浸泡發芽處理對燕麥多酚組成及其抗氧化活性的影響

趙　霞,張文斌,*,楊瑞金,韓　飛

(1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.國家糧食局科學研究院,北京 100037)

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浸泡發芽處理對燕麥多酚組成及其抗氧化活性的影響

趙霞1,張文斌1,*,楊瑞金1,韓飛2,*

(1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.國家糧食局科學研究院,北京 100037)

對燕麥進行浸泡發芽處理,測定其浸泡發芽過程中多酚組成和抗氧化活性的變化情況,并對其相關性進行分析。結果表明:浸泡處理降低了燕麥中游離型多酚的含量,提高了結合型總酚和總黃酮含量,抗氧化性變化不顯著;發芽處理能夠提高燕麥游離型和結合型多酚含量及抗氧化活性,其中游離型提高最為顯著。發芽6 d,游離型總酚含量提高至5.7倍,總黃酮含量提高至3.2倍,且游離型占總酚的比例由原來的45.5%提高到70.3%。液相分析發現游離酚酸總量降低6%,總酚的提高主要體現在蒽酰胺上,其含量從172.41 μg/g提高到1469.02 μg/g。燕麥經浸泡發芽處理后多酚含量與抗氧化性顯著相關,且多酚種類對其抗氧化活性有一定影響。

燕麥,浸泡，發芽,多酚,抗氧化活性

燕麥是我國八大糧食作物之一,其蛋白質和脂肪品質及含量均居于谷物之首,是最好的全價營養食品。此外,它作為一種全谷物食品,保留了麩皮和胚乳中的生物活性物質——多酚[1],并在體內表現出抗氧化、抗炎性、抗過敏等功能,有效增強人體免疫防御能力。多酚是指一類在分子結構上具有多個酚羥基的化合物,它具有良好的抗氧化活性,能夠清除體內自由基,防止脂質、DNA和蛋白質等大分子的損傷,降低心腦血管疾病、癌癥等慢性病的發生機率[2]。燕麥中的多酚有酚酸、黃酮及其特有的燕麥蒽酰胺,以游離態和結合態形式存在[3]。燕麥中的酚酸可分為苯甲酸和肉桂酸兩類,常見的有阿魏酸、咖啡酸、對香豆酸、香草酸、對羥基苯甲酸、丁香酸等[4];蒽酰胺是羥基肉桂酸及其衍生物和鄰氨基苯甲酸及其衍生物通過酰胺鍵相連而成的一種酚類化合物,常見有Bp、Bf、Bc[5];而黃酮在燕麥中含量較低,種類較為有限。研究表明,多種生物活性物質的加成協同作用表現出的抗氧化活性要比單一物質更強[6]。

發芽作為一種谷物加工處理方式,能夠軟化組織結構、提高營養價值、降低抗營養因子的作用[7]。通過發芽處理,籽粒內部的相關酶被激活,引發一系列的生理生化變化[8]。胚乳中的營養物質淀粉被分解為還原糖[9],蛋白質降解,可溶性蛋白含量提高[10];胚發育成根和芽。有研究表明,發芽過程能夠顯著提高燕麥中多酚的含量[7],但對于具體的多酚在發芽過程中含量的變化情況鮮有報道。本文主要研究各種游離型和結合型酚酸、蒽酰胺及其總酚、總黃酮和抗氧化活性的動態變化情況,以期為燕麥的開發利用提供數據依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

定莜4號裸燕麥國家糧食局科學研究院糧油營養研究組提供;沒食子酸、阿魏酸國藥集團化學試劑有限公司;咖啡酸、對羥基苯甲酸、對香豆酸、丁香酸、芥子酸、原兒茶酸、香草酸、蘆丁 阿拉丁試劑(上海)有限公司;Bp、Bf、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2,4,6-三吡啶基-1,3,5-三嗪(TPTZ)、水溶性維生素E(Trolox)、Folin-Ciocalteau試劑Sigma公司;t2、t3發芽燕麥提取濃縮制備制得,并經質譜鑒定;色譜純乙腈百靈威科技有限公司;其他藥品或試劑均為國產分析純。

