菊糖與精氨酸的美拉德反應及其產物的抗氧化性能研究

吳慧倫，張亦鳴，關 曼，江海云，謝 晶，孫 濤（上海海洋大學食品學院，上海201306）

菊糖與精氨酸的美拉德反應及其產物的抗氧化性能研究

吳慧倫，張亦鳴，關 曼，江海云，謝 晶，孫 濤*
（上海海洋大學食品學院，上海201306）

菊糖與精氨酸（菊糖與精氨酸的羰氨比為1∶5）在100℃的條件下發生美拉德反應，制備反應10、40和70 h的美拉德反應產物，分別標記為IR10、IR40以及IR70，考察其美拉德反應過程中的進程指標（pH、紫外-可見吸光光度值、熒光值）并對產物進行紅外表征，然后對其抗氧化能力進行測定。結果表明：隨著反應的進行，反應體系的pH呈現下降的趨勢；紫外-可見光譜在296 nm處的吸收峰隨著反應時間的增加而增強；在323 nm的激發波長和408 nm的發射波長下的熒光值隨著反應時間的增加而增強；各衍生物均保留有菊糖本身的特征吸收峰；衍生物對DPPH、O2·-的清除能力以及還原能力均低于茶多酚對照組，但較之于菊糖（對DPPH清除能力以及還原能力幾乎為0）均有提高，且抗氧化性能隨著反應時間的增加而增強。

菊糖，進程指標，美拉德反應，抗氧化性能

菊糖是一種天然果聚糖，由D-呋喃果糖分子以β-（2，1）糖苷鍵連接生成，每個菊糖分子末尾以α-（1，2）糖苷鍵連接一個葡萄糖殘基［1］。菊糖具有調節血糖血脂、低熱量、改善腸道環境以及促進礦物質吸收等生理功能［2］，因此常應用于保健食品中。我國擁有豐富的菊糖資源，但對菊糖的研究與應用基礎還比較薄弱。

美拉德反應常見于食品加工、生產與儲藏過程中，其產物中的類黑精、還原酮以及一些雜環化合物等具有一定的抗氧化性，且美拉德反應產物具有天然無毒的特性，因此被期望用于合成抗氧化劑［3-4］。當多糖參與美拉德反應時，很多美拉德反應產物的抗氧化性和抑菌性均優于多糖本身［5］，其中的某些物質抗氧化性質可媲美于食品中的很多抗氧化劑。

菊糖在食品加工過程中能夠發生美拉德反應，在加工巧克力的過程中，由于加入的菊糖參與美拉德反應，能夠有效改善巧克力的風味［6］。但對于菊糖在美拉德反應過程中結構與功能變化的研究還較為罕見。精氨酸是一種較常見的氨基酸，其在很多食品中含量豐富。本文以菊糖和精氨酸進行美拉德反應，研究反應前后菊糖的結構及性質的變化，以期為多糖美拉德反應的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊糖 純度＞97%，購自上海普振生物科技有限公司；魯米諾、DPPH（1，1-二苯基-2-苦基肼） 購自Sigma公司；茶多酚 購自湖州榮凱植物提取有限公司；精氨酸、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、無水乙醇 均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；島津RF-530Pc熒光分光光度計 日本島津公司；DELTA-320型pH計 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀 天津港東科技發展股份有限公司；IFFM-D型流動注射化學發光分析儀 西安瑞邁電子科技有限公司。

1.2 菊糖的美拉德反應

稱取10.0 g菊糖和0.16 g精氨酸，使得菊糖的羰基與精氨酸的氨基的摩爾比為1∶5，將其溶解于100 mL的二次蒸餾水中，在100℃下進行回流反應。用乙醇或丙酮提取10、40、70 h的菊糖美拉德反應產物，直至用茚三酮法不能檢測到產物中還有精氨酸的存在，烘干得到產物并分別標記為IR10、IR40以及IR70。

1.3 測試表征

在反應過程中，利用pH計、雙光束紫外可見分光光度計和熒光分光光度計分別測美拉德反應體系的pH、紫外-可見吸光光度值以及熒光值的變化。

紅外表征在傅里葉變換紅外光譜儀上進行，采用KBr壓片法，測定的波數范圍為500～4000 cm-1，分辨率為2 cm-1。

1.4 抗氧化性能測定

1.4.1 對DPPH自由基的清除 取8只試管，分別標記為0～7。向1～7號試管中加入2 mL濃度為10-4mol/L 的DPPH乙醇溶液和不同濃度的樣品溶液，混勻后于33℃條件下避光靜置0.5 h，在517 nm處測得吸光度為Ai，在0號試管中加入2 mL去離子水和2 mL DPPH乙醇溶液，測吸光度為A0，陰性對照組另取7只試管加入無水乙醇、樣品各2 mL，測吸光度為Aj［7］。

