馬鈴薯HD-Zip I家族ATHB12基因的克隆及功能鑒定

武亮亮 姚 磊 馬 瑞 朱 熙 楊江偉 張 寧司懷軍

甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室， 甘肅省干旱生境作物學省部共建國家重點實驗室培育基地 / 甘肅農業大學生命科學技術學院， 甘肅蘭州 730070

馬鈴薯HD-Zip I家族ATHB12基因的克隆及功能鑒定

武亮亮 姚 磊 馬 瑞 朱 熙 楊江偉 張 寧*司懷軍

甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室， 甘肅省干旱生境作物學省部共建國家重點實驗室培育基地 / 甘肅農業大學生命科學技術學院， 甘肅蘭州 730070

HD-Zip I是一類植物特異轉錄因子， 在植物應對外界逆境脅迫過程中有重要的調控作用。本研究從馬鈴薯栽培品種甘農薯2號中克隆了HD-Zip I轉錄因子ATHB12基因， 其開放閱讀框為759 bp， 編碼252個氨基酸殘基。該基因位于馬鈴薯第1染色體， 其啟動子區含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多種響應非生物脅迫（ABA、低溫、脫水和高鹽）的順式作用元件。ATHB12基因在馬鈴薯根、莖和葉中均有表達， 其根中表達量最高。qRT-PCR分析證實該基因的表達受聚乙二醇（PEG）、NaCl和 ABA誘導， 受低溫抑制。構建了由組成型表達啟動子CaMV 35S驅動的ATHB12基因的過表達載體， 通過農桿菌介導法轉化馬鈴薯獲得了轉基因植株。干旱處理后， 轉基因植株葉片中丙二醛含量顯著低于非轉基因植株（P ＜ 0.05）， 而脯氨酸含量顯著高于非轉基因植株（P ＜ 0.05）； 轉基因植株根鮮重和干重均高于非轉基因植株； 說明馬鈴薯ATHB12基因可能參與了逆境脅迫的響應。

馬鈴薯； HD-Zip； ATHB12基因； 根； 丙二醛； 脯氨酸

同源異型域亮氨酸拉鏈蛋白（homeodomain-leucine zipper， HD-Zip）是植物特異轉錄因子， 由DNA同源結構域（HD）和附加的Leu zipper （LZ）元件組成， 前者與DNA特異結合， 后者介導蛋白二聚體的形成［1］。依據 HD-ZIP轉錄因子結構和功能差異， 可將其分為HD-Zip I、HD-Zip II、HD-Zip III和HD-Zip IV四類［1］。HD-Zip轉錄因子已分別從擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）［2］、煙草（Nicotiana tabacum L.）［3］、苜蓿（Medicago truncatula L.）［4］和小立碗蘚（Physomitrella patens H.）［5］中被克隆出來， 并對其響應非生物脅迫的功能進行了研究。HD-Zip轉錄因子亞家族I和II表達受干旱、高鹽和冷害等非生物脅迫因子的誘導， 這兩類基因參與激素信號途徑， 通過與合成激素途徑相關基因和下游功能基因互作來調控植物形態結構或生理狀態從而提高植物耐逆性［1］。HD-Zip I類轉錄因子調節植物干旱脅迫應答方面有ABA依賴型和ABA非依賴型［1］。缺水脅迫和外源ABA誘導擬南芥HD-Zip I類轉錄因子基因 ATHB6、ATHB7和 ATHB12表達， 表明ATHB6、ATHB7， ATHB12受水分脅迫方面起著正向調節作用［6-7］。還魂草（Craterostigma plantagineum）中，HD-Zip I類轉錄因子基因的4個成員CpHB4、CpHB5、CpHB6、CpHB7表達均受到脫水脅迫所調節， 但CpHB4、CpHB5的表達量在ABA脅迫下沒有變化； 而CpHB6、CpHB7表達量同時受脫水脅迫和ABA所調節［8］。來自于向日葵Hahb4基因在擬南芥中過量表達能顯著增強耐旱性， 植株長勢表現出了節間縮短， 葉片變窄等適應干旱的性狀［9］。玉米中， 超表達Zmhdz10基因提高了對鹽和干旱脅迫的抗性， 對于ABA敏感性增強， 葉片中丙二醛（MDA）含量降低， 脯氨酸（Pro）含量增高［10］。這些成員均含有1個HD和1個LZ結構域， 屬于HD-Zip I型HD-Zip轉錄因子亞家族。

