2.蘇州大學基礎醫學與生物科學學院，江蘇蘇州215123）

從一中華絨螯蟹和克氏原螯蝦混養池的自然發生敗血癥的個體中分離到2株細菌，對其生物學性狀、致病性及藥物敏感性進行分析，旨在明確分離菌的種類、病原學意義及耐藥特征。從發病蟹和蝦的血液中分離細菌并獲純培養，通過對純培養菌的形態特征、理化特性、16S rRNA基因序列測定及系統發育學分析，鑒定菌種。以不同濃度的分離菌懸液感染健康蟹和蝦，測定其致病性；用瓊脂擴散法和稀釋法測定分離菌株對9種常用抗菌類藥物的敏感性。分離出純培養的2株菌分別鑒定為維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）和弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）；2株菌均具有較強致病性，對氟苯尼考、鹽酸環丙沙星、乳酸諾氟沙星、鹽酸諾氟沙星等4種抗生素敏感。

中華絨螯蟹；克氏原螯蝦；細菌性敗血癥；維氏氣單胞菌；弗氏檸檬酸桿菌；藥物敏感性

doi：10.3969/j.issn.1004-2091.2016.04.010

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱河蟹，克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）俗稱小龍蝦，均屬甲殼動物，為水產養殖的名貴品種，也是江蘇省十大主推養殖品種。相比于產量在750 kg/667 m2以上的魚類養殖而言，河蟹與小龍蝦的養殖屬于低密度養殖，而且近年來不少地方實行蝦蟹混養的生態養殖模式，絕大多數池塘的承載量不高于150 kg/667 m2，但隨著養殖年限的增加，養殖水源的污染日趨嚴重，導致蝦蟹免疫力持續下降，而水體條件致病菌毒力上升、致病力增強，因而引發蝦蟹細菌性傳染病，養殖者常采用內服抗生素與外潑消毒劑，以及微生態制劑調節水質相結合的方法預防與治療此類疾病，但防治效果越來越不穩定，給養殖生產帶來嚴重的經濟損失。

在蘇州某養殖區域，養殖者采取中華絨螯蟹和克氏原螯蝦混養模式，近年來養殖綜合效益較好。但從2013年以來，作者在病害調查工作中發現，該地區從6月下旬開始，克氏原螯蝦有部分死亡，至7月中旬中華絨螯蟹也出現死亡。該病發病率達30%以上，發病池的蝦、蟹病死率達30%～50%，采用內服氟喹諾酮類抗生素及外潑氯制劑的方法治療，其效果在2013年還較明顯，但至2015年治愈率較低。鑒于這一現狀，作者對該病的病原生物進行了分離調查，旨在明確該病的病原及其耐藥情況，為該病的有效防治提供技術支撐。

1　材料與方法

1.1材料來源

病蝦、蟹采集于蘇州吳中區東山某養殖池塘，健康蝦、蟹購于吳中區臨湖某養殖場，中華絨螯蟹體質量23～25 g，克氏原螯蝦體質量14～16 g。健康蝦、蟹放在60 cm×40 cm×40 cm室內水族箱中馴養1周，水深保持20 cm左右。馴養期間投喂2%的商品飼料，每天換1/4的水、氣泵增氧，水溫保持（28± 1）℃。馴養結束后，取活動正常的蝦、蟹進行試驗。

1.2細菌分離及菌懸液的制備

取發病蝦、蟹各5只，用酒精棉消毒發病蝦蟹體表，無菌取血0.1 mL，涂布RS瓊脂平板，37℃培養10～14 h，觀察菌落形態。再用接種環挑取兩株優勢菌落的單個菌落（菌落數分別約占68%和32%），劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37℃純培養18～24 h，分別加終濃度為30%的甘油，-20℃保存用于進一步鑒定。分離的優勢菌株編號分別為AH3和CF，將AH3和CF菌株分別接于新鮮營養瓊脂斜面，經28℃恒溫培養18～20 h，用0.70%的無菌生理鹽水洗下菌苔，制成菌懸液濃度為5.0×108 CFU/mL備用。

1.3人工感染試驗

取上述分離的2株代表菌，移接于普通營養肉湯管28℃培養18 h后，分別用0.70%的無菌生理鹽水稀釋成含量為5.0×107、5.0×106、5.0×105、5.0× 104、5.0×103CFU/mL的菌懸液，分別注入中華絨螯蟹和克氏原螯蝦的第3步足基部關節軟膜處，劑量為0.1mL/只，每個濃度組蟹和蝦各10只，對照組分別于同一部位注射0.70%的無菌生理鹽水。接種后隔離養殖于水族箱中，于25～28℃水溫下飼養，不喂食，不換水，連續觀察4 d。并對人工感染后發病的中華絨螯蟹和克氏原螯蝦血液中再次分離病原并進行鑒定。

