乳礦物鹽復合粉免疫調節作用的研究

黃遠英，楊亞飛（湯臣倍健股份有限公司，廣東廣州510663）

乳礦物鹽復合粉免疫調節作用的研究

黃遠英，楊亞飛
（湯臣倍健股份有限公司，廣東廣州510663）

研究乳礦物鹽復合粉對小鼠免疫功能的調節作用。分別以0.375、0.75、2.25 g/kg·bw劑量的乳礦物鹽復合粉對小鼠連續灌胃30 d后，測定各項免疫指標。乳礦物鹽復合粉能促進小鼠淋巴細胞增殖轉化作用，提高小鼠的抗體生成細胞及血清溶血素水平，促進小鼠的單核-巨噬細胞的吞噬功能。乳礦物鹽復合粉具有增強免疫力功能作用。

乳礦物鹽；低聚半乳糖；乳鐵蛋白；免疫力

乳礦物鹽又名乳鈣、乳清礦物質濃縮物、乳清鈣，以乳清為原料，其主要成分是磷酸鈣，除此之外還包括蛋白質、乳糖及鋅、磷、鈉、鉀、鎂等豐富的營養成分，含鈣量約為23%～28%，其鈣磷比為2∶1（質量比），較利于人體吸收利用，作為一種新鈣源被廣泛用于各種食品［1］。

低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS），是一種具有天然屬性的功能性低聚糖。動物乳汁中存在微量GOS，而人母乳中含量較多，是母乳中重要的益生元，其安全性已受到廣泛認可。低聚半乳糖是唯一都能夠被人體腸內8大有益菌所利用的，其還能有效地促進腸道對鈣的吸收［2］。

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種多功能的蛋白質，含有人體所需的多種成分?？勺鳛槿梭w營養來源，補充鐵和氨基酸，又可作為預防和治療人類多種疾病的藥物，用于維持腸道內菌群平衡，防止感染和抵抗病毒，抑制腫瘤發生與轉移，阻礙體內產生自由基損傷機體等［3］。

本研究將乳礦物鹽、低聚半乳糖和乳鐵蛋白按一定比例進行復配，制得乳礦物鹽復合粉，對小鼠進行增強免疫力功能實驗，為開發增強免疫力的功能食品提供了理論參考。

1　材料與方法

1.1實驗動物

健康SPF級昆明種小鼠：山東大學動物實驗中心提供，生產許可證：SCXK（魯）20130009。

1.2樣品

乳礦物鹽復合粉（MCCP）：內容物為淡黃色粉狀，由湯臣倍健股份有限公司提供，推薦日服用建議劑量為4.5 g/袋。

1.3劑量選擇和受試物給予方式

實驗小鼠按隨機分組原則分為低劑量組（MCCPL，0.375 g/kg·bw）、中劑量組（MCCP-M，0.75 g/kg·bw）、高劑量組（MCCP-H，2.25 g/kg·bw）（分別相當于日服用建議劑量的5、10、30倍）及對照組（Control組）。每天1次，灌胃體積按20 mL/kg·bw，連續灌胃30 d。對照組以等體積的蒸餾水灌胃。

1.4主要儀器與試劑

1.4.1主要儀器

BL3100電子天平：德國賽多利斯公司；3-18K高速冷凍離心機：德國SIGMA公司；722型可見-紫外分光光度計：上?，F科分光公司；ELX800酶標儀：美國BIO-TEK公司；DYX-DHS-40X50隔水式電熱恒溫培養箱：上海市躍進醫療器械一廠；HWS-28恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；10 μL～100 μL微量加樣器：德國BRAND公司；DP71-IPP6.0光學顯微鏡：日本奧林巴斯株式會社；RE-5003旋轉蒸發儀：上海光學儀器廠。

1.4.2主要試劑

綿羊紅細胞（SRBC）、雞紅細胞（CRBC）、氧化型輔酶I，ConA、補體、Hank’s液青鏈霉素、MTT、小牛血清、PBS緩沖液、瓊脂糖：以上試劑均購自sigma公司；印度墨汁：購自上海信裕生物科技有限公司；1%冰醋酸：購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.5方法

