基于CRISPR/Cas9技術的水稻千粒重基因tgw6突變體的創建

王加峰 鄭才敏 劉 維 羅文龍 王 慧 陳志強郭 濤

華南農業大學國家植物航天育種工程技術研究中心， 廣東廣州 510642

基于CRISPR/Cas9技術的水稻千粒重基因tgw6突變體的創建

王加峰 鄭才敏 劉 維 羅文龍 王 慧 陳志強*郭 濤*

華南農業大學國家植物航天育種工程技術研究中心， 廣東廣州 510642

利用CRISPR/Cas9技術對調控水稻產量千粒重基因TGW6定點編輯， 獲得了一套有重要育種價值的tgw6突變體。設計了分別由U3、U6a和U6b啟動子驅動、長20 bp的guide RNA （gRNA）靶點以靶向編輯TGW6基因的外顯子， 首先將這 3個靶點一起組裝到 pYLCRISPR/Cas9-MT（I）載體上， 然后利用農桿菌介導侵染水稻材料 H447 （R819/玉針香//R819的BC3F6）； 提取T0代轉基因植株的基因組DNA并對編輯位點附近的DNA片段進行PCR檢測及測序分析。結果表明， T0代材料中tgw6的突變頻率高達90%， 其中純合缺失突變率約占51%。對T1代純合缺失突變體的千粒重性狀的調查分析結果表明， 部分tgw6的缺失突變能顯著提高千粒重（大于5%）。不同類型tgw6突變體的成功創建不僅豐富了tgw6的變異類型， 為水稻的高產穩產奠定了重要的材料基礎， 還證實了CRISPR/Cas9技術在水稻基因工程育種中高效、易操作的特點。

水稻； 基因編輯； CRISPR/Cas9； TGW6； 千粒重

水稻（Oryza sativa L.）是世界上重要的糧食作物之一。由于人口的不斷增長， 人們對糧食的需求也越來越大， 但水稻的單位面積產量一直沒有太大提升， 而且水稻的種植面積也在持續下降， 嚴重威脅著我國的糧食安全。要解決這一問題， 必須借助新技術和新的遺傳改良策略。粒重是水稻產量構成的三因子之一， 主要決定于籽粒胚乳中淀粉的合成與積累和籽粒的大小， 表現為典型的數量性狀， 適當提高千粒重， 有利于產量的提高［1］。目前， 已經克隆的千粒重相關基因有qSW5/GW5［2-3］、TGW6［4］、GS3［5］、GS5［6］、GW2［7］、GW8［8］、qGL3/qGL3-1/GL3.1［9-11］等。其中， TGW6 （Thousand-Grain Weight 6）是調控水稻千粒重性狀的最重要的基因之一。TGW6基因編碼吲哚乙酸-葡糖糖水解酶， 其功能缺失突變（313 bp）會引起胚乳中吲哚乙酸含量下降， 進而細胞數量增加、粒長和粒重增加， 使水稻抽穗前籽粒的碳水化合物積累， 使日本晴產量增加15%， 且不影響稻米品質［4］。

CRISPR/Cas9系統是近幾年發展的一種準確、便捷、高效率的生物基因組編輯方法。該系統僅需要短的gRNA和核酸酶（Cas9）就可以使特定的生物靶基因定點突變， 為生物定點編輯技術的發展注入了新的活力［12-14］。目前， CRISPR/Cas9系統不但在酵母、果蠅、鼠、人等生物中， 而且已成功在擬南芥、煙草、甜橙、水稻、小麥、高粱、玉米以及苔蘚植物地錢等植物中實現了定點基因組編輯［15-19］， 但對水稻育種中有重要價值的產量、品質、育性等關鍵基因的定向編輯研究鮮有報道， 更缺乏對相關突變體的育種價值評價。本研究利用CRISPR/Cas9技術定點編輯了調控水稻千粒重的TGW6基因， 獲得了一套具有重要應用價值的水稻tgw6突變體新種質， 為進一步提高水稻產量奠定了重要的材料基礎。