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是重要的糧菜兼用作物。Xu等［11］根據馬鈴薯基因組測序結果用生物信息學方法預測了馬鈴薯ATHB12-like基因（GenBank登錄號為XM_006339695）序列， 但關于馬鈴薯HD-Zip I類轉錄因子的功能的研究還未見報道。本研究根據ATHB12-like基因的cDNA序列設計引物， 克隆了ATHB12基因， 對其進行了生物信息學分析和不同脅迫條件下的表達分析， 并通過轉基因技術在馬鈴薯中過表達后對其功能進行了鑒定， 取得的結果對于進一步研究馬鈴薯HD-Zip I轉錄因子的功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株、載體和試劑

將馬鈴薯栽培品種甘農薯2號的無菌苗剪成帶有腋芽的莖段， 轉接到含50 mL MS+3%蔗糖液體培養基的150 mL三角瓶中， 每瓶接5株。在光照800 μmol s-1m-2、光照時間16 h d-1、溫度（23±1）℃下培養3周形成壯苗。參照張寧等［12］的方法誘導試管薯。大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α感受態購自北京全式金生物技術有限公司； 質粒載體pMD18-T購自大連寶生物工程公司； 表達載體pBI121、根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株LBA4404由甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室保存。Taq PCR Mastermix、限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶、SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）熒光染料、RNA提取試劑盒（RNAprep Pure Plant Kit）、高純質粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒等均購于TIANGEN公司； 反轉錄試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit）購自Thermo Fermentas；由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物， 其余試劑均為國產分析純。

1.2 總RNA提取、反轉錄及目的基因的克隆

參照RNAprep Pure Plant Kit說明書提取生長3周后整株幼苗的RNA， 參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書合成cDNA第1鏈。根據馬鈴 薯 ATHB-12-like基 因 （GenBank登 錄 號 為XM_006339695）序列， 利用Primer Premier 5.0設計包含全長開放閱讀框序列的基因特異正向引物ATHB12-F （5'-GCTCTAGA GAACATTCCAGTTCCA ATCC-3'）和反向引物ATHB12-R （5'-CGGGATCCTC AAATGTACAAGAGTCGCG-3'） （其中畫線部分分別為Xba I和Bam H I酶切位點， 斜體部分為保護堿基），預期擴增片段為911 bp。PCR體系含： Taq PCR Mastermix 12.5 μL、10 μmol L-1ATHB12-F和ATHB12-R各1 μL、500 ng μL-1cDNA模板1 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR條件為： 94℃預變性4 min；94℃變性30 s， 59℃退火45 s， 72℃延伸1 min， 循環35次； 72℃繼續延伸10 min。PCR產物經電泳回收后連接到載體pMD18-T， 轉化DH5α感受態細胞， 經菌落PCR鑒定， 選取陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序， 將其命名為ATHB12基因。

1.3 ATHB12基因的生物信息學分析

用 ProtParam （http：//web.expasy.org/protparam/）分析ATHB12基因編碼氨基酸的理化性質， 用PGSC （http：//www.potatogenome.net/index.php/Main_Page）確定基因在染色體組中的位置信息， 用在線網站PLACE （http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）預測并分析基因的順式作用元件； 在 NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行 Blast同源性比對， 并選擇同源性較高的8種植物， 運用DNAMAN軟件進行氨基酸多序列比對分析； 采用在線工具 GSDS （http：// gsds.cbi.pku.edu.cn/）確定ATHB12基因的內含子和外顯子。

