溫度對β-胡蘿卜素二維相關紅外光譜的影響*

盧明倩，黃桂媛，王巧貞，許　超，黃庶識**

(1.廣西科學院生物物理實驗室，廣西南寧　530007；2.廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧　530004)

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溫度對β-胡蘿卜素二維相關紅外光譜的影響*

盧明倩1，黃桂媛1，王巧貞1，許超2，黃庶識1**

(1.廣西科學院生物物理實驗室，廣西南寧530007；2.廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧530004)

【目的】了解在升溫過程中β-胡蘿卜素分子內不同基團之間的相互影響?！痉椒ā坎捎枚S相關紅外光譜分析技術，研究β-胡蘿卜素在30～100℃變溫微擾過程中的動態光譜變化?！窘Y果】β-胡蘿卜素分子的吸收特征峰在一維紅外光譜和二階導數譜上變化不明顯，表明其沒有發生氧化反應。二維相關分析表明，反式共軛烯烴C—H面外彎曲振動的968 cm-1，烯烴C—H基團反對稱彎曲振動的1 442 cm-1，甲基C—H反對稱伸縮振動的2 966 cm-1和烯烴C—H的對稱伸縮振動的3 012 cm-1，這些吸收峰的光譜變化對溫度比較敏感。同時在微擾過程中，不同基團變化的先后順序：亞甲基熱運動引起的光譜變化快于甲基的，低波數的甲基碳氫對稱伸縮振動的光譜變化快于高波數的甲基反對稱伸縮振動，烯烴碳氫對稱伸縮振動熱運動引起的光譜變化快于烯烴碳氫反對稱伸縮振動?！窘Y論】在微擾作用下利用二維相關分析可以提高譜圖的分辨率，這為β-胡蘿卜素在升溫過程中構象變化的機理提供實驗基礎。

β-胡蘿卜素溫度傅里葉變換紅外光譜二維相關分析

Abtract:【Objective】The aim of this study is to analyze the interaction between the different groups of β-carotene in the heating process.【Methods】Two-dimensional correlation spectroscopy was applied to study the dynamic spectral changes of β-carotene from 30℃ to 100℃.【Results】The changes of absorption characteristic peaks of β-carotene were inconspicuous in the conventional FTIR spectra and second derivative FTIR spectra during 30℃ to 100℃,which indicated that they had no oxidation reation.Two-dimensional correlation analysis showed that the changes of absorption peaks at 968 cm-1,1 442 cm-1,2 966 cm-1and 3 012 cm-1were more sensitive to temperature.Meanwhile,the order of different groups changes induced by temperature were as follows:the spectral changes of methylene were faster than methyl,the spectral changes of methyl C-H symmetric stretching vibration in low wavenumber were faster than methyl anti-symmetric stretching vibration in high wavenumber,and olefin hydrocarbon symmetric stretching vibration were prior to olefin hydrocarbon anti-symmetric stretching vibration.【Conclusion】This provides experimental basis for the mechanism of the conformational change of β-carotene in heating process.