1 材料與方法

1.1 水稻材料、CRISPR/Cas9及gRNA載體

水稻材料H447為秈稻恢復系R819與優質米常規秈稻品種玉針香雜交后， 以R819為輪回親本回交、自交得到的BC3F6代品系。該品系具有抗稻瘟病、株型緊湊、米質優等特點。Cas9載體pYLCRISPR/ Cas9-MT（I）及gRNA載體pYL-U3/U6a-b-gRNAs （圖1）由華南農業大學劉耀光研究員饋贈。

圖1 YLCRISPR/Cas9-MT（I）及pYL-U3/U6a-b-gRNA質粒圖Fig. 1 Maps of YLCRISPR/Cas9-MT（I） and pYL-U3/U6a-b-gRNA vectors

1.2 gRNA靶點選擇及其寡核苷酸鏈引物的設計

根據調控水稻TGW6的外顯子序列（GenBank登錄號為AB513135.1）， 設計TGW6的gRNA。按A/G（N）20NGG序列設計20 nt的寡核苷酸gRNA核心序列，在水稻基因組數據庫中比對設計好的gRNA序列以排除非特異性的靶切位點。寡核苷酸序列見表1。同時設計CRISPR鑒定引物Cas9-TGW6testF： 5′-CAAC CAAACCAAAGCCTGC-3′和Cas9-TGW6testR： 5′-C CAATGCCTCATCAACTTAC-3′。所有寡核苷酸鏈引物均由Thermo Fisher Scientific公司合成。

表1 gRNA靶點以及寡核苷酸序列Table 1 Target sites of the gRNA and the oligonucleotide sequences

1.3 三靶點pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA載體的構建

參照Ma等［18］的方法略作修改。（1）制備雙鏈接頭。分別取等量每個靶點的1對gRNA寡核苷酸鏈的上游引物與下游引物混合（終濃度1 μmol L-1）， 95℃處理30 s， 然后移至室溫冷卻完成退火； （2）酶切。取pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA及pYL-U6b-gRNA質粒各1 μg， 制備20 μL反應體系， 用5～10 U Bsa I （NEB）酶切20 min， 70℃處理10 min使酶失活； （3）連接和PCR擴增： 分別將酶切過的pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA及pYL-U6b-gRNA質粒與各自所對應雙鏈接頭連接， 然后分別利用引物B1’/B2 （B1’：5′-TTCAGAGGTCTCTCTCGCACTGGAATCGGCA GCAAAGG-3′； B2： 5′-AGCGTGGGTCTCGTCAGG GTCCATCCACTCCAAGCTC-3′）、B2’/B3 （B2’： 5′-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGC AAAGG-3′； B3： 5′-AGCGTGGTCTCGTCTTGGTC CATCCACTCCAAGCTC-3′）、B3’/BL （B3’： 5′-TTCA GAGGTCTCTAAGACACTGGAATCGGCAGCAAA GG-3′； BL： 5′-AGCGTGGGTCTCGACCGGGTCCA TCCACTCCAAGCTC-3′）對gDNA （gRNA對應的DNA序列）進行擴增， 先95℃ 1 min， 然后按95℃15 s、60℃ 15 s和68℃ 30 s進行30個循環的反應； （4）產物純化、酶切和連接。將所有靶點gDNA PCR產物回收混合后用20 U Bsa I在37℃酶切30 min， 然后75℃處理5 min； 將酶切片段純化后與Bsa I酶切回收的pYLCRISPR/Cas9-MT（I）載體片段利用T4 DNA ligase （NEB） 20℃連接2 h； （5）轉化及質粒測序。連接產物轉化DH5α感受態細胞后， 挑取單克隆接種培養，抽提質粒后利用Asc I進行酶切鑒定， 并挑取酶切（Asc I）驗證正確的克隆送Thermo Fisher Scientific公司測序。

1.4 農桿菌介導水稻愈傷遺傳轉化

參照Hiei等［20］的方法， 將構建好的三靶點pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA載體通過電擊轉化到農桿菌EHA105中， 將PCR檢測呈陽性的克隆用于水稻愈傷組織轉化。