1.4 脅迫處理

選取液體培養3周且生長基本一致的馬鈴薯試管苗， 倒掉三角瓶中的液體培養基， 分別加入含20% PEG-6000、0.1 mmol L-1ABA和200 mmol L-1NaCl的3%MS液體培養基， 并分別設置對照， 置800 μmol s-1m-2， 16 h d-1光照， 溫度（23±1）℃下脅迫處理； 置800 μmol s-1m-2， 16 h d-1光照的4℃培養箱低溫處理。在處理后0、4、8、12和24 h后采集整株幼苗， 用液氮速凍后于-80℃超低溫冰箱保存備用。

1.5 以 qRT-PCR分析基因的組織表達和脅迫誘導下的表達特性

取3%MS液體培養基培養3周的馬鈴薯試管苗的根、莖和葉， 以及脅迫處理的馬鈴薯材料提取RNA， RNA提取及cDNA合成方法見1.2。用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析基因的表達特性。用軟件primer premier 5.0設計ATHB12基因的qRT-PCR引物ATHB12-qF （5'-TCGGGTTAGATGACGATGCAG -3'）和 ATHB12-qR （5'-ATCGTCGTTTAGACTGCCC C-3'）。用馬鈴薯延伸因子（ef1a） （GenBank登錄號為XM_006347752）基因作內參基因， 引物序列為 ef1a-F （5'-TCACTGGGTACCAAGCCTCA-3'）和ef1a-R （5'-CCAGCACCTTCACCGGATAC-3'）。參照TIANGEN公司SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）試劑盒說明書進行實時定量PCR。PCR體系含 cDNA模板2 μL、2×SuperReal PreMix Plus 10 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL、10 μmol L-1引物各0.6 μL， 加ddH2O至終體積20 μL。反應在Mxpro Mx3005p儀器上進行， PCR程序為95℃預變性30 s； 95℃ 15 s，60℃ 33 s， 72℃ 1 min， 共40個循環， 最后72℃延伸10 min。用2-ΔΔCt法進行相對定量分析［13］。試驗3次生物學重復， 所有樣品均進行 3次技術重復取平均值， 并以生物學重復計算其標準偏差。用 Origin 8.0軟件作圖， 用 SPSS17軟件進行方差分析， 用Duncan’s法進行顯著性分析（P ＜ 0.05）。

1.6 基因過表達載體的構建

分別用Xba I和Bam H I雙酶切ATHB12基因的克隆載體質粒和表達載體pBI121， 將酶切后純化的克隆載體小片段（ATHB12基因）和表達載體大片段混合，用T4 DNA連接酶16℃過夜連接， 轉化大腸桿菌感受態DH5α， 經酶切鑒定后將重組質粒命名為pBI121-ATHB12。采用凍融法將重組質粒導入農桿菌LBA4404制備工程菌液用于遺傳轉化［14］。

1.7 馬鈴薯的遺傳轉化及檢測

參照張寧等［12］的操作方法， 以馬鈴薯栽培品種甘農薯2號的試管薯作為遺傳轉化受體。按照Edwards等［15］的方法從轉化馬鈴薯植株中提取基因組總DNA， 以未轉化的植株作陰性對照， 重組質粒pBI121-ATHB12作陽性對照。以總DNA為模板， 用pBI121表達載體上的選擇標記基因nptII設計引物進行PCR擴增， 引物序列為nptII-F （5'-GCTATGACTG GGCACAACAG-3'）和nptII-R （5'-ATACCGTAAAGC ACGAGGAA-3'）。PCR擴增程序為 94℃ 3 min； 94 ℃ 30 s， 57℃ 40 s， 72℃ 1 min， 35個循環； 72℃延伸10 min， 預期的擴增片段為676 bp。用qRT-PCR分析轉基因植株與對照植株整株幼苗中ATHB12基因的相對表達量， 方法同1.5。

