長雙歧桿菌優勢菌株的高通量篩選

宗方方,譚　俊,邵　雷,陳代杰,張駿梁,錢志祥,3,張素姬,4

(1.中國醫藥工業研究總院上海醫藥工業研究院 創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室,上海 201203;2.上海師范大學 生命與環境科學學院,上海 200234;3.中國藥科大學工學院,江蘇南京 211198;4.中國藥科大學 生命科學與技術學院,江蘇南京 211198)

?

長雙歧桿菌優勢菌株的高通量篩選

宗方方1,2,譚俊1,*,邵雷1,陳代杰1,張駿梁1,錢志祥1,3,張素姬1,4

(1.中國醫藥工業研究總院上海醫藥工業研究院 創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室,上海 201203;2.上海師范大學 生命與環境科學學院,上海 200234;3.中國藥科大學工學院,江蘇南京 211198;4.中國藥科大學 生命科學與技術學院,江蘇南京 211198)

本文通過96孔深孔板微型化培養和酶標儀快速檢測,建立了簡單、快速、準確且自動化水平較高的雙歧桿菌高通量篩選方法。經過高通量篩選獲得長雙歧桿菌優勢菌株BL01,其搖瓶發酵活菌數由5.4×108CFU/mL提高到1.53×109CFU/mL,與原始菌株相比約提高3倍;7 L罐發酵活菌數由3.9×109CFU/mL提高到1.67×1010CFU/mL,約提高4.3倍,且多次傳代均能維持在較高活菌水平。此法簡單且大大降低篩選成本,對其他微生物菌株的大規模篩選具有重要參考價值。

長雙歧桿菌,96孔深孔板,高通量篩選,自然選育

雙歧桿菌(Bifidobacterium)是1899年由法國學者Tissier從母乳喂養的嬰兒糞便中分離出的一種厭氧的革蘭氏陽性桿菌[1]。它是人體消化道內具有益生作用的優勢菌群,在促進人體發育、維持和提高免疫力、延緩機體衰老、抗腫瘤等方面起著重要的作用[2-7],雙歧桿菌已成為人體健康的重要指標之一[8],有關雙歧桿菌的微生態制劑的研究成為一大熱點,并廣泛應用于食品、保健和醫療等領域[9]。研究表明,維持益生菌功能的最低活菌濃度應高于107CFU/mL[10]。

菌種是發酵技術的源頭,菌種發酵水平是決定企業產品能否參與市場競爭的技術保證?，F有國內的菌種選育技術從誘變育種、雜交育種發展到代謝工程育種和系統生物學育種,已大大提高了微生物育種的效果,但是,與之配套的高通量篩選技術還處于滯后狀態,嚴重制約了菌種選育研究工作的展開[11-12]。高通量篩選(High throughput screening,HTS)技術是20世紀80年代發展起來的一種用于新化合物開發及目的菌種選育等的高新技術,由于具備微量、高效、靈敏、準確、可重復等特點,引起微生物技術研究者的極大興趣。雙歧桿菌作為用于食品及藥品的益生菌,其優勢菌群的獲得不能經過誘變,只能通過自然選育,而傳統的搖瓶選育方法工作量大,費時費力,很難篩選到高活力的優勢菌株。擴大篩選量來有效減少隨機篩選的盲目性是提高育種效率的一個重要方面,也是菌種選育過程成敗的一個關鍵步驟[13]。因此,使用現有的通用低成本儀器設備,自主開發簡便、快速、精準、高效的高通量篩選技術具有重要意義。高通量篩選方法不僅能有效克服傳統篩選中的漏篩問題,更具有簡單、快速、準確且自動化水平較高的特點,大大降低篩選成本,對其他益生菌等菌株的大規模篩選同樣具有重要的參考價值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

長雙歧桿菌(Bifidobacterium.longum)中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC6187)。