1.4.2 對超氧陰離子自由基O·2-的清除 用0.05 mol/L 的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液（pH=10.20）配制1.5×10-3mol/L的魯米諾溶液以及不同濃度的樣品溶液。0.1 mol/L的鄰苯三酚儲備液是用1×10-3mol/L的鹽酸配制而成，使用前用去離子水稀釋至1×10-4mol/L。在室溫下，采用流動注射化學發光分析儀來測定樣品溶液的峰面積Ai以及空白溶液的峰面積A0。經SOD、過氧化氫酶及甘露醇檢測，該體系產生的自由基為超氧陰離子自由基（O·2-）［8］。

清除率（%）=（A0-Ai）/A0×100

1.4.3 還原能力的測定 取pH=6.60的0.2 mol/L的磷酸緩沖液、1%的鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，加入到2.0 mL不同濃度的樣品溶液中，于50℃條件下水浴20 min，取出后立即于冰水中冷卻，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻后于3000 r/min下離心10 min，取上清液2.0 mL，加入去離子水2.5 mL和0.1%的三氯化鐵溶液0.5 mL，靜置10 min后，于700 nm處測定其吸光度值。其吸光度值越大，還原能力就越強［9］。1.4.1～1.4.3中均以茶多酚（TP）為對照。

1.5 數據分析

以上所有實驗重復三次，最終的實驗結果以三次實驗數據的算術平均值確定。利用t-檢驗進行組間分析（p＜0.05），并采用Origin軟件繪圖。

2 結果與討論

2.1 結構表征

2.1.1 pH的變化 圖1描述了菊糖與精氨酸美拉德反應過程中pH的變化，菊糖與精氨酸的美拉德反應體系的初始pH呈堿性，隨著反應的進行，體系的pH呈現下降趨勢，這是由于在美拉德反應的過程中羰基不斷與堿基基團-氨基縮合，將游離的氨基封閉［10］，且在反應過程中也會產生甲酸和乙酸等一些酸類物質［11］，從而引起pH的下降。

圖1 菊糖與精氨酸美拉德反應過程中pH的變化Fig.1 The pH change during Maillard reaction

2.1.2 紫外-可見吸光度的變化 美拉德反應的過程中糖會發生易構和脫水，產生糠醛類物質，該類物質在290 nm左右有特征吸收［12］。由圖2可知，菊糖與精氨酸的美拉德反應體系在296 nm的波長處有最大吸收，隨著反應的進行，反應前25 h增幅較大，其后增幅則慢慢減緩，表明反應過程中有糠醛類物質生成且不斷積累，且后期糠醛類物質積累量減少。這很好地反映了美拉德反應的進程。

圖2 菊糖與精氨酸美拉德反應過程中吸光度的變化Fig.2 The UV-vis absorbance during Maillard reaction

2.1.3 熒光值的變化 如圖3所描述的是菊糖與精氨酸美拉德反應體系在323 nm激發波長，掃描發射波長為350～600 nm范圍的熒光值，在408 nm發射波長下體系的熒光強度最大，且熒光強度隨著反應的進行不斷增加，表明了具有熒光性質的美拉德反應產物的不斷增加。熒光物質是美拉德反應的一種指示劑，它能靈敏地反映出美拉德反應的過程［13］。美拉德初期產物經過脫水、重排等會產生無色的還原酮與熒光物質，而此時糠醛、脫氧鄰酮醛糖等不飽和的羰基化合物增加［14］。

圖3 菊糖與精氨酸美拉德反應過程中熒光值的變化Fig.3 The fluorescence absorbance during Maillard reaction

2.1.4 紅外光譜表征 圖4是菊糖（In）及其與精氨酸（Arg）的美拉德衍生物的紅外光譜圖，由圖4可以看出，菊糖及其美拉德衍生物在1033 cm-1以及875 cm-1處有特征吸收峰，這些峰都是菊糖主鏈特征吸收峰，可作為判定菊糖及其衍生物存在的特征吸收峰［15］。菊糖及其美拉德衍生物在2933 cm-1處的吸收峰為C-H的伸縮振動引起的吸收峰，在1410 cm-1處的吸收峰為C-H的彎曲振動所引起的吸收峰。精氨酸的紅外譜圖顯示在1684 cm-1處有吸收峰，此為C=N的特征吸收峰。三種菊糖的美拉德衍生物在1623 cm-1處都有吸收峰，此為C=O的吸收峰［16］，而菊糖在此處沒有吸收峰，這是因為菊糖與氨基酸在發生美拉德反應的過程中會產生還原酮等物質。