1.8 轉基因植株丙二醛和脯氨酸含量的測定及表型觀察

將轉基因馬鈴薯無菌試管苗分別剪取帶有頂芽的長1 cm外植體， 轉接到含有45 mL 3%MS固體培養基的100 mL試管中， 每管接種1個頂芽， 置于800 μmol s-1m-2， 16 h d-1光照下培養3周， 測定試管苗的株高（根原基以上部分長度）、根鮮重及干重（鮮重即從培養基中取出所有根后蒸餾水洗凈， 濾紙吸干水分后的重量； 干重是將鮮樣在80℃烘箱干燥至恒重的重量）。每個轉基因植株與對照共設5個重復。按照1.4中描述的方法PEG-6000脅迫處理5 d后取植株所有葉片， 參照陳建勛和王曉峰［16］的方法測定丙二醛（MDA）和脯氨酸（Pro）含量。在數據處理時候運用相對值， 即統計分析每個材料PEG處理后的值與未處理的值之比?；旌厦科?株植株所有葉片為一個處理， 每個處理與對照共設5個重復。試驗重復3次，取平均值。用Origin8.0軟件整理數據和作圖， 用SPSS.17.0軟件統計分析。

2 結果與分析

2.1 ATHB12基因cDNA克隆及生物信息學分析

以馬鈴薯總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，用ATHB12基因的引物ATHB12-F和ATHB12-R擴增得到長度約900 bp的PCR擴增片段（圖1）， 將PCR產物切膠回收后連接至載體pMD18-T， 轉化大腸桿菌DH5α， 提取質粒測序表明其序列與馬鈴薯ATHB-12-like （GenBank登錄號為XM_006339695）同源性達到100%。

圖1 馬鈴薯ATHB12基因PCR擴增Fig. 1 PCR of ATHB12 gene in potato

生物信息學分析顯示該基因包含一個759 bp的開放讀碼框， 編碼252個氨基酸殘基， 等電點為5.64，分子量約28.71 kD， 位于馬鈴薯第1染色體。氨基酸序列多重對比發現不同物種間ATHB12基因編碼蛋白在HD區域存在很高的保守型， LZ基序差異較大（圖2）?；蚪Y構分析發現ATHB12基因包含1個內含子和2個外顯子。對ATHB12起始密碼子上游1500 bp的啟動子區序列分析發現除含有TATA-box和CAAT-box等基本轉錄元件外， 還存在多種激素響應元件， 包括ABA響應元件ABRE、MYB1AT和MYCCONSENSUSAT； 赤霉素應答元件、水楊酸應答元件GL1CONSENSUS等； 同時， ATHB12啟動子區域還包含了許多脅迫應答相關的順式作用元件，如脫水響應元件MYB1AT和MYB2AT， 低溫應答元件LTRECOREATCOR15； 黃酮類化合物和花青素合成相關元件EBOXBNNAPA和MYBCORE （表1）。

表1 ATHB12啟動子區順式作用元件預測分析Table 1 Putative cis-acting regulatory elements in the ATHB12 promoter

2.2 ATHB12基因在馬鈴薯不同組織中的表達分析

通過qRT-PCR檢測到ATHB12在馬鈴薯試管苗不同部位（根、莖、葉）中均有表達， 其相對表達量為根＞葉＞莖， 在根中表達較高， 是莖中表達量的3.5倍（圖3）。