1.5 水稻基因組DNA提取、突變體的PCR檢測及測序

采用CTAB法提取轉基因水稻基因組DNA［21］。PCR擴增體系含2.5 μL 10×buffer for KOD-Plus、0.5 μL KOD plus聚合酶（5 U μL-1）、1 μL 25 mmol L-1MgSO4、2.5 μL 2 mmol L-1dNTPs、各0.5 μL引物（10 μmol L-1， Cas9-TGW6testF與Cas9-TGW6testR）、0.5 μL模板DNA， 以超純水補至25 μL。反應條件為94℃3 min； 32個循環的94℃ 30 s、55℃ 30 s和68℃ 60 s的反應， 最后68℃延伸5 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳（電泳緩沖液1×TAE）， BIORAD凝膠成像系統觀察、照相， 并送Thermo Fisher Scientific公司測序， 每個樣品測序2次。

1.6 無T-DNA元件tgw6突變體的鑒定及其千粒重性狀的調查分析

將PCR測序鑒定為突變的T0代轉基因單株自交結實后得到T1代種子。T1代種子播種成苗后提取葉片基因組DNA進行PCR檢測， 對經鑒定tgw6發生了純合突變的個體進一步利用引物hptF： 5′-AAGCTG CATCATCGAAATTGC-3′與hptR： 5′-AAGAATCTC GTGCTTTCAGCTTCG-3′進行PCR檢測以獲得不含T-DNA成分的純合tgw6突變株系。

采用隨機區組設計種植不含T-DNA成分的純合tgw6突變株系及H447， 2個重復， 各小區中每個株系種植6行， 每行6株。株行距為20 cm × 20 cm， 單本栽插。按大田常規栽培要求實施田間管理（水、肥、病蟲害防治等）。收獲成熟種子烘干后從中隨機數取飽滿、無病種子1000粒， 稱重（g）， 2個重復。保證重復間的差數與平均數之比＜5%。采用SPSS13.0計算平均值和標準誤， 采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）及Duncan法多重比較， 差異顯著性水平為P≤0.05。

2 結果與分析

2.1 gRNA靶點以及寡核苷酸序列設計

為利用CRISPR/Cas9技術獲得tgw6的突變體，根 據CRISPR/Cas9技 術的原理 ， 利用 載體pYLCRISPR/Cas9-MT（I）及pYL-U3/U6a-b-gRNA構建基因編輯載體。設計了3個靶點以定點編輯千粒重基因TGW6 （表1）， 分別從起始密碼子附近開始設計這3個靶點（圖2-A）， 以保證可以徹底破壞TGW6的功能， 然后利用Golden gate的克隆方法［18］將這3個靶點gRNA組裝到pYLCRISPR/Cas9-MT（I）載體上（圖2-B）。

圖2 gRNA靶位點及CRISPR/Cas9-gRNA的組裝示意圖Fig. 2 Target sites of the gRNA and cloning of gRNA cassette into the CRISPR/Cas9 vector

2.2 pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA載體的鑒定

將構建的三靶點pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA載體利用Asc I酶切， 如圖3所示， 3個靶點gDNA序列能被同時切出（1.8 kb左右）， 表明三靶點gRNA元件順利插入到pYLCRISPR/Cas9-MT（I）載體上。為進一步確定靶位點的準確性， 利用引物U3s （5′-GCATG GATCTTGGAGGAATCAGA-3′）、U6as （5′-GGCTA TCGAGATGCCATACA-3′）及U6bs （5′-AGAGAAGC CTAGTGTGCTCT-3′）分別對各個靶點（Target 1～3）測序分析。結果表明（圖4）， 通過Bsa I位點組裝的3個靶點序列都與所設計靶點序列（表1）一致， 因此所構建的pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA載體適宜于下一步農桿菌介導的水稻遺傳轉化。

圖3 AscI酶切鑒定pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA載體Fig. 3 Identification of the pYLCRISPR/Cas9-tgw6-gRNA