0　引言

【研究意義】β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素家族中的一種，其分子結構由單雙鍵相間的長多烯碳原子和位于兩側的β-紫羅酮環組成。β-胡蘿卜素常存在于許多天然食物如胡蘿卜、番薯、木瓜、綠色蔬菜、菠菜、芒果等，其中在胡蘿卜素中的含量最高。它是一種重要的食品添加劑，廣泛用于食品、飲料的著色劑[1]，同時，還具有抗氧化[2]、抗癌[3]和防治心血管疾病[4]等作用。此外，它還是維生素A的前體[5]。因此，國內外研究者一直都在熱衷于β-胡蘿卜素的研究?！厩叭搜芯窟M展】由于含有許多的不飽和雙鍵，β-胡蘿卜素對溫度、光照、空氣氧化、金屬離子、酸堿環境等因素表現不穩定，極易產生異構化和氧化作用[6]。仇丹等[7]研究發現將β-胡蘿卜素固體175℃熔融15 min后其產生大量順式異構體，同時還產生少量聚合物和小分子化合物。曲冠男等[8]和李碩等[9]通過紫外-可見吸收和拉曼光譜分別測量β-胡蘿卜素在二甲基亞砜和環己醇中25～81℃范圍內的結構變化，發現隨著溫度升高，β-胡蘿卜素分子的熱無序增加，分子結構有序性降低。目前研究構象變化的方法有高效液相色譜(HPLC)[10]、核磁共振氫譜(1H NMR)[7]、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)和紫外-可見光譜(UV)[6]等?！颈狙芯壳腥朦c】二維相關光譜是對待測樣品進行外部微擾如溫度、壓力、磁場、機械、濃度、反應時間等，記錄微擾作用下樣品相應的動態光譜，然后對一系列的動態光譜進行相關分析[11]。通過對二維相關分析，不僅可以提高譜圖的分辨率，而且還體現出樣品在實驗過程中分子內和分子間不同基團相互作用及先后關系，這顯示出二維相關圖譜獨特的優勢。紅外光譜則具有對整個化合物分子的專一鑒別功能[12]。目前，研究人員利用二維紅外相關光譜研究溫度熱微擾下構象的變化，如蛋白質[13]、抗壞血酸[14]和蘆丁[15]等，取得了非常好的效果?！緮M解決的關鍵問題】本研究利用二維相關紅外光譜研究在溫度變化過程中β-胡蘿卜素構象的動態變化。通過在熱微擾下分析二維紅外相關光譜，了解在升溫過程中β-胡蘿卜素分子內不同基團之間的相互影響。

1　材料和方法

1.1儀器

傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet 5700,美國 Thermo Nicolet 公司)，光譜分辨率為4 cm-1， 掃描范圍為 400～4 000 cm-1；壓片機(FW-4A，天津光學儀器廠)；變溫附件。

1.2藥品與試劑

β-胡蘿卜素(Sigma-Aldrich公司)，溴化鉀(光譜純，天津市光復精細化工研究所)。

1.3方法

1.3.1紅外光譜測量β-胡蘿卜素

準確稱量2 mg β-胡蘿卜素，按1∶100(W/W)加入溴化鉀研磨壓片，制成厚度約1 mm的錠片，將錠片裝在變溫附件的樣品架上測定光譜圖，控溫范圍是30～100℃，升溫速度是2℃/min，每10℃采集1次光譜，重復3次實驗。實驗測定條件：光譜范圍400～4 000 cm-1，光譜分辨率為4 cm-1，掃描次數32次；掃描時實時扣除H2O和CO2的干擾。為了保證實驗環境的穩定，紅外實驗室控制溫度為25℃，濕度為30%。

1.3.2光譜處理

紅外光譜數據通過OMNIC軟件自動扣除溴化鉀背景光譜，對得到的紅外光譜進行自動基線校正和自動平滑。

1.3.3二維相關數據處理

采用日本關西學院大學Shigeaki Morita和Yukihiro Ozaki設計的 2D Shige 軟件進行相關運算，繪制等高線圖,得到二維相關圖；采用Matlab7.0和origin8.0軟件進行數據處理和作圖。由于在二維相關圖中,無論同步還是異步譜圖中均存在對稱或反對稱的關系，因此僅討論局部區域。

2　結果與分析

2.130℃處理下β-胡蘿卜素的紅外光譜圖

由圖1所示，β-胡蘿卜素的主要吸收峰有：966 cm-1、1 362 cm-1、1 445 cm-1、1 556 cm-1、2 852 cm-1、2 911 cm-1、2 949 cm-1和3 027 cm-1。966 cm-1歸屬于反式共軛烯烴—CH=CH—面外彎曲振動，1 362 cm-1和1 445 cm-1為烯烴C—H基團對稱和反對稱的彎曲振動的吸收峰，1 556 cm-1對應于芳香環骨架振動，2 852 cm-1和2 911 cm-1為亞甲基C—H對稱和反對稱伸縮振動的吸收峰，2 949 cm-1為甲基C—H反對稱伸縮振動吸收峰，3 027 cm-1歸屬于=C—H的伸縮振動。光譜圖說明該β-胡蘿卜素屬于全反式異構體。