1.4分離菌株生理生化特征鑒定

依據《一般細菌常用鑒定方法》［1］、《常見細菌系統鑒定手冊》［2］和《伯杰細菌鑒定手冊》［3］等所述方法進行致病菌的生理生化特性試驗，然后通過BBL Crystl微生物鑒定系統對試驗結果進行掃描和統計分析。

1.5分離菌株16S rRNA基因序列分析

設計細菌16S rRNA的PCR擴增采用通用引物對（F:5'-AGAGTTTGATCATG GCTCAG-3'，R: 5'-GGTACCTTGTTACGACTT-3'），以分離到的菌株為模板，進行16S rDNA的PCR擴增。PCR反應體系為25 μL：10×PCR Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.5 μL，引物F、R（10 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.5 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O補足25 μL。PCR擴增程序：94℃3 min，94 ℃40 s，65℃40 s，72℃1 min，共30個循環；72℃延伸8 min。PCR產物采用TIANGEN公司DNA快速純化回收試劑盒進行回收純化，純化PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。測序工作由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。所測序列通過GenBank的BLAST進行相似性比對分析，并通過MegAlign方法［4］構建系統發生樹，進行同源性分析，最后確定細菌的種類。

1.6藥敏試驗

將經鑒定后的純培養擴增培養，選擇氟苯尼考、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、鹽酸環丙沙星、鹽酸多西環、鹽酸諾氟沙星、鹽酸恩諾沙星、甲砜霉素、硫酸新霉素等生產上常用的9種抗生素（本實驗室根據國標自制藥敏試紙，藥物均為標準品，由江蘇省水生動物疫病預防控制中心贈送）作為試驗藥物，采用常規瓊脂擴散法［5］進行敏感性測定，以抑菌圈直徑大小作為敏感與耐藥的判定指標。并以3倍稀釋法進行最小抑菌試驗濃度（MIC）試驗。藥物的敏感性評判標準參考NCCLS標準和CLSI標準（表1）。

表1　9種抗菌類藥物的敏感性評判標準

2　結果與分析

2.1發病蝦、蟹的癥狀

觀察解剖發病的中華絨螯蟹和克氏原螯蝦發現，無論是蝦還是蟹行動遲緩、肢體無力，少食至不食，翻身困難，嚴重者無法翻身；解剖蝦蟹可見鰓絲排列不整齊，肝胰臟顏色淡黃，腸道內無食，血液凝固緩慢或不凝固。池塘中先發現克氏原螯蝦先發病，幾天后出現死亡；隨后中華絨螯蟹出現病癥，同樣幾天后出現死亡。發病池水質指標正常。

2.2細菌的致病力

將純化的優勢菌AH3株和CF株感染健康的中華絨螯蟹和克氏原螯蝦，結果顯示這兩株菌對蟹、蝦均有很強的致病力。其中健康蟹的96 h最低致死量分別為2.1×104CFU/g和2.1×105CFU/g，健康蝦的96 h最低致死量分別為3.3×104CFU/g和3.3×104CFU/g，對照的蟹和蝦在96 h觀察期內均正常存活（見表2和表3）。說明AH3株的毒性強于CF株。分別隨機取3只感染死亡蝦蟹的血液再次分離純化，并進行形態及理化特性等復核性檢驗，表明分離菌檢驗結果與相應的感染菌一致。

表2　AH3和CF對中華絨螯蟹的致病力

表3　AH3和CF對克氏原螯蝦的致病力

表4　分離菌株AH3和CF的生理生化試驗

2.3細菌鑒定

通過RS瓊脂平板37℃恒溫培育24 h，菌株AH3在營養瓊脂平板上的菌落呈圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起、黃色，直徑約2.0 mm，生長豐盛；菌株CF菌落呈圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起、綠色，菌落中心有黑點，直徑約1.5 mm，生長豐盛。麥康凱瓊脂平板上生長的AH3菌落呈黃色，CF菌落呈黃色，菌落中心呈玫瑰紅。革蘭染色結果顯示，菌株AH3和CF均為革蘭陰性，個體形態特征相似：短桿狀或近球形、散在、個別的成雙兩端鈍圓、無芽孢、大?。?.4～0.7）×（1～1.5）μm。分離菌株AH3和CF的系列生理生化試驗結果見表4，基于BBL Crystl微生物鑒定系統對試驗結果的掃描和統計分析，并對照《常見細菌系統鑒定手冊》［2］和《伯杰細菌鑒定手冊》［3］，初步鑒定AH3和CF分別為維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）和弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）。