1.5.1臟器體重比值測定

小鼠稱重后處死，取出胸腺、脾臟，去盡筋膜及表面血污，稱重，計算胸腺體重比值及脾臟體重比值。1.5.2遲發型變態反應

采用足趾增厚法。免疫后4天，測量左后足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射SRBC，注射后于24 h測量左后足跖部厚度，同一部位測量3次，取平均值。1.5.3ConA誘導的小鼠淋巴轉化實驗

取脾臟，制成細胞懸液，采用MTT法，波長570nm，酶標儀測定光密度。

1.5.4小鼠血清溶血素測定

分離血清，按血凝法觀察血細胞凝集程度，計算抗體積數。

1.5.5抗體生成細胞檢測

用脫纖維綿羊紅細胞免疫，取脾臟，制成脾細胞懸液，按Jerne改良玻片法，計數溶血空斑數。

1.5.6小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗

采用半體內法。制備雞紅細胞懸液，每只鼠腹腔注射，間隔30 min，腹腔注入生理鹽水2 mL，吸出腹腔洗液1 mL，移置37℃溫箱孵育30 min，然后，于生理鹽水中漂洗，晾干，以體積比1∶1丙酮—甲醇溶液固定，體積分數4%Giemsa-磷酸緩沖液染色3 min，再用蒸餾水漂洗晾干，光鏡下觀察。1.5.7小鼠碳廓清實驗

經尾靜脈注入稀釋的印度墨汁，并立即計時。注入墨汁后2 min及10 min分別從眼內眥靜脈叢取血20 μL，并將其加到2 mL處0.1%Na2CO3溶液中，用722分光光度計600 nm波長處測光密度值。

1.5.8NK細胞活性測定

取脾臟，制成細胞懸液，按乳酸脫氫酶（LDH）法，用酶標儀在490 nm處測定光密度值。

1.6實驗數據統計

實驗數據用SPSS軟件對各實驗原始數據進行方差齊性檢驗，滿足“方差齊”要求的數據資料用多個實驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計處理；對方差不齊的數據資料進行適當的變量轉換，待滿足“方差齊”要求后，用轉換所得的數據進行統計處理。

2　結果

2.1乳礦物鹽復合粉對小鼠臟器體重比值的影響

2.1.1脾臟/體重比值

小鼠臟器體重比值試驗中，與對照組相比，高、中、低各劑量組小鼠的脾臟/體重比值和胸腺/體重比值均無顯著性差異，結果無統計學意義（P＞0.05）。結果見表1。經方差分析，P=0.783，各劑量組分別與水對照組小鼠相比，其脾臟/體重比值均無顯著性差異（P＞0.05），見表1。

表1　乳礦物鹽復合粉臟器/體重比值的影響Table 1　Effects of milk calcium compound powder on mice immune organ/body weigh ratio（±s，n=10）

表1　乳礦物鹽復合粉臟器/體重比值的影響Table 1　Effects of milk calcium compound powder on mice immune organ/body weigh ratio（±s，n=10）

注：-表示灌胃等體積蒸餾水。

組別　劑量/ （g/kg·bw）脾臟/體重比值/ （mg/g）胸腺/體重比值/ （mg/g）對照組　-　5.119±0.619　 4.208±0.727 MCCP-L　0.375　4.989±0.883　4.685±0.884 MCCP-M　0.75　5.294±0.892　4.677±0.613 MCCP-H　2.25　5.327±0.909　4.893±1.083

2.1.2胸腺/體重比值

經方差分析，P=0.333，各劑量組分別與水對照組小鼠相比，其胸腺/體重比值均無顯著性差異（P＞0.05），見表1。

2.2乳礦物鹽復合粉對小鼠遲發型變態反應（DTH）的影響

經方差分析，P=0.820，各劑量組分別與水對照組小鼠相比，其足跖腫脹度差異無顯著性（P＞0.05），結果見表2。

2.3ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗（MTT法）

經方差分析，P=0.006。低劑量組與水對照組小鼠相比，其淋巴細胞增殖能力無顯著性差異（P＞0.05）；中、高劑量組與水對照組小鼠相比，其淋巴細胞增殖能力有顯著性差異（P＜0.05）。結果見表3。