圖1β-胡蘿卜素在400～4 000 cm-1范圍內的紅外光譜圖

Fig.1β-carotene spectrum by Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy in the spectral range 400～4 000 cm-1

2.2不同溫度處理下β-胡蘿卜素的一維紅外光譜和二階導數譜

由圖2顯示，隨著處理溫度的升高，β-胡蘿卜素紅外光譜的吸收峰的位置和強度沒有產生明顯的變化，不同溫度之間峰型和峰強差異很小，不易分辨。

圖2不同溫度處理下β-胡蘿卜素的一維紅外光譜圖(a)及其二階導數紅外光譜圖(b)

Fig.2Conventional FTIR spectra(a) and second derivative FTIR spectra(b) of β-carotene at different treated temperature

由于氧化的β-胡蘿卜素紅外光譜圖會出現3 435 cm-1(—OH伸縮振動)、1 718 cm-1(“—CH2—CO—CH2— ”中C=O的特征吸收)、1 165 cm-1(—C—O—C—的特征吸收)等較強的吸收峰[7]，而圖2沒有出現這幾個較強的吸收峰，說明在30～100℃溫度變化范圍內，β-胡蘿卜素沒有發生氧化作用。由于施加的溫度變化是一種微擾，會改變樣品分子內或分子間的相互作用，影響分子各基團的振動頻率與振動耦合作用[13]，但是其變化非常小，因此一維的紅外譜圖和二階導數譜圖都很難體現出來。

2.3不同溫度處理下β-胡蘿卜素二維相關圖譜

由圖3、圖4顯示，同步相關圖譜對角線上的峰為自動峰，在非對角線上的峰為交叉峰；而異步相關圖中不存在自動峰，只有交叉峰。另外，圖中顯示紅色相關強度區域為正相關峰，藍色相關強度區域為負相關峰，文中只討論二維相關圖譜的右下角區域。

在圖3的同步圖(a、b)中，對角線上出現3個自動峰，它們分別位于968 cm-1、1 442 cm-1、1 564 cm-1附近出現；其中，968 cm-1和1 442 cm-1處的自動峰較強，這說明這兩個吸收峰對應的基團對溫度變化比較敏感；同時，這3個吸收峰兩兩之間的交叉峰均為正交叉峰。此外，還出現了(1 564 cm-1，1 622 cm-1)，(1 442 cm-1，1 622 cm-1)，(968 cm-1，1 622 cm-1)這3個正交叉峰，其中968 cm-1為反式共軛烯烴C—H面外彎曲振動吸收峰，1 442 cm-1歸屬烯烴C—H基團反對稱彎曲振動，1 564 cm-1歸屬芳香環骨架振動，1 622 cm-1為C=C伸縮振動吸收峰，這提示了隨著溫度的變化這4個吸收峰的光譜強度的變化為正相關性。值得注意的是，在紅外一維圖出現的1 362 cm-1峰在同步圖上沒有出現自動峰，表明溫度升高過程對其所對應的基團的構象影響不大。