通過16S rRNA的PCR擴增，所獲AH3和CF 的PCR產物的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1，經測序分別獲得片段長1 400 bp和1 376 bp的序列。GenBank的BLAST序列相似性比對分析結果顯示，AH3菌株與維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii，登錄號：KT964297.1）的親緣關系最近，同一性為100%。CF菌株與弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii），登錄號：KR149315.1）的親緣關系最近，同一性為99%。

圖1　AH3和CF的PCR擴增產物

圖2　嗜水氣單胞菌與弗氏檸檬酸桿菌對9種抗生素的敏感性

2.4藥敏試驗

以NCCLS和CLSI藥物敏感試驗標準（表1），評判維氏氣單胞菌AH3株和弗氏檸檬酸桿菌CF株對9種抗菌類藥物的敏感性，試驗結果見圖2。結果顯示，當細菌在貼有藥物試紙的MH瓊脂平板上28℃培養24 h后，維氏氣單胞菌AH3對氟苯尼考、鹽酸環丙沙星、鹽酸諾氟沙星、鹽酸恩諾沙星和甲砜霉素等5種藥物敏感，對鹽酸多西環和硫酸新霉素素等2種呈中度敏感，對磺胺嘧啶和磺胺二甲嘧啶等2種耐藥。類似維氏氣單胞菌AH3，弗氏檸檬酸桿菌CF對氟苯尼考、鹽酸環丙沙星、鹽酸諾氟沙星、鹽酸恩諾沙星等4種藥物敏感，但對甲砜霉素的敏感度低于維氏氣單胞菌AH3，呈中度敏感；對鹽酸多西環、硫酸新霉素素、磺胺嘧啶和磺胺二甲嘧啶等4種藥物的敏感性同維氏氣單胞菌AH3。同時，從最小抑菌濃度也可以發現（表5），弗氏檸檬酸桿菌CF株的最小抑菌濃度普遍高于維氏氣單胞菌AH3株，說明其耐藥性較高。然而我們從圖2可以發現，維氏氣單胞菌AH3株雖然對氟苯尼考、鹽酸環丙沙星、鹽酸諾氟沙星、鹽酸恩諾沙星和甲砜霉素等5種藥物敏感，但均出現二次生長的特性，最小抑菌試驗結果同樣表明，維氏氣單胞菌AH3株細菌在1 mg/L的氟苯尼考、鹽酸環丙沙星、鹽酸恩諾沙星中前18 h培養液透明，無菌生長，但到24 h時，最小抑菌濃度均降到3～9 mg/L，表明這些藥對維氏氣單胞菌AH3株抑菌有效期較短，可能出現了耐藥性狀。

表5　9種抗生素對嗜水氣單胞菌AH3和弗氏檸檬酸桿菌CF的最小抑菌濃度

3　討論

3.1中華絨螯蟹和克氏原螯蝦敗血癥的病原及其致病力

中華絨螯蟹和克氏原螯蝦的細菌性疾病是養殖生產中常見的疾病。近年來，人們已從發病的中華絨螯蟹、克氏原螯蝦體內分離到較常見的病原菌包括嗜水氣單胞菌（Aeormonas hydrophila）、擬態弧菌（Vibro mimicus）［6-7］、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）［8］、螺原體（Spiroplasma eriocheiris）［9］、易損氣單胞菌（Aeromonas trota）［10］、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）［11］、弗氏檸檬酸桿菌［12-13］、維氏氣單胞菌［14］，因而引起水產科技工作者的高度關注。近三年來蘇州吳中區某養殖區的中華絨螯蟹和克氏原螯蝦敗血癥呈漫延趨勢，該研究從吳中區某養殖區的中華絨螯蟹和克氏原螯蝦敗血癥中分離到了2株致病菌，經鑒定為維氏氣單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌，該病屬于混合感染。這2株菌的致病力較強，維氏氣單胞菌AH3使中華絨螯蟹死亡的最低劑量為5×105CFU/g，低于鄭世雄等［14］分離到的菌株使中華絨螯蟹死亡劑量107CFU/g，該菌對克氏原螯蝦的死亡劑量更低，為5×104CFU/g。弗氏檸檬酸桿菌是克氏原螯蝦的常見病原，近年來已有多次報道［13，15］。該研究得到的弗氏檸檬酸桿菌CF的致病力稍弱于維氏氣單胞菌AH3，其致病力與沈錦玉等［13］從克氏原螯蝦中分離到菌株的致病力一致，但高于陳紅蓮等［15］從克氏原螯蝦中分離到菌株的致病力。因此，本次分離到的維氏氣單胞菌AH3株和弗氏檸檬酸桿菌CF株均為強毒菌株；從中華絨螯蟹和克氏原螯蝦敗血癥的流行特點也說明2株菌的混合感染引起了池塘蝦蟹大量發病和死亡。根據癥狀與病原特點，作者認為該疾病為中華絨螯蟹和克氏原螯蝦細菌性敗血癥。

