MicroRNA-132拮抗劑兩種不同注射方式在匹羅卡品誘導的幼年大鼠癲癇急性期的差異

吳天慧，尹　飛，彭　鏡，孔惠敏，李琳紅

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MicroRNA-132拮抗劑兩種不同注射方式在匹羅卡品誘導的幼年大鼠癲癇急性期的差異

吳天慧1，2，尹飛1，彭鏡1，孔惠敏1，李琳紅1

目的探討microRNA-132拮