斜面培養基(g/L):牛肉膏10.0,蛋白胨5.0,酵母粉3.0,D(+)-葡萄糖5.0,可溶性淀粉1.0,氯化鈉5.0,無水乙酸鈉3.0,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5,瓊脂粉15.0,pH6.8;種子培養基(g/L):牛肉膏10.0,蛋白胨5.0,酵母粉3.0,D(+)-葡萄糖5.0,可溶性淀粉1.0,氯化鈉5.0,無水乙酸鈉3.0,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5,pH6.8;發酵培養基(g/L):安琪FP103蛋白胨17.0,安琪FM405酵母粉16.0,D(+)-葡萄糖22.0,氯化鈉5.0,無水乙酸鈉3.0,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5,低聚異麥芽糖4.0,pH6.8。

電子天平,PB-10酸度計，8道移液器Sartorius;酶標儀Thermo Scientific;厭氧培養箱Ruskinn 400M;立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.2實驗方法

1.2.1高通量篩選流程菌種的自然分離→高通量初篩→平行復篩→搖瓶驗證→罐發酵驗證→穩定性考察

1.2.2菌種的自然分離96深孔板每孔種子培養基裝液量為1 mL,取1支原始菌株6187的甘油管,等分至96深孔板各孔中。厭氧培養箱中37 ℃靜置培養,14 h后檢測各孔OD600,選出OD值最高的孔,梯度稀釋后涂布平板進行單菌落分離,厭氧培養24 h后,挑選長勢較好的單菌落進行高通量初篩。

1.2.2初篩用牙簽從平皿上挑選盡可能多的單菌落,至96深孔板中,37 ℃靜置厭氧培養14 h,用8道移液槍取樣200 μL/孔,酶標儀檢測OD600。

1.2.3復篩從初篩菌株中挑選OD值較高的24個孔進行復篩。按照5%(v/v)接種量接入已裝有1 mL種子培養基的96孔板中,每組4個平行,37 ℃靜置厭氧培養14 h,用8道移液槍取樣200 μL/孔,酶標儀檢測OD600。

1.2.4搖瓶發酵將優勢菌株與原始菌株分別接斜面,37 ℃厭氧活化24 h后,將斜面洗下,接至100 mL發酵培養基中,每隔2 h取樣活菌計數,繪制生長曲線。

1.2.5傳代穩定性考察將復篩出的長雙歧桿菌優勢菌株在斜面培養基中連續傳代5次,將不同傳代次數的菌株分別進行搖瓶發酵實驗,并對發酵液進行活菌計數,考察菌種傳代穩定性。

1.2.67 L罐發酵將優勢菌株與原始菌株于新鮮斜面上活化24 h后,分別接至種子培養基中,37 ℃培養12 h,按照5%(v/v)接種量接至7 L發酵罐(裝量5 L)中,設定轉速為200 r/min,溫度為37 ℃,NaOH調節pH穩定維持在6.0,每2 h取樣進行活菌計數。

1.2.7活菌計數將待測樣品經梯度稀釋后,選擇合適的稀釋度的菌液,分別取100 μL加到已制備好的固體平板上,然后用無菌涂棒將菌液涂布整個平板表面,每個稀釋度涂三個及以上平板,37 ℃厭氧倒置培養,待菌落長出后,計數,并計算出原菌液的含菌數(CFU/mL):每毫升原菌液活菌數=同一稀釋度三個平皿菌落平均數×稀釋倍數×10

1.2.8數據統計分析實驗中每個處理重復三次,采用Excel軟件進行數據的統計及誤差分析,并作圖。

2　結果與分析

2.1長雙歧桿菌生長曲線

要想快速、高效地從龐大的菌種庫中篩選出優勢菌株,不僅要通過高通量培養,技術還要建立與之配套的快速、高效的高通量檢測技術[14]。傳統的活菌計數方法隨著篩選樣本量的增多,工作量大大增加,費時費力,不能配合高通量培養實現高通量篩選。本文建立了96深孔板菌種高通量培養方法及酶標儀高通量檢測方法,選取培養至對數生長期的樣品,于600 nm波長快速檢測。OD值反映的是被檢測物所吸收的光密度,死亡的菌體仍然會有吸收值,容易影響篩選結果,因此首先要確定合適的取樣時間。