A11型粉碎機廣州儀科實驗技術有限公司;LRH-150型生化培養箱上海一恒科技有限公司;KQ5200DE型超聲清洗機昆山市超聲儀器有限公司;RV10型旋轉蒸發儀廣州儀科實驗技術有限公司;TGL-16M型冷凍離心機上海盧湘離心機儀器有限公司;723N型可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司;DKY-II型恒溫回轉式搖床上海杜科自動化設備有限公司;L-2000型高效液相色譜儀日本日立公司。

1.2實驗方法

1.2.1燕麥浸泡發芽實驗浸泡發芽處理參照文獻[8]方法進行。燕麥籽粒挑選除雜后,用2%次氯酸鈉溶液室溫下浸泡15 min進行消毒,去離子水反復沖洗干凈,燕麥籽粒于16 ℃培養箱中用去離子水避光浸泡12 h。取出部分樣品作為浸泡樣,其余樣品瀝干水分后平鋪在自制發芽盤中于16 ℃培養箱中避光連續發芽6 d,每12 h 澆水一次,保持相對濕度95%以上。每隔48 h 取樣。所有樣品取樣后立即冷凍干燥,備用。

1.2.2燕麥多酚的提取參照文獻[11-12]方法稍作修改。燕麥籽粒粉碎過60目篩,經脫脂處理后,精確稱取2 g樣品,用20 mL 80%丙酮溶液20 ℃超聲提取30 min,3840×g離心10 min,收集上清液,殘渣按上述方法重復提取兩次,合并提取液于45 ℃下真空旋轉蒸發至干,甲醇復溶,定容至5 mL,即為游離型提取液,密封-80 ℃低溫保存。游離型提取后的殘渣,用100 mL 2 mol/L NaOH溶液25 ℃搖床振蕩提取60 min。用6 mol/L HCl調pH至2～3,然后用乙酸乙酯萃取3次。合并乙酸乙酯萃取液45 ℃下真空旋轉蒸發至干,甲醇定容至5 mL,即為結合型提取液,密封-80 ℃低溫保存。

1.2.3總酚含量的測定參照文獻[13]方法進行。取50 μL提取物于試管中,加1 mL去離子水,和125 μL Folin-Ciocalteau試劑(用前稀釋一倍),混勻。靜置8 min,加375 μL 7% Na2CO3,補水至2.5 mL,室溫避光靜置顯色2 h,于765 nm下測定吸光值,以甲醇做空白,以沒食子酸當量計(μg GAE/g)。

1.2.4總黃酮含量的測定參照文獻[13]方法進行。取250 μL 提取物于試管中,加1.25 mL去離子水,75 μL 5% NaNO2溶液,反應6 min,加入150 μL 10% Al(NO3)3·9H2O溶液,反應5 min,加入500 μL 1 mol/L的NaOH,補水至2.5 mL,充分混勻,510 nm下測定吸光值,以蘆丁當量計(μg RE/g)。

1.2.5高效液相色譜分析條件采用安捷倫Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),柱溫30 ℃,流速0.8 mL/min,進樣量10 μL,流動相:A為0.1%甲酸水溶液,B為乙腈。洗脫梯度:0～10 min,97%～95% A;10～35 min,95%～85% A;35～45 min,85%～80% A;45～55 min,80%～60% A;55～60 min,60%～50% A;60～63 min,50%～40% A;63～65 min,40%～97% A。每次進樣前平衡10 min。檢測波長:280 nm。

1.2.6DPPH自由基清除能力的測定采用文獻[13]的方法,適當稀釋的提取液0.2 mL加3.8 mL 0.1 mmol/L的DPPH自由基甲醇溶液,漩渦混勻后置避光處30 min,515 nm下測定吸光值,結果以Trolox當量計(μmol TE/g)。

1.2.7ABTS自由基清除能力的測定采用文獻[14]的方法,適當稀釋的提取液0.15 mL和2.85 mL ABTS+·稀釋液,漩渦混勻后置于避光處30 min,734 nm下測定吸光值,以Trolox 當量計(μmol TE/g)。