表3　乳礦物鹽復合粉對ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化能力的影響Table 3　Effects of milk calcium compound powder on lymphocyte transformation test induced by ConA in mice（±s，n=10）

表3　乳礦物鹽復合粉對ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化能力的影響Table 3　Effects of milk calcium compound powder on lymphocyte transformation test induced by ConA in mice（±s，n=10）

注：-表示灌胃等體積蒸餾水；與對照組比較，*P＜0.05。

組別　劑量/（g/kg·bw）　淋巴細胞增值能力/mm對照組　-　0.235±0.033 MCCP-L　0.375　0.258±0.033 MCCP-M　0.75　0.278±0.032* MCCP-H　2.25　0.298±0.052*

表2　乳礦物鹽復合粉對小鼠遲發型變態反應（DTH）的影響Table 2　Effects of milk calcium compound powder on DTH against SRBC（±s，n=10）

表2　乳礦物鹽復合粉對小鼠遲發型變態反應（DTH）的影響Table 2　Effects of milk calcium compound powder on DTH against SRBC（±s，n=10）

注：-表示灌胃等體積蒸餾水。

組別　劑量/（g/kg·bw）　足跖腫脹度/mm對照組　-　0.605±0.219 MCCP-L　0.375g　0.614±0.328 MCCP-M　0.75　0.654±0.301 MCCP-H　2.25　0.708±0.203

2.4乳礦物鹽復合粉對小鼠血清溶血素產生的影響

經方差分析，P=0.002。低劑量組與水對照組小鼠相比，其小鼠血清抗體積數無顯著性差異（P＞0.05）；中、高劑量組與水對照組小鼠相比，其小鼠血清抗體積數有顯著性差異（P＜0.05）。結果見表4。

表4　乳礦物鹽復合粉對小鼠血清溶血素產生的影響Table 4　Effects of milk calcium compound powder on serum HC50（±s，n=10）

表4　乳礦物鹽復合粉對小鼠血清溶血素產生的影響Table 4　Effects of milk calcium compound powder on serum HC50（±s，n=10）

注：-表示灌胃等體積蒸餾水；與對照組比較，*P＜0.05。

組別　劑量/（g/kg·bw）　抗體積數對照組　-　171.8±21.1 MCCP-L　0.375　176.8±17.0 MCCP-M　0.75　198.2±17.1* MCCP-H　2.25　201.6±22.1*

2.5抗體生成細胞檢測（Jerne改良玻片法）

經方差分析，P=0.002。低劑量組與水對照組小鼠相比，其小鼠抗體生成細胞數無顯著性差異（P＞0.05）；中、高劑量組與水對照組小鼠相比，其小鼠抗體生成細胞數有顯著性差異（P＜0.05）。結果見表5。

表5　乳礦物鹽復合粉對小鼠抗體生成細胞數的影響Table 5　Effects of milk calcium compound powder on the ability of antibody（±s，n=10）

表5　乳礦物鹽復合粉對小鼠抗體生成細胞數的影響Table 5　Effects of milk calcium compound powder on the ability of antibody（±s，n=10）

注：-表示灌胃等體積蒸餾水；與對照組比較，*P＜0.05。

組別　劑量/（g/kg·bw）　PFC/（×103/WSC）對照組　-　40.80±25.00 MCCP-L　0.375　51.52±23.67 MCCP-M　0.75　74.25±24.81* MCCP-H　2.25　88.65±36.26*

2.6乳礦物鹽復合粉對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響

各劑量組與水對照組小鼠相比，其腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬百分率及吞噬指數均無顯著性差異（P＞0.05），結果見表6。

表6　乳礦物鹽復合粉對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響Table 6　Effects of milk calcium compound powder on macrophage phagocytosis in rats（±s，n=10）

表6　乳礦物鹽復合粉對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響Table 6　Effects of milk calcium compound powder on macrophage phagocytosis in rats（±s，n=10）