2.3 ATHB12基因脅迫誘導下的表達特性分析

利用qRT-PCR方法分析了PEG、NaCl、ABA、低溫等非生物脅迫條件下馬鈴薯整株幼苗中ATHB12的表達模式。結果表明該基因的表達明顯受PEG、NaCl和ABA誘導， 而受低溫抑制（圖4）。在PEG脅迫8 h， ATHB12基因表達快速上調至最高水平， 然后逐漸下降， 至12 h表達水平略高于4 h， 24 h又迅速上升（圖4）； ATHB12基因在受到NaCl脅迫時表現出上升趨勢， 12 h表達量達到最高值， 24 h表達量有所下降（圖4）； 在ABA處理下， ATHB12基因的表達量在 4 h快速上升至最高水平， 隨著處理時間的延長， 表達水平逐步下降， 至24 h接近未處理時的表達水平（圖 4）。ATHB12在低溫脅迫下， 表現出相反的表達模式， 即呈下調趨勢。在低溫脅迫4 h后明顯被抑制， 之后逐漸上升（圖 4）。這些結果表明ATHB12基因參與了馬鈴薯對PEG、NaCl、ABA和低溫的應答反應。

圖2 馬鈴薯ATHB12氨基酸序列與其他物種同源氨基酸序列多重比對結果Fig. 2 Alignment of the potato ATHB12 amino acid sequence and its homologous amino acid sequences from other species下畫線： HD結構域； 虛線： LZ基序。Underline： HD domain； Dot line： LZ motif.

圖3 馬鈴薯ATHB12基因在不同器官中的qRT-PCR表達檢測Fig. 3 qRT-PCR assay of ATHB12 gene in different organs of potato

2.4 轉基因馬鈴薯植株的獲得及鑒定

馬鈴薯試管薯薄片在芽分化培養基上經過 2周的培養， 轉化薯片直接長出綠色小芽（圖5-A）。剪接至生根選擇培養基經過 2周培養， 未轉化植株不生根， 而轉化植株能夠正常生根（圖5-B）。分別提取未轉化植株和轉化馬鈴薯植株的總 DNA， 用 nptII基因作為篩選標記進行PCR檢測， 獲得PCR呈陽性的植株8株（圖6）。對鑒定為陽性的轉基因馬鈴薯進行qRT-PCR分析表明， ATHB12基因已在轉基因植株中得到了不同程度的超量表達（L5的表達量有所下降）（圖 7）。選取其中 2個表達量較高的轉基因株系（L1和L7）進行后續的表型觀察和生理指標測定。

2.5 丙二醛和脯氨酸含量的測定

未處理前， MDA含量在L1、L7和CK中無顯著差異； PEG處理5 d后CK葉片中MDA含量是處理前的2.43倍（圖8和表2）。MDA含量相對值在CK中大于L1、L7， 但無顯著差異（表2）。未處理前， Pro含量在L1、L7葉片中高于CK； PEG處理5 d后， Pro含量在CK和L1、L7葉片中都上升（圖8）。Pro含量相對值在CK中顯著小于L1、L7 （表2）。

圖4 馬鈴薯ATHB12基因在不同脅迫條件下的qRT-PCR表達檢測Fig. 4 qRT-PCR assay of ATHB12 gene of potato under different stress treatments

圖5 馬鈴薯的轉化Fig. 5 Potato transformation

圖6 轉化馬鈴薯的PCR檢測Fig. 6 PCR identification of ATHB12 transgenic potato plants

圖7 以qRT-PCR分析轉基因植株中ATHB12基因的表達水平Fig. 7 Expression level of ATHB12 gene in the transgenic plants assayed by qRT-PCR

2.6 轉ATHB12基因試管苗生物學性狀的差異

為了驗證ATHB12在轉基因植株中的作用， 觀察了試管苗在根系方面差異， 結果發現與非轉基因的對照相比， 轉基因植株的根系增多， 而株高無明顯變化（圖9和表3）； 轉基因株系L1和L7的根鮮重和干重均高于非轉基因的對照（表3）。

圖8 轉基因植株的丙二醛和脯氨酸含量Fig. 8 MDA and proline content in the transgenic potato plants

A： 丙二醛含量， B： 脯氨酸含量； CK： 非轉基因植株； L1， L7： 轉基因植株。數據為5次生物學重復的平均值±標準偏差， 柱上不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