1.2.8FRAP鐵離子還原能力采用文獻[13]的方法,適當稀釋的提取液0.15 mL和2.85 mL FRAP工作液,漩渦混勻后置于避光處30 min,593 nm下測定吸光值,以Trolox 當量計(μmol TE/g)。

2　結果與分析

2.1燕麥浸泡發芽過程中總酚、總黃酮含量的變化

燕麥浸泡發芽過程中的總酚、總黃酮含量測定結果見圖1。浸泡發芽處理后,燕麥中總酚和總黃酮含量的變化趨勢基本一致。由圖1可以看出,與原樣相比,浸泡處理降低了游離型總酚、總黃酮含量,結合型總酚、總黃酮含量經浸泡處理后略有提高。

圖1　燕麥浸泡發芽過程中總酚總黃酮的變化趨勢Fig.1　Changes of total phenolic content and total flavonoid content in oat during soaking and germination注:A:總酚含量;B:總黃酮含量。

浸泡過程中,部分游離型多酚溶解到水中,并在多酚氧化酶作用下,燕麥籽粒中的游離型總酚、總黃酮含量降低;同時浸泡能夠軟化燕麥籽粒結構,使得與細胞壁多糖結合的部分結合型多酚更容易通過堿水解提取出來,提高了可提取的結合型總酚、總黃酮的含量。

表1　燕麥浸泡發芽過程中游離型和結合型酚酸的含量Table 1　Content of free and bound phenolic acids in oat during soaking and germination

注:ND:未檢出;

發芽過程能夠顯著提高游離型和結合型總酚、總黃酮含量,且隨著發芽時間的延長,提高效果更明顯。發芽6 d,游離型總酚、總黃酮含量從552.89 μg/g和204.64 μg/g分別提高到3145.05 μg/g和654.57 μg/g,結合型總酚、總黃酮含量從661.50 μg/g和81.47 μg/g分別提高到1325.43 μg/g和180.96 μg/g。游離型總酚含量的提高顯著高于結合型。發芽6 d的燕麥中,游離型總酚占總酚比例由原來的45.5%提高到70.3%。

徐建國[15]對燕麥發芽處理3 d,發現燕麥發芽過程中游離酚、結合酚含量均提高,且結合酚依然為主要存在形式。許效群等人[16]對燕麥進行了發芽8 d處理,結果表明燕麥發芽過程中,總酚含量整體呈上升趨勢,且發芽6 d為最佳萌發期。這與付曉燕等人[17]的研究結果一致。Xu等人[18]研究表明,短期浸泡處理對總酚含量無顯著影響,發芽處理降低了結合型酚酸的含量,提高了游離型和總酚的含量。這與我們的研究結果不一致,可能是由于堿提取時間的不同,得到的結合型酚酸含量有差異[14]。

2.2燕麥浸泡發芽過程中酚酸及蒽酰胺含量的變化

9種酚酸標品在280 nm下的高效液相色譜圖見圖2。燕麥浸泡發芽過程中游離型和結合型各種酚酸含量的變化情況見表1。經過浸泡處理后,游離型肉桂酸均有所降低,其總量減少27%,而苯甲酸含量略有提高,總酚酸含量減少為原來的80%。與游離型酚酸變化趨勢相似,結合型酚酸中苯甲酸類含量提高(23%),肉桂酸類含量降低(10%),總酚酸含量減少9%。

圖2　9種酚酸混標溶液的高效液相色譜Fig.2　HPLC chromatogram of standard phenolic substances注:酚酸濃度均為100 μg/mL,1～9依次為沒食子酸、 原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、 丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸。