圖4 菊糖與精氨酸美拉德產物的紅外圖譜Fig.4 FTIR spectra of Maillard reaction products

2.2 抗氧化性能分析

2.2.1 對DPPH自由基的清除 DPPH自由基較穩定，其N上有一個游離電子，它在乙醇溶液中呈深紫色，在517 nm處有特征吸收，當DPPH自由基中的孤電子被配對時，則該處的吸收會減弱。且其乙醇溶液也會褪色，其褪色程度與接受的電子數有關，故可利用分光光度法進行定量分析［17］。由圖5可知，三種衍生物IR10、IR40、IR70的IC50（對自由基清除率為50%時所需的自由基清除劑的濃度）分別為1.73、0.48、0.07 mg/mL，即對DPPH自由基的清除能力IR70＞IR40＞IR10，對照組茶多酚TP的IC50為0.02 mg/mL，即茶多酚對DPPH清除能力優于菊糖美拉德反應產物。而菊糖本身對DPPH自由基的清除能力很低，這說明美拉德反應改性對菊糖的DPPH自由基清除能力有所提高，且隨著反應的進行，對DPPH自由基的清除能力也隨之增加。

圖5 菊糖與精氨酸美拉德產物對DPPH自由基的清除能力Fig.5 Scavenging activity of Maillard reaction products on DPPH radical

2.2.2 對超氧陰離子自由基（O2·-）的清除 鄰苯三酚在堿性條件下氧化釋放出超氧陰離子自由基（O2·-），O2·-與魯米諾可發生化學發光，發出的光可由發光計檢測，自由基清除劑可降低鄰苯三酚自氧化速率，清除產生的O2·-，抑制化學發光，從而可定量檢測出其自由基清除能力［17-18］。由圖6可知，IR70的清除效果最好，其IC50為2.65 mg/mL，IR40次之，IR10的清除效果最差，這三種衍生物對O2·-的清除效果均低于茶多酚TP對照組（IC50為0.26），但都優于菊糖本身，這說明美拉德反改善了菊糖對O2·-的清除能力，且隨著反應

圖6 菊糖與精氨酸美拉德產物對超氧陰離子自由基（O·）的清除能力Fig.6 Scavenging activity of Maillard reaction products on superoxide anion

時間的增加，清除能力增強。這與DPPH自由基清除能力的結果一致。

2.2.3 還原能力的測定 還原力的測定，實質是檢驗物質是否是良好的電子供應者。還原力強的物質可與自由基反應，使自由基成為較穩定的物質［17］。研究表明，抗氧化活性和還原力間存在密切的關系［19］。由圖7可知，在濃度為2.5 mg/mL時，IR10、IR40、IR70的吸光度分別為0.49、0.71、0.87，對照組茶多酚TP的吸光度為1.72，菊糖本身的還原能力幾乎為零，即它們還原能力大小順序為TP＞IR70＞IR40＞IR10＞In，這與前面的實驗結果一致。

圖7 菊糖與精氨酸美拉德產物的還原能力Fig.7 Reducing capacity of Maillard reaction products

3 結論

本實驗以美拉德反應為改性手段，對菊糖美拉德反應進程及其抗氧化性能進行了研究。結果表明，菊糖美拉德反應體系的pH皆隨著反應時間的增加而下降，紫外吸光度及熒光值均隨時間的增加而增強；菊糖與精氨酸的美拉德衍生物的抗氧化性能均優于菊糖，并隨著美拉德反應時間的增加，抗氧化性能越來越好。菊糖本身的抗氧化性能較弱，但其美拉德反應過程中會生成一些酸類物質、糠醛類物質以及熒光類物質，且隨著反應的進行這些物質不斷積累，故而菊糖衍生物的抗氧化性也在不斷增強，具體機理有待進一步的研究。這為以后菊糖的美拉德反應的研究提供了理論依據和新的思路。

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The Maillard reaction of inulin with arginine and the antioxidant activity of inulin derivatives

WU Hui-lun，ZHANG Yi-ming，GUAN Man，JIANG Hai-yun，XIE Jing，SUN Tao*
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

The Maillard reaction was occurred by heating inulin and arginine（the ratio of amine group in inulin and carbonyl group in arginine was 1∶5）at 100℃.The products of 10，40 and 70 h were prepared and named IR10，IR40 and IR70，respectively.pH，UV-vis absorbance and fluorescence were determined during Maillard reaction and the derivatives were characterized by FTIR.Their antioxidant activities were evaluated.The results revealed that the pH of the reaction system decreased during Maillard reaction.The UV-vis absorbance at 296 nm increased during the reaction.With 323 nm excited wavelength and 408 nm emission wavelength，the fluorescence intensity increased with the increase of reaction time.Infrared spectrum analysis showed that the Maillard derivatives retained the characteristic absorption peaks of inulin.Three kinds of inulin derivatives had weaker antioxidant activity compared with tea polyphenol，but it was stronger than inulin（its abilities to scavenge DPPH and reducing capacity were almost zero）and the antioxidant activity increased with the increase of reaction time.

inulin；process indicators；Maillard reaction；antioxidant activity

TS201.2

A

1002-0306（2016）06-0179-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.028

2015－08－03

吳慧倫（1991-），女，在讀碩士研究生，研究方向：多糖的改性，E-mail：963357250@qq.com。

孫濤（1970-），女，博士，副教授，研究方向：多糖的改性及生物功能的開發，E-mail：taosun@shou.edu.cn。

“十二五”國家支撐計劃項目（2012BAD38B04）。