注：-表示灌胃等體積蒸餾水。

組別　劑量/（g/kg·bw）　吞噬率/%　吞噬指數對照組　-　25.8±11.2　0.37±0.12 MCCP-L　0.375　31.0±13.2　0.45±0.15 MCCP-M　0.75　34.5±14.8　0.47±0.17 MCCP-H　2.25　37.7±16.4　0.51±0.18

2.7小鼠碳廓清實驗

經方差分析，P=0.008。低劑量組與水對照組小鼠相比，其對小鼠單核-巨噬細胞吞噬指數無顯著性差異（P＞0.05）；中、高劑量組與水對照組小鼠相比，其對小鼠單核-巨噬細胞吞噬指數有顯著性差異（P＜0.05），結果見表7。2.8乳礦物鹽復合粉對小鼠NK細胞活性的影響

表7　乳礦物鹽復合粉對小鼠單核-巨噬細胞碳廓清能力的影響Table 7　Effects of milk calcium compound powder on carbon clearance index（K）（±s，n=10）

表7　乳礦物鹽復合粉對小鼠單核-巨噬細胞碳廓清能力的影響Table 7　Effects of milk calcium compound powder on carbon clearance index（K）（±s，n=10）

注：-表示灌胃等體積蒸餾水；與對照組比較，*P＜0.05。

組別　劑量/（g/kg·bw）　吞噬指數對照組　-　4.563±0.584 MCCP-L　0.375　5.035±0.531 MCCP-M　0.75　5.350±0.762* MCCP-H　2.25　5.562±0.659*

經方差分析，P=0.174。各劑量組與水對照組小鼠相比，其NK細胞活性率均無顯著性差異（P＞0.05）。結果見表8。

表8　 乳礦物鹽復合粉對小鼠NK細胞活性的影響Table 8　Effects of milk calcium compound powder on NK cell activity（±s，n=10）

表8　 乳礦物鹽復合粉對小鼠NK細胞活性的影響Table 8　Effects of milk calcium compound powder on NK cell activity（±s，n=10）

注：-表示灌胃等體積蒸餾水。

組別　劑量/（g/kg·bw）　NK細胞活性率/%對照組　-　17.27±4.34 MCCP-L　0.375　12.72±2.95 MCCP-M　0.75　14.20±5.75 MCCP-H　2.25　14.68±5.46

3　小結

分別經口給予小鼠0.375、0.75、2.25 g/kg·bw劑量的乳礦物鹽復合粉30 d，對小鼠體重增長無不良影響，對小鼠脾臟體重比值和胸腺體重比值無影響，小鼠細胞免疫功能、體液免疫功能、小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能各中高劑量組指標與對照組比較均有顯著差異（P﹤0.05），且有統計學意義，結果均為陽性。小鼠NK細胞活性測定結果為陰性。按照《保健食品檢驗與評價技術規范》對增強免疫力功能保健食品的判定標準可知，乳礦物鹽復合粉具有增強小鼠免疫功能的作用。

［1］邵勝榮，孫俊.乳礦物鹽的研究動態及應用進展［J］.添加劑與營養，2013，1（2）：58-59

［2］薛雅鶯，袁衛濤，楊海軍，等.低聚半乳糖的特性及應用前景［J］.發酵科技通訊，2011，40（3）：50-52

［3］李林，劉思國，成國祥.乳鐵蛋白的結構與功能［J］.食品與藥品，2006，8（12A）：28-31

Study on the Immunoregulatory Function of Milk Calcium Compound Powder

HUANG Yuan-ying，YANG Ya-fei （BY-HEALTH CO.LTD.，Guangzhou 510663，Guangdong，China）

To study the immunoregulation effect of milk calcium compound powder in mice.After administration of milk calcium compound powder for 30 days conscutively with the dose of 0.375，0.75，2.25 g/kg·bw，immunological indexes were measured.Proliferation and transformation of spleen lymphocytes in the mice was increased.The number of antibody-producing cells and the level of serum hemolysin was enhanced.Phagocytic function of monocyte-macrophage was promoted.Milk calcium compound powder can strengthen the immunofunction in mice.

milkcalcium；galactooligosaccharides；lactoferrin；immunofunction

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.047

黃遠英（1982—），女（漢），公共營養師，本科，研究方向：功能食品與藥物制劑。

2015-08-14