2.3 tgw6突變體的鑒定

采用CTAB法提取T0代再生水稻植株的葉片，對潮霉素基因檢測為陽性的植株利用引物Cas9-TGW6testF及Cas9-TGW6testR對tgw6編輯位點上下游200 bp左右區域DNA片段進行PCR擴增。電泳結果（圖5-A）表明， 擴增產物中多為tgw6片段缺失純合體， 也有部分雙等位雜合突變體存在。進一步對擴增產物的測序分析表明（圖5-B）， tgw6突變頻率高達90%， 其中51%為片段缺失純合體（缺失片段長度均在100 bp以上）， 39.5%是雙等位雜合突變體。

2.4 無T-DNA元件tgw6突變體的鑒定及其千粒重分析

為進一步獲得無 T-DNA插入元件的 tgw6突變體， 將 T1代 tgw6缺失純合突變的種子播種成苗， 苗期利用引物hphF與hphR對潮霉素基因進行PCR檢測。結果表明， T1代轉基因苗中潮霉素基因的分離符合孟德爾定律（數據未列出）， 圖6中列出了對部分tgw6突變體潮霉素基因PCR檢測的結果， 以進一步對這些材料進行千粒重性狀的分析。對T2代種子千粒重調查結果表明（表2）， 所分析的5種類型的純合缺失突變都顯著提高了水稻的千粒重（大于5%）。

3 討論

CRISPR/Cas9是一種新興的基因定點編輯技術，具有較高的特異性和編輯效率。相對于鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases， ZFNs）［22-24］及 TALE核酸酶（transcription activator like effector nucleases，TALENs）［25-27］2種基因編輯技術， CRISPR/Cas9技術構建簡便靈活， 僅需要一個gRNA及一個核酸酶（Cas9）即可實現對靶基因DNA序列的剪切。目前的研究主要集中于CRISPR/Cas9技術的開發及特定基因敲除。

圖4 3個靶點序列的測序結果Fig. 4 Sequencing results for the three target sequences

圖5 tgw6突變體的PCR檢測及其與野生型序列比對分析Fig. 5 PCR identification and sequence alignment of tgw6 mutants compared to the WT line

圖6 部分tgw6突變體潮霉素基因的PCR檢測Fig. 6 PCR identification for hph gene of parts of tgw6 mutants

表2 不同類型tgw6缺失突變體的千粒重測定結果Table 2 Thousand grain weight of different types of homozygous deletion mutants of tgw6

本研究中利用多靶點gRNAs對水稻的TGW6基因進行一次性定點編輯， 獲得了一系列不同類型的tgw6突變體， T0代tgw6的突變頻率高達90%， 其中，tgw6純合缺失突變比例約占51%， 表明多靶點的定點編輯利于在T0代獲得純合缺失突變的類型。對T1代的幼苗所含潮霉素基因的PCR檢測結果與大多農桿菌介導的水稻遺傳轉化一致， 潮霉素基因的分離也符合孟德爾定律， 因此通過轉基因T0代植株自交便可以在T1代分離出無轉基因成分的tgw6純合缺失突變株系。雖然Xu等［19］指出， T1代轉基因植株的突變將具有不確定性， 到T2代以后該突變才能穩定遺傳， 這主要是由基因編輯時選用的靶點過少（通常為1個）造成的， 單靶點很難造成大片段的缺失， 多是堿基的替換或者插入等突變， 使得T1代轉基因植株靶基因的編輯位點還可能存在gRNA靶點識別的序列， 導致發生再次編輯， 從而使得突變具有不確定性； 相反， 利用2個以上靶點進行的基因定點編輯可以提高純合缺失突變的頻率， 在T0代就可能獲得可以穩定遺傳給T1代的突變。雖然單靶點的基因編輯也會出現純合突變的變異類型， 但是突變率大多在20%以下［19］， 而且難以利用PCR鑒定出來， 一般需要借助對變異位點附近的DNA片段測序才能鑒定出來。另一方面， 由于gRNA識別序列較短（20 bp左右），靶點多造成脫靶的可能性越大［28］， 水稻等植物可以通過回交等手段來降低脫靶的影響。在利用CRISPR/Cas9技術進行水稻等植物相關性狀突變體的創建過程中， 需要綜合考慮合理選擇轉化受體及靶點位置和數量， 如本研究中對突變體千粒重性狀分析發現， 突變體的千粒重都比對照提高了5%以上，但與已知的tgw6突變體（313 bp缺失）會使日本晴產量增加15%［9］的結果不太一致， 推測可能是材料背景差異或者突變位點的差異引起的。