發芽過程中游離型苯甲酸的含量有顯著提高。發芽6 d后,樣品中檢測出原樣中未檢測到的原兒茶酸。但對羥基苯甲酸含量在發芽2 d時含量是原樣含量的2倍,隨著發芽時間的延長,含量略有降低。對于游離型肉桂酸,咖啡酸、阿魏酸和芥子酸含量在發芽初期即減少至檢測不出,但阿魏酸和肉桂酸在發芽6 d含量略有回升。經過發芽處理,6 d后苯甲酸總量為原樣的3.5倍,肉桂酸總量降低為原樣的15%,酚酸總量降低6%。結合型酚酸經過發芽處理含量均有所上升,其中香草酸和丁香酸在發芽4 d時含量達到最大值。阿魏酸含量提高最為顯著。苯甲酸含量為原樣的1.9倍,肉桂酸總量為原樣的2.7倍,總酚酸含量提高2.6倍。

表2　燕麥浸泡發芽過程中游離型和結合型蒽酰胺的含量Table 2　Content of free and bound avenanthramides in oat during soaking and germination

4種蒽酰胺標品在280 nm下的高效液相色譜圖見圖3。燕麥浸泡發芽過程中游離型和結合型蒽酰胺含量的變化情況見表2。經過浸泡處理,游離型和結合型蒽酰胺含量均有所降低。發芽處理能夠顯著提高游離型蒽酰胺的含量,其中t2和t3的提高最為顯著。發芽6 d,Bp和Bf含量提高4倍左右,而t2和t3含量分別提高為原樣的26.7倍和16.6倍。游離型蒽酰胺總量提高為原樣的8.5倍。結合型蒽酰胺經過發芽處理,各種蒽酰胺含量均有所上升,其中發芽2 d檢測到原樣中未檢測到的t2。發芽6 d,總蒽酰胺含量為原樣的1.8倍。

圖3　4種蒽酰胺混標溶液的高效液相色譜圖Fig.3　HPLC chromatogram of standard avenanthramide substances注:蒽酰胺濃度均為100 μg/mL,1～4依次為Bp,Bf,t2,t3。

分析酚酸和蒽酰胺液相數據可知,發芽燕麥中游離型多酚含量的提高主要體現在蒽酰胺含量的增加上,且蒽酰胺含量的提高非常顯著。結合型酚酸和蒽酰胺經過發芽處理含量也均有提高。

目前對發芽燕麥中各種酚酸組分具體含量的報道較少。Xu等人[18]對燕麥浸泡發芽過程中的主要多酚含量進行定量分析,發現浸泡處理后沒食子酸、咖啡酸、對香豆酸和阿魏酸含量隨著浸泡時間的延長而降低,發芽4 d過程中,沒食子酸和咖啡酸含量先提高后降低,對香豆酸和阿魏酸含量表現出持續增長的趨勢。蒽酰胺含量經過浸泡和發芽處理后含量顯著提高,但浸泡初期變化不顯著。這一趨勢與我們的研究結果有一致的地方,而沒食子酸、咖啡酸和2c含量的差異,可能是由于燕麥品種的不同而導致的。付曉燕等人[19]研究了燕麥發芽后游離酚類物質的組成變化,發現發芽處理后游離型酚酸種類含量明顯減少,游離型蒽酰胺的種類和相對含量顯著提高,這與我們的研究結果有一致的地方。此外,他們還對燕麥蒽酰胺疑似物進行結構鑒定,確定了燕麥中主要蒽酰胺種類為Bc、Bp、Bf、t2和t3。

表3　燕麥中游離型和結合型多酚與抗氧化活性的相關性Table 3　Correlations between antioxidant activities and polyphenol in free and bound fractions of oats

注:**表示在0.01水平上顯著相關。

D有研究發現發芽過程中蒽酰胺含量的提高伴隨著羥氨基苯甲酸-N-羥基肉桂酸轉移酶(HHT)活性的提高和多酚氧化酶(PO)活性的降低[20]。HHT能夠催化縮合鄰氨基苯甲酸和羥甲基肉桂酸CoA酯形成蒽酰胺[21],多酚氧化酶能夠氧化酚酸、蒽酰胺等多酚。

圖4　燕麥浸泡發芽過程中抗氧化活性的變化趨勢Fig.4　Changes of antioxidant activities during oat soaking and germination