根據Noda規則[11]，若同步圖中的交叉峰(ν1，ν2)為正峰，異步圖中相應的交叉峰(ν1，ν2)也為正峰，說明ν1處對應的基團先于ν2處對應的基團發生光譜強度變化；若異步圖中相應的交叉峰(ν1，ν2)為負峰，則說明ν2處對應的基團先于ν1處對應的基團發生光譜強度變化。而當同步圖中的交叉峰(ν1，ν2)為負峰時，以上的規則正好相反。在圖3中的異步圖(c、d)中顯示，(968 cm-1，1 442 cm-1)，(968 cm-1，1 564 cm-1)，(968 cm-1，1 622 cm-1)，(1 442 cm-1，1 564 cm-1)，(1 442 cm-1，1 622 cm-1)，(1 564 cm-1，1 622 cm-1)為正交叉峰，在同步圖中它們也為正交叉峰，表明了968 cm-1吸收峰的吸收振動變化先于1 442 cm-1，1 564 cm-1和1 622 cm-1峰；1 442 cm-1峰吸收振動變化先于1 564 cm-1和1 622 cm-1峰；1 564 cm-1峰吸收振動變化先于1 622 cm-1峰。由此認為在升溫過程中，反式共軛烯烴C—H面外彎曲振動的變化快于烯烴C—H基團反對稱彎曲振動，這兩者的變化快于芳香環骨架振動和烯烴C=C伸縮振動，而芳香環骨架振動的變化快于烯烴C=C伸縮振動的變化。此外，在異步圖中還出現其它交叉峰，如(968 cm-1，1 363 cm-1)，(1 442 cm-1，1 485 cm-1)正交叉峰和(1 550 cm-1，1 622 cm-1)負交叉峰，但是與之相應的同步圖中沒有出現對應的交叉峰，認為它們在升溫過程中以不同速率變化，不能確定它們的變化關系。

光譜范圍：900～1 650 cm-1；處理溫度范圍：30～100℃

Spectrum range from 900～1 650 cm-1；Temperature range from 30～100℃

圖3不同溫度處理下β-胡蘿卜素的同步(a)、異步(c)二維相關光譜圖及同步(b)、異步(d)立體相關圖

Fig.3Synchronous (a) and asynchronous (c) 2D correlation spectra and synchronous (b) and asynchronous (d) fishnet spectra (3D) of β-carotene

由圖4中的同步圖(a、b)顯示，在2 887 cm-1、2 941 cm-1、2 966 cm-1、3 012 cm-1和3 060 cm-1附近出現自動峰，其中2 966 cm-1和3 012 cm-1峰的自動峰較強，表明這兩個吸收峰對應的基團對溫度變化較為敏感。并且，這5個吸收峰兩兩之間的交叉峰均為正交叉峰，說明隨著溫度的變化這5個吸收峰的光譜強度的變化均為正相關性。2 941 cm-1為亞甲基C—H反對稱伸縮振動吸收峰，2 887 cm-1和2 966 cm-1歸屬甲基C-H對稱和反對稱伸縮振動吸收峰，3 012 cm-1對應烯烴C—H的對稱伸縮振動吸收峰，3 060 cm-1為烯烴C—H的反對稱伸縮振動吸收峰。

圖4中的異步圖(c、d)中顯示，(2 887 cm-1，2 966 cm-1)，(2 887 cm-1，3 012 cm-1)和(2 887 cm-1，3 060 cm-1)都為正交叉峰，在同步圖中相應的交叉峰也為正交叉峰，這說明了2 887 cm-1吸收峰的振動變化快于2 966 cm-1、3 012 cm-1和3 060 cm-1，但是(2 887 cm-1，2 941 cm-1)為負交叉峰，其在同步圖中相應的交叉峰為正交叉峰，這認為2 887 cm-1的吸收峰振動變化慢于2 941 cm-1；(2 941 cm-1，2 966 cm-1)，(2 941 cm-1，3 012 cm-1)，(2 941 cm-1，3 060 cm-1)均為正交叉峰，在同步圖中相應的交叉峰也為正交叉峰，表明2 941 cm-1的吸收峰振動變化快于2 966 cm-1、3 012 cm-1和3 060 cm-1；而(2 966 cm-1，3 012 cm-1)，(2 966 cm-1，3 060 cm-1)的交叉峰為負交叉峰，在同步圖中相應的交叉峰卻為正交叉峰，說明了2 966 cm-1的吸收峰振動變化慢于3 060 cm-1和3 012 cm-1；(3 012 cm-1，3 060 cm-1)的交叉峰為正交叉峰，在同步圖中(3 012 cm-1，3 060 cm-1)交叉峰也為正交叉峰，表明3 012 cm-1的吸收峰振動變化快于3 060 cm-1。因此認為在升溫過程，亞甲基熱運動引起的光譜變化快于甲基，而低波數的甲基碳氫對稱伸縮振動的光譜變化快于高波數的甲基反對稱伸縮振動，而烯烴碳氫對稱伸縮振動熱運動引起的光譜變化快于烯烴碳氫反對稱伸縮振動。

