轉染Elf5基因的人卵巢癌干細胞增殖、侵襲能力及凋亡變化

仇影影，謝肖磊，邱玲琳，閆洪超

(1徐州醫學院研究生學院，江蘇徐州221002；2徐州醫學院附屬醫院)

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·基礎研究·

轉染Elf5基因的人卵巢癌干細胞增殖、侵襲能力及凋亡變化

仇影影1，謝肖磊1，邱玲琳1，閆洪超2

(1徐州醫學院研究生學院，江蘇徐州221002；2徐州醫學院附屬醫院)

目的觀察轉染Elf5基因的人卵巢癌干細胞增殖、侵襲能力及凋亡變化。方法將目的基因Elf5+EGFP克隆到載體pcDNA3.1中，構建重組質粒pcDNA3.1-Elf5+EGFP，轉入感受態細胞，挑選陽性克隆菌落，大量抽提質粒。培養人卵巢癌干細胞并分為重組質粒組、空質粒組、空白對照組。重組質粒組轉染pcDNA3.1-Elf5+EGFP真核表達載體，空質粒組轉染pcDNA3.1-EGFP空載質粒，空白對照組不進行轉染。采用Western blotting法檢測Elf5蛋白。分別于轉染后1、2、3、4、5、6 d采用MTT法檢測細胞增殖能力；轉染24 h后采用侵襲小室檢測細胞侵襲能力并計算穿膜細胞數；轉染24 h后流式細胞術檢測不同周期細胞及凋亡細胞。結果成功構建了pcDNA3.1-Elf5+EGFP真核細胞表達載體，重組質粒組細胞中Elf5蛋白穩定表達。轉染后1、2、3、4、5、6 d重組質粒組細胞增殖能力低于空白對照組和空質粒組(P均<0.05)。重組質粒組穿膜細胞數少于空質粒組、空白對照組(P均<0.05)。重組質粒組G0/G1期細胞百分比高于空質粒組、空白對照組(P均<0.05)。重組質粒組細胞凋亡率高于空質粒組、空白對照組(P均<0.05)。結論轉染ELF5基因的人卵巢癌干細胞增殖、侵襲能力受到抑制，細胞凋亡增多。

Elf5基因；卵巢癌；腫瘤干細胞；細胞增殖；細胞凋亡

在女性生殖系統惡性腫瘤中，卵巢癌惡性程度最高，病死率居于首位[1]。卵巢癌之所以易轉移和復發，根本原因在于腫瘤干細胞[2～4]。我們前期研究篩選出具有腫瘤干細胞特征的卵巢癌干細胞(以人HO8910細胞系為實驗對象)，經鑒定發現篩選出的細胞具有較強的分化、自我更新能力，并有多藥耐藥性較高的干細胞相關基因表達水平和體內成瘤特性[5]。Elf5是Ets基因家族成員之一，在腫瘤的發生、發展過程中發揮重要作用[6,7]。Elf5與卵巢癌干細胞的關系目前尚未見報道，為此，2015年1～10月，我們觀察了轉染Elf5基因的人卵巢癌干細胞增殖、侵襲能力及凋亡的變化，現報告如下。

1　材料與方法

1.1主要實驗材料DNA內切酶、DNA連接酶及DNA marker購自Fermentas公司；DNA凝膠回收試劑盒及瓊脂糖購自天根生化科技有限公司；中量抽提試劑盒購自杭州愛思進生物技術有限公司；無乙水醇、異丙醇、丙三醇及無水氯化鈣購自北京國藥集團化學試劑有限公司；人卵巢癌干細胞由本課題組保存；四甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國Sigma公司； Liptapfector脂質體轉染試劑購自碧云天生物技術有限公司；Elf5一抗及Transwell 小室購自美國Chemicon公司；大腸桿菌DH5α為本實驗室保存。

1.2pcDNA3.1- Elf5+EGFP載體的構建及鑒定目的基因上下游引物分別加BamHⅠ、EcoRⅠ及保護堿基，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成引物，將oligo溶解成50 μmol/L，進行兩輪PCR反應，利用Agarose電泳并切膠回收Elf5+EGFP基因片段。用BamHⅠ和EcoRⅠ分別對Elf5+EGFP基因片段和載體pcDNA3.1進行酶切，用DNA凝膠回收試劑盒回收。用T4DNA ligase連接雙酶切，得到Elf5+EGFP基因片段和線性化載體。氯化鈣法制備感受態細胞，將連接產物轉化感受態細胞，從平板上鑒定并挑選陽性克隆菌落，置于含LB培養基的試管中培養。抽提菌液質粒進行雙酶切鑒定并測序。測序結果與目的基因序列比對無誤后，將菌液接種于LB培養基，進行質粒抽提，獲得足夠的重組質粒。

1.3細胞分組與Elf5基因轉染人卵巢癌干細胞用含EGF、bFGF、Noggi、LIF的培養基培養，分為重組質粒組、空質粒組、空白對照組。重組質粒組轉染pcDNA3.1- Elf5+EGFP真核表達載體，空質粒組轉染pcDNA3.1-EGFP空載質粒，空白對照組不進行轉染。轉染結束后，用G418培養基對已轉染細胞進行篩選并傳代培養。Western blotting法檢測Elf5蛋白。