圖1顯示了長雙歧桿菌深孔板培養過程中活菌數與OD值的關系:0～12 h活菌數不斷增加,OD值也不斷提高,兩者呈一定對應關系;16 h時活菌數達到最大值,此后活菌數有所下降,但16 h后OD值則處于一個平穩的狀態,因此選擇14 h作為高通量檢測時間,高通量檢測方法使得大量樣品可同時檢測,大大減少了檢測誤差。

圖1　長雙歧桿菌生長曲線圖Fig.1　Growth curve of bifidobacterium longum

表1　96孔板OD值Table 1　The Optical Density of the 96-deep MTPs

2.2菌種的自然分離

從表1結果可以看出菌株生長存在明顯差異,甘油管37 ℃活化16 h后,大部分OD都處于0.4～0.5之間,還有一部分OD值處于0.1～0.2,而長勢最好的C8孔OD達到0.607,選擇C8孔進行稀釋涂布,分離單菌落進行高通量初篩。

2.3菌種的高通量初篩結果

從圖2可以看出,挑選的1056個單菌落的生長情況差別較為明顯,大部分菌株的OD值處于0.5～0.7之間,只有少數菌株的OD值達到0.7～1.0。

圖2　高通量初篩Fig.2　High-throughput preliminary screening

2.4菌種的高通量復篩結果

從圖3可以看出,7號孔生長最好,OD值最高為0.768。選擇該菌株(編號BL01)進行斜面及甘油管保存。

圖3　高通量復篩Fig.3　High-throughput secondary screening

2.5搖瓶發酵驗證

從優勢菌株BL01與原始菌株6187的生長曲線對比圖可以很明顯發現(圖4),搖瓶發酵情況下,長雙歧桿菌在14 h活菌數達到最大,BL01菌株與原始出發菌株6187相比,活菌數由5.4×108CFU/mL提高到1.53×109CFU/mL,約提高3倍?？梢?此高通量篩選方法具有可行性。

圖4　菌株BL01與菌株6187的搖瓶發酵對比Fig.4　CFU comparisons between the strain 6187 and strain BL01 in shake flasks

2.6傳代穩定性的考察

將長雙歧桿菌優勢菌株BL01在斜面培養基中連續傳代5次,分別進行搖瓶發酵實驗,活菌數計算分別為1.33×109、1.39×109、2.38×109、1.09×109,1.12×109CFU/mL,表明該優勢菌株具有比較穩定的遺傳性。

2.77 L罐發酵

從7L罐發酵對比圖可以很明顯看到(圖5),長雙歧桿菌在14 h活菌數達到最大,BL01菌株與原始出發菌株6187相比,活菌數由3.9×109CFU/mL提高到1.67×1010CFU/mL,約提高4.3倍。進一步證實此高通量篩選方法具有可行性。

圖5　菌株BL01與菌株6187的7 L罐發酵對比Fig.5　CFU comparisons between the strain 6187 and strain BL01 in 7 L bioreactor

3　結論

益生菌產品的優劣與其制備過程中的各個環節,如菌種的選擇、發酵過程、凍干過程、保存方法等息息相關,每一環節都要盡量減少活菌數的損失。好的菌株是制備產品的第一步,尤為關鍵。然而,傳統的搖瓶篩選方法,不僅操作繁瑣,工作量大,且因通量限制,大部分菌株由于沒有篩選機會而流失。本文采用96深孔板微型化培養和酶標儀檢測,建立了一種快速有效的雙歧桿菌優勢菌株的高通量篩選方法:將傳統的初篩和復篩縮小在微孔板中進行,先篩選出具有生長優勢的混合菌群,再進一步從中分離純化,高通量檢測可快速篩選出優勢菌株,很大程度上降低了篩選工作量,給育種工作者減輕了負荷。本文經高通量篩選方法獲得的優勢菌株,大大提高了發酵活菌數,經過傳代實驗證明其具有良好的穩定性,為之后的凍干、保存等環節打好堅實的基礎。

[1]郝維善. 人類腸道中的重要生理性細菌—雙歧桿菌[J]. 中國微生態學雜志,1989,1(1):116-123.