光譜范圍：2 700～3 100cm-1；處理溫度范圍：30～100℃

Spectrum range from 900～1 650 cm-1；Temperature range from 30～100℃

圖4不同溫度處理下β-胡蘿卜素的同步(a)、異步(c)二維相關光譜圖及同步(b)、異步(d)立體相關圖

Fig.4Synchronous (a) and asynchronous (c) 2D correlation spectra and synchronous (b) and asynchronous (d) fishnet spectra (3D) of β-carotene

3　結論

本研究采用傅里葉變換紅外光譜法結合二維相關光譜分析技術，研究β-胡蘿卜素在30～100℃變溫微擾過程中的動態光譜變化。研究表明，在30～100℃升溫過程中，β-胡蘿卜素吸收峰在一維紅外光譜和二階導數譜中沒有明顯地變化，表明胡蘿卜素30～100℃升溫過程中沒有發生氧化反應，但是構象發生了變化。二維相關分析顯示，968 cm-1(反式共軛烯烴C—H面外彎曲振動)，1 442cm-1(烯烴C—H基團反對稱彎曲振動)，2 966 cm-1(甲基C—H反對稱伸縮振動)和3 012 cm-1(烯烴C—H的對稱伸縮振動)這些吸收峰的光譜變化對溫度比較敏感。在微擾過程中，不同基團變化的先后順序為：反式共軛烯烴C—H面外彎曲振動的變化快于烯烴C—H基團反對稱彎曲振動，這兩者的變化快于芳香環骨架振動和烯烴C=C伸縮振動，而芳香環骨架振動的變化快于烯烴C=C伸縮振動的變化；亞甲基熱運動引起的光譜變化快于甲基的，而低波數的甲基碳氫對稱伸縮振動的光譜變化快于高波數的甲基反對稱伸縮振動，而烯烴碳氫對稱伸縮振動熱運動引起的光譜變化快于烯烴碳氫反對稱伸縮振動。這表明在微擾作用下利用二維相關分析可以提高譜圖的分辨率，這為β-胡蘿卜素在升溫過程中構象變化的機理提供實驗基礎。此外，在30～100℃變溫微擾過程中，β-胡蘿卜素分子沒有發生氧化反應，只是構象發生了變化，對其生理活性是否發生改變，有待下一步研究。

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(責任編輯：竺利波)

Study on β-carotene under Thermal Treatment by Two-Dimensional Correlation Fourier Transform Infrared Spectroscopy

LU Mingqian1,HUANG Guiyuan1,WANG Qiaozhen1,XU Chao2,HUANG Shushi1

(1.Lab of Biophysics,Guangxi Academy of Sciences,Nanning,Guangxi,530007,China；2.College of Life Science & Technology of Guangxi University,Nanning,Guangxi,530004,China)

β-carotene,temperature,Fourier transform infrared spectroscopy,two-dimensional correlation analysis

2016-04-19

2016-06-21

盧明倩(1987-)，女，助理研究員，主要從事微生物與分子光譜研究。

O657.33

A

1005-9164(2016)03-0266-06

*國家自然科學基金項目(31160018)，廣西科學研究與技術開發計劃項目(0992003A-20)和廣西科學院基本科研業務費項目(13YT22WL08)資助。

**通訊作者：黃庶識(1964-)，男，研究員，主要從事應用微生物與分子光譜研究，E-mail:hshushi@gxas.cn。

廣西科學Guangxi Sciences 2016,23(3):266～271

網絡優先數字出版時間：2016-07-13【DOI】10.13656/j.cnki.gxkx.20160713.009

網絡優先數字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160713.0857.018.html