表2 轉基因植株的丙二醛和脯氨酸含量相對值Table 2 Relative value of MDA and proline content in the transgenic potato plants

表3 轉基因植株試管苗株高和根重Table 3 Plant height and root weight of the transgenic test-tube plant

3 討論

Ollson等［7］的研究結果表明HD-Zip I家族基因參與了植物非生物脅迫響應和耐受性。已有的研究結果表明， HD-Zip I家族的一些成員主要通過調節糖類代謝信號通路基因［17］、葉片性狀［18］、莖和節間長度［19］、減少內源ABA含量［20］、增強維生素C的含量［21］等改變外在形態結構或增加內源滲透調節物質來提高植物的抗氧化能力以應對一系列逆境脅迫。

本研究利用馬鈴薯基因組測序后預測的ATHB-12-like基因開放閱讀框序列設計引物， 從馬鈴薯品種甘農薯2號中克隆了ATHB12基因。該基因與擬南芥ATHB5、ATHB7、ATHB12均具有很高的序列相似性， 同屬HD-Zip I亞家族。擬南芥ATHB5、ATHB7、ATHB12已被證明參與了ABA相關的非生物脅迫調節過程［7］。玉米、黃瓜中一些HD-Zip I家族基因的啟動子區域含有ABRE、DRE、LTRE等元件， 研究表明此類基因參與植物響應脅迫調節［10，22］?；ㄇ嗨?、類黃酮化合物的積累是植物應答逆境脅迫的一個重要特性，具有調節植物的耐旱性等功能［23］?；虻恼T導表達與其啟動子區的順式作用元件密切相關， ATHB12啟動子分析暗示其參與了脅迫響應和次生代謝物調節。

基因的組織表達特異性直接反映該基因在相應部位的生物學功能， 相關研究證實了植物中HD-Zip I基因具有組織表達特異性［24］。Capella等［19］的報道表明AtHB1基因在擬南芥根部和下胚軸的表達量高于莖、葉等器官， 具有促進下胚軸延伸的功能。Liu等［22］發現黃瓜葉片和花器官中CsHDZI10基因的表達量高于其他組織。本研究初步發現ATHB12在根部表達量較高， 暗示該基因主要參與根系生長發育調節。同一個轉錄因子在受多種脅迫誘導表達的同時， 往往另外一種脅迫抑制其表達［25-26］。ZmNF-YA14轉錄因子的表達受到鹽脅迫誘導， PEG和ABA抑制其表達［27］。Hou等［28］研究發現鹽脅迫誘導MYB類轉錄因子CsMYB55表達， 甘露醇抑制其表達。本研究結果表明ATHB12的表達受干旱、高鹽和ABA等脅迫的誘導， 受低溫抑制， 這與前人研究其他轉錄因子的結果類似， 表明植物應答非生物脅迫的信號途徑非常復雜。生物信息學分析結合逆境表達試驗結果， 表明ATHB12基因參與了馬鈴薯對PEG、NaCl、ABA和低溫的響應。

圖9 轉基因植株試管苗表型差異Fig. 9 Phenotype difference between the transgenic test-tube plants and the control

Ariel等［4］研究發現苜蓿中MtHB1基因過表達使得側根減少， 根系變長。水稻中Oshox4基因過表達使地上部分變矮［29］。這與我們的研究結果不一致，可能是物種間的差異所致。非生物脅迫會使植物合成滲透調節物質， 其含量的變化可以作為評價植物耐性的指標， Pro是最普遍的滲透調節物質之一。植物在正常條件下Pro含量很低， 逆境條件下， 植物體內游離Pro便會大量積累， 積累量與植物的抗逆性呈正相關［30］。本研究中， 轉基因馬鈴薯葉片中Pro的相對含量高于非轉基因植株， 推測ATHB12基因超表達提高馬鈴薯對PEG脅迫的抗性， 可能是通過促進葉片內Pro的積累而減少滲透脅迫對細胞結構的損害，保護細胞膜的完整性， 維持植物細胞正常的代謝活動。非生物脅迫下， 植物體內會產生大量超氧自由基（ROS）， 造成植物細胞膜的過氧傷， MDA是膜脂過氧化的產物之一， 是衡量氧化脅迫的標志物， 用來評估氧化脅迫對膜的損傷程度［30］。本研究中轉基因株系葉片中MDA含量相對值低于非轉基因植株， 說明超表達ATHB12基因可減少膜脂過氧化程度， 減輕對膜系統的損傷， 提高馬鈴薯對PEG脅迫的抗性。綜合結果分析說明馬鈴薯ATHB12基因可能參與了脅迫應答， 但相關的分子機制有待進一步研究。