隨著人類對糧食的高產、高品質需求的不斷提高， 僅對基因進行定向改良是遠遠不夠的， 如何對特定育種材料進行多基因的一次性導入成為亟待解決的問題。隨著研究的不斷深入， 人們已經發現利用CRISPR/Cas9剪切形成的缺口可促進外源基因片段高效重組到基因組中， 這一發現已先后在細菌、酵母、老鼠、果蠅、斑馬魚、線蟲上取得了成功［29-35］。由于植物的特殊性， 使得依賴于CRISPR/Cas9的基因導入技術發展相對較慢， 即使如此， 有研究小組已經利用雙生病毒載體系統在煙草、番茄中取得了成功［36-37］。相信在1～2年內該技術也會在水稻中被成功應用， 這一技術的發展將會對水稻品種抗性、品質等改良起到重大推動作用， 具有廣闊的應用前景。

4 結論

獲得了類型較為豐富（多堿基缺失、插入等）的tgw6突變體， 為進一步應用于水稻的高產、穩產育種奠定了重要材料基礎。為快速創建稻米品質（fgr、Chalk）、雄性不育（tms5）等生產上有重要應用價值的水稻優異新種質提供了重要參考， 并有望為水稻種質資源創新提供安全、高效的新途徑， 具有重要的理論和實踐意義。

致謝： 感謝華南農業大學劉耀光研究員提供的pYLCRISPR/Cas9-MT（I）及gRNA載體（pYL-U3/U6ab-gRNAs）。

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Construction of tgw6 Mutants in Rice Based on CRISPR/Cas9 Technology

WANG Jia-Feng， ZHENG Cai-Min， LIU Wei， LUO Wen-Long， WANG Hui， CHEN Zhi-Qiang*， and GUO Tao*
National Engineering Research Center of Plant Space Breeding， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China

A set of tgw6 （Thousand-grain weight 6） mutants were constructed using CRISPR/Cas9 technology in this study. Three sites of 20 nt guide RNA （gRNA） targeted to the exon of TGW6 were designed and transcribed from the U3， U6a， or U6b promoters， respectively. The three target sites of gRNA were then ligated to the vector pYLCRISPR/Cas9-MT（I） based on golden gate cloning strategy. The recombinant plasmid was transferred to a rice cultivar， H447 （R819/Yuzhenxiang//R819 BC3F6） by Agrobacterium-mediated transformation. Sequencing for the genomic DNA of TGW6 locus in T0rice showed the mutagenesis frequency for TGW6 was more than 90%， including 51% of homozygous deletion mutations. Further analysis for the T1mutants showed that almost all the homozygous deletion mutants improved the thousand-grain weight significantly （more than 5%）. The successful tgw6 editing not only provided a series of tgw6 mutants for high and stable yield of rice but also proved that CRISPR/Cas9 is a facile and powerful means of rice genetic engineering for scientific and agricultural applications， which has important theoretical and practical significance for rice breeding.

Rice； Genome editing； CRISPR/Cas9； TGW6； Thousand-grain weight

10.3724/SP.J.1006.2016.01160

本研究由廣東省公益研究與能力建設轉型項目（20150209）， 國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2011AA10A101）和國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-01-12）資助。
This study was supported by Public Welfare Research and Capacity Building Transformation Funds in Guangdong （20150209）， the National High Technology Research and Development Program of China （863 Program） （2011AA10A101）， and the China Agricultural Research System （CARS-01-12）.
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（Corresponding authors）： 郭濤， E-mail： guoguot@scau.edu.cn， Tel： 020-38604903； 陳志強， E-mail： chenlin@scau.edu.cn， Tel：020-85283237

聯系方式： E-mail： bcjfwang@gmail.com， Tel： 020-38604903
Received（

）： 2015-12-17； Accepted（接受日期）： 2016-05-09； Published online（網絡出版日期）： 2016-05-23.
URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160523.0853.008.html