1.4細胞增殖能力觀察將三組細胞按1.5×104/孔分別接種于96孔培養板，分別于轉染后1、2、3、4、5、6 d后加入MTT工作液，繼續培養，最后加入二甲基亞砜終止反應。將96孔培養板置于BOIBASE2000全自動酶標儀上，在490 nm波長處測定吸光度值(A值)，代表細胞增殖能力。

1.5細胞侵襲能力觀察轉染24 h后采用侵襲小室檢測卵巢癌干細胞的體外侵襲能力。分離并提取各組細胞懸液，以105/孔將細胞接種于侵襲膜上并培養。培養12 h后去除膜上基質膠及殘留細胞，固定并進行染色，倒置顯微鏡下觀察并計算穿膜細胞數，反映細胞侵襲能力。

1.6不同周期細胞檢測轉染24 h后胰酶消化、洗滌并離心細胞，固定細胞，加100 μL PBS并吹打細胞，制成單細胞懸液，調整細胞濃度，用流式細胞儀分析不同周期細胞分布情況。

1.7凋亡細胞檢測轉染24 h后胰酶消化、洗滌并離心細胞，固定細胞，加100 μL PBS并吹打細胞，制成單細胞懸液，按annexin V-PI細胞凋亡雙染試劑盒說明書進行染色，采用流式細胞術測算細胞凋亡率。

2　結果

2.1pcDNA3.1- Elf5+EGFP載體構建及轉染情況酶切結果顯示，在1 518 bp位置出現明顯條帶，與預計擴增片段大小相符，對照組未擴增出條帶；DNA序列分析結果顯示，目的基因序列與GenBank中基因序列完全相同，目的基因插入方向正確，證實重組質粒pcDNA3.1- Elf5+EGFP構建成功。重組質粒組轉染質粒后，細胞中Elf5蛋白表達上調，而空質粒組及空白對照組未檢測到Elf5蛋白表達。

2.2各組細胞增殖能力比較轉染后1、2、3、4、5、6 d重組質粒組A值低于空白對照組和空質粒組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組轉染后不同時間A值比較

注：與重組質粒組相比，*P<0.05。

2.3各組細胞侵襲能力比較重組質粒組、空質粒組、空白對照組穿膜細胞數分別為(92.1±2.7)、(149.6±4.6)、(147.4±5.3)個，重組質粒組與空質粒組、空白對照組相比，P均<0.05。

2.4各組不同周期細胞分布比較重組質粒組G0/G1期細胞百分比高于空質粒組、空白對照組(P均<0.05)。見表2。

表2　各組不同周期細胞分布比較±s)

注：與重組質粒組相比，*P<0.05。

2.5各組細胞凋亡率比較重組質粒組、空質粒組、空白對照組細胞凋亡率分別為31.4%±1.9%、9.1%±2.2%、8.7%±1.5%，重組質粒組與空質粒組、空白對照組相比，P均<0.05。

3　討論

目前研究[8,9]表明，卵巢癌發生侵襲、轉移及復發與卵巢癌干細胞的無限增殖、自我更新和多向分化能力有密切關系。Ets家族成員在正常細胞的增殖、生長、凋亡過程中發揮重要作用[10]。Elf5屬于其成員之一，位于人類染色體11q13～15，此區域與其他脆性位點一樣，易出現雜合性缺失。Elf5的完整結構域包含參與蛋白間相互作用的結構域、與蘇氨酸/半胱氨酸核心序列結合的基序及兩個共性結構域[6]。Elf5基因在胎盤滋養細胞、上皮外分泌腺和人類乳腺等器官中均有表達，但表達程度各不相同[11～15]。正常情況下，Elf5不僅可調節腺泡細胞的產生，還可影響胚胎發育[16]。有學者[17]研究表明，Elf5基因的雜合性缺失可導致乳腺成體干細胞增加，促進乳腺癌發病。近年來國外眾多學者[18～20]也認為Elf5是乳腺癌發生發展過程中的潛在抑癌基因，有望成為乳腺癌新的治療靶點。關于Elf5基因對人卵巢癌干細胞生物學行為的影響，目前報道較少。

本研究首先成功構建了重組質粒pcDNA3.1- Elf5+EGFP，并將其成功轉染人卵巢癌干細胞，然后從多方面研究了Elf5在體外的一系列生物學作用。我們發現，重組質粒組細胞增殖能力低于空質粒組及空白對照組，表明Elf5基因對卵巢癌干細胞增殖具有明顯抑制及延緩作用。重組質粒組G0/G1期細胞百分比高于空質粒組、空白對照組，提示Elf5基因可抑制G0/G1期進展到S期、G2/M期，進一步推測Elf5基因對卵巢癌干細胞的增殖抑制作用可能與干擾細胞周期有關。侵襲小室實驗結果顯示，重組質粒組的穿膜細胞數少于空質粒組及空白對照組，表明Elf5基因可限制卵巢癌干細胞的侵襲及運動能力。本研究結果還顯示，重組質粒組細胞凋亡率高于其余兩組，提示Elf5基因不僅能抑制卵巢癌干細胞增殖，還可促進其凋亡。但對于Elf5基因通過何種機制影響卵巢癌干細胞的生物學行為，目前尚處于初級研究階段。在以后的研究中，我們還將進一步探索Elf5基因的具體作用機制。

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閆洪超(E-mail：1015058194@qq.com)

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A

1002-266X(2016)19-0025-03

2015-12-04)