[2]李俊潔,陳慶森. 雙歧桿菌調理和改善腸道相關疾病作用的研究進展[J]. 食品科學,2011,32(23):326-332.

[3]呂錫斌,何臘平,張汝嬌,等. 雙歧桿菌生理功能研究進展[J]. 食品工業科技,2013,34(16):353-358.

[4]藍景剛,胡宏. 雙歧桿菌及其表面分子的免疫增強作用[J]. 中國微生態學雜志,1999,11(3):129-131.

[5]Al-Sheraji SH,Ismail A,Manap MY,et al.

Hypocholesterolaemic effect of yoghurt containing Bifidobacterium pseudocatenμlatum G4 or Bifidobacterium longum BB536[J]. Food Chemistry,2012,135(2):356-361.

[6]Yamazaki S,Kaneko T,Taketomo N,et al. 2-Amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone affects the end-product profile of bifidobacteria through the mediatedoxidation of NAD(P)H[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2002,59(1):72-78.

[7]李迎雪,王立生. 雙歧桿菌抗腫瘤信號機制的研究[J]. 中國微生態學雜志,2006,18(6):497-498.

[8]Werf MJ,Venema K. Bifidobacteria:genetic modification and the study of their role in the colon[J]. J Agric Food Chem,2001,49(1):378-383.

[9]Alliet P,Scholtens P,Raes M,et al. Effect of prebiotic galacto-oligosaccharide,long-chain fructo-oligosaccharide infant formμla on serum cholesterol and triacylglycerol levels[J]. Nutrition,2007,23(10):719-723.

[10]Homayouni A,Azizi A,Ehsani MR,et al. Effect of microencapsμlation and resistant starch on the probiotic survival and sensory properties of synbiotic ice cream[J]. Food chemistry,2008,111(1):50-55.

[11]孟甜,李玉鋒. 現代工業微生物育種技術研究進展[J]. 生命科學儀器,2009(12):3-6.

[12]丁曉兵,李宗偉,劉曉波,等. 原生質體誘變在工業微生物育種中的應用進展[J]. 食品工業科技,2008(7):260-262.

[13]石文娟,譚俊,儲炬,等. 紅曲色素高產菌株的高通量選育[J]. 中國釀造,2012,31(7):25-28.

[14]譚俊,鄧芊,郝玉有,等. 抗生素化學效價的快速高通量分析方法[J]. 中國抗生素雜志,2009(10):606-608.

Developing a high-throughput screening method for dominant strains ofBifidobacterium.longum

ZONG Fang-fang1,2,TAN Jun1,*,SHAO Lei1,CHEN Dai-jie1,ZHANG Jun-liang1,QIAN Zhi-xiang1,3,ZHANG Su-ji1,4

(1.State Key Laboratory of New Drug and Pharmaceutical Process,Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry,China State China Pharmaceutical University,Nanjing 211198,China;2.College of Life and Environment Science,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China;3.College of Engineering,China Pharmaceutical University,Nanjing 211198,China;4.College of Life Science and Technology,China Pharmaceutical University,Nanjing 211198,China)

A simple and rapid high-throughput screening(HTS)method was developed through 96-deep MTPs and microplate reader. This new screening approach greatly increased the efficiency of obtaining the dominant strain compared with the conventional method. As a result,the dominant strain BL01 was successfully screened out and the Colony Forming Units was nearly 3-fold higher than that of the original strain in shake flasks,4 times higher than that of the original strain in 7 L bioreactor. The strain BL01 was stable enough for many generations. High-throughput screening method was valuable for many other microbial strains. It is believed that the HTS field continues to be promising and dynamic in the future.

Bifidobacterium.longum;96-deep MTPs;high-throughput screening;natural selection

2016-01-27

宗方方(1991-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：微生物藥物，E-mail:elvazong@163.com。

譚俊(1983-)，女，助理研究員，研究方向：微生物藥物，E-mail:baiyuge1113@163.com。

國家“重大新藥創制”科技重大專項(2013ZX09301302，2014ZX09507009-025)；國家自然科學基金(81573329)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)15-0150-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.021