3.2維氏氣單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌對抗生素的感受性

根據藥敏實驗結果對養殖者正確合理的施藥具有很強的指導性。從藥敏試驗結果看，我們分離到的維氏氣單胞菌AH3株和弗氏檸檬酸桿菌CF株對氟苯尼考、鹽酸環丙沙星、鹽酸諾氟沙星、鹽酸恩諾沙星敏感，但其中的鹽酸環丙沙星已被禁止在水產動物中應用，因此不能推廣應用。2株菌對鹽酸多西環和硫酸新霉素素呈中度敏感，對磺胺嘧啶和磺胺二甲嘧啶耐藥；而對甲砜霉素的敏感性分析結果發現，弗氏檸檬酸桿菌CF株低于維氏氣單胞菌AH3株。這種細菌對抗生素感受性的差異可能與細菌的種類和致病菌所接觸抗生素類藥物的頻率有關［9］。該研究的藥敏試驗還發現，維氏氣單胞菌AH3株雖然對上述抗生素敏感，但其有效期較短。當細菌在貼有藥物試紙的MH瓊脂平板上28℃培養24 h后出現了二次生長，說明維氏氣單胞菌AH3株出現了抗性。養殖者也反映，中華絨螯蟹和克氏原螯蝦敗血癥的治療效果越來越差，這與近兩年發病池塘常使用恩諾沙星、氟苯尼考等抗生素而產生抗性有關。因此，建議養殖生產者在生產實際中選擇有效藥物并采用多種藥物交叉使用的方法，減緩病原菌對抗生素等藥物耐藥性產生的時間。

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The etiological agents of bacterial septicemia in Eriocheir sinensis and Procambarus clarkia

Jiang Guangming1，Qian Caiyuan1，Gu Xuelin1，Wei Bin1，Xu le2，Song Xuehong2
（1.Suzhou Wuzhong Aquaculture Technology Extension Station，Suzhou 215128，China；2.School of Biology and Basic Medical Sciences，Soochow University，Suzhou 215123，China）

Two strains of bacteria were isolated from Chinese mitten crab（Eriocheir sinensis）and red swamp crayfish（Procambarus clarkii）with naturally occurring bacterial septicemia in a polyculture system.Both bacterial strains were tested for their biological traits，pathogenicity and drug sensitivity，to determine the bacterial entity，etiological significance，and drug resistance characteristics.The bacteria were isolated from blood samples of E.sinensis and P.clarkia，and sub-cultured repeatedly to obtain pure bacterial culture.The pure bacterial cultures were subsequently used to identify the bacterial species by their biological traits，physical and chemical properties，16S rRNA gene sequence，and phylogenetic characterization.The pathogenicity test was performed by infecting healthy crab and/or crayfish with serial dilutions of bacteria suspension from these two strains.The susceptibility of these bacteria to nine common antimicrobial agents was determined using agar diffusion technique and serial dilution method.The two bacterial strains isolated from pure cultures were identified as Aeromonas veronii and Citrobacter freundii，respectively，and both showed stronger pathogenicity，but were sensitive to four antibiotics，including florfenicol，ciprofloxacin，norfloxacin lactate，and norfloxacin hydrochloride.

Eriocheir sinensis；Procambarus clarkia；bacterial septicemia；Aeromonas veronii；Citrobacter freundii；drug susceptibility

中途分類號：S966.1A

1004-2091（2016）04-0046-06

江蘇省三新工程項目（Y2014-36）、蘇州市應用基礎項目（SYN201505）

姜光明（1982-），男，工程師，研究方向：水產動物營養、疾病E-mail：jiang_guangming@aina.com

宋學宏，副教授，E-mail：songxh@suda.edu.cn

（2015-12-25）