2.3燕麥浸泡發芽過程中抗氧化活性的變化

DPPH自由基清除能力(DPPH+·)、ABTS自由基清除能力(ABTS·)和FRAP鐵離子還原能力(FRAP)三種指標用來分析測定燕麥浸泡發芽過程中的抗氧化性變化情況。燕麥中游離型和結合型提取物的抗氧化活性變化情況如圖4。分析圖表可知,抗氧化活性在浸泡與發芽過程中的變化趨勢與總酚、總黃酮的趨勢相似?？寡趸钚越涍^浸泡處理后變化不顯著,隨著發芽時間的延長,抗氧化活性顯著提高,這與付曉燕等人[17]的研究結果一致。浸泡發芽過程中,結合型DPPH·和ABTS自由基清除能力均略高于游離型,而游離型FRAP指標在發芽過程中略高于結合型。這可能是不同抗氧化指標的原理不同導致的。徐建國[22]分別對原糧和發芽提取物進行抗氧化實驗,發現發芽樣品在質粒DNA損傷的保護作用要優于原糧但在清除羥基自由基實驗中效果低于原糧或與其相當。

燕麥中游離型和結合型多酚與抗氧化活性的相關性見表3。分析可知,游離型和結合型總酚、總黃酮和蒽酰胺含量與抗氧化指標存在顯著相關性,不同種類的多酚與抗氧化指標間的相關性不盡相同,并在結合型中表現尤為突出,說明多酚的含量也是影響抗氧化活性的因素。

3　結論

浸泡處理對燕麥中多酚影響較小,燕麥中游離型和結合型肉桂酸含量減少,苯甲酸含量略有提高,但總酚酸、蒽酰胺含量均有所降低。發芽處理顯著提高燕麥中游離型和結合型多酚的含量。發芽6 d檢測出原樣中未檢測到的游離型原兒茶酸,苯甲酸含量略有提高,多酚含量的提高主要體現在蒽酰胺上,總蒽酰胺含量由172.41 μg/g提高到1469.02 μg/g;但游離型肉桂酸含量隨著發芽過程的進行降低至檢測不出。結合型總酚酸提高1.6倍,總蒽酰胺提高1.8倍。同時,浸泡發芽處理后的燕麥多酚與抗氧化性表現出顯著的相關性。

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Polyphenol composition and antioxidant activity of oat as affected by soaking and germination

ZHAO Xia1,ZHANG Wen-bin1,*,YANG Rui-jin1,HAN Fei2,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology and School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2. Academy of State Administration of Grain,No.11 Baiwanzhuang Street,Xicheng District,Beijing 100037,China.)

In this study,the effect of soaking and germination on polyphenol composition and antioxidant activities of oat,as well as the correlations of polyphenol content and antioxidant activities were evaluated. Total phenolic content(TPC)and total flavonoid content(TFC)in free fraction were decreased after soaking,while TPC and TFC in bound fraction were increased slightly. Antioxidant activities showed limited change after soaking. Germination increased TPC,TFC and antioxidant activities significantly,especially in free fraction. Free TPC and TFC were increased by 470% and 220% times,respectively,after 6 d germination. The free fraction constituted 45.5% total phenolics before and increased significantly to 70.3% after germination. Specific phenoilc acids and avenanthramides were detected by HPLC. The content of free total phenolic acids were decreased by 6%,and total avenanthramides were increased from 172.41 μg/g to 1469.02 μg/g after 6-day germination. Significant positive correlations were observed between polyphenol content and antioxidant properties of processed oat.

oat;soaking;germination;polyphenol;antioxidant activity

2016-01-14

趙霞(1990-),女,碩士研究生,研究方向:食品加工與配料，E-mail:zhaoxia_26@163.com。

張文斌(1979-),男，博士，研究方向：食品加工與配料研究開發，E-mail:wbzhang@jiangnan.edu.cn。

韓飛(1974-),女，博士，副研究員，研究方向：糧油營養及健康特性研究，E-mail:hf@chinagrain.org。

燕麥與豌豆營養健康特性研究與基礎數據庫的建立(201313011-6-4);“江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心”項目資助。

TS210.1

A

1002-0306(2016)15-0101-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.011