4 結論

ATHB12基因啟動子區含有脅迫應答相關的調控元件， 該基因的表達受PEG、NaCl和ABA誘導，受低溫的抑制。ATHB12基因在馬鈴薯根、莖、葉中均有表達， 其中根中表達量最高。ATHB12基因調控馬鈴薯根系的發育和MDA與Pro的含量， 推測該基因可能參與調控植物對非生物脅迫因子的應答。

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Cloning and Functional Identification of the ATHB12 Gene of HD-Zip IFamily in Potato （Solanum tuberosum L.）

WU Liang-Liang， YAO Lei， MA Rui， ZHU Xi， YANG Jiang-Wei， ZHANG Ning*， and SI Huai-Jun
Gansu Key Laboratory of Crop Genetic and Germplasm Enhancement， Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science / College of Life Science and Technology， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China

HD-Zip I is a class of plant-specific transcription factors， which has an important role in response to adversity stress in plant. A ATHB12 gene of HD-Zip I transcription factors was cloned from potato cultivar Gannongshu 2， which contains a 759 bp open reading frame （ORF） encoding a protein of 252 amino acid residues. ATHB12 gene is located on potato chromosome 1， and its promoter region sequence contains cis-acting elements including ABRE， LTRECOREATCOR15， WBOXATNPR1 responsive to abiotic stresses （ABA， temperature， dehydration， and salt stress）. ATHB12 gene expressed in root， stem and leaf of potato， with the highest expression in the root. qRT-PCR analysis confirmed that the gene was induced by PEG， NaCl， and ABA， but repressed by cold treatment. The overexpressed-vector of ATHB12 gene driven by the constitutive promoter CaMV 35S was constructed，and the transgenic plants were obtained using Agrobacterium-mediated transformation system. The malondialdehyde （MDA）content in the transgenic plant leaves was significantly lower （P ＜ 0.05）， whereas the proline content was significantly higher （P＜0.05） than those of non-transgenic control under drought stress. The fresh and dry weight of the transgenic plant root was higher than that of non-transgenic plants. These results showed that ATHB12 gene may be involved in response to stress.

Potato； HD-Zip； ATHB12 gene； Root； Malondialdehyde； Proline

10.3724/SP.J.1006.2016.01112

本研究由國家自然科學基金項目（31460370）， 高等學校博士學科點專項科研基金項目（20126202110007）， 國家國際科技合作專項（0102014DFG31570）和甘肅省干旱生境作物學省部共建國家重點實驗室培育基地開放基金項目（GSCS-2012-02）資助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China （31460370）， Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China （20126202110007）， International Science & Technology Cooperation Program of China （0102014DFG31570）， and Gansu Key Laboratory of Aridland Crop Science of Gansu Agricultural University （GSCS-2012-02）.
*

（Corresponding author）： 張寧， E-mail： ningzh@gsau.edu.cn， Tel： 0931-7631875

聯系方式： E-mail： 1335973527@qq.com， Tel： 18709492533
Received（

）： 2016-01-19； Accepted（接受日期）： 2016-05-09； Published online（網絡出版日期）： 2016-06-02.
URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160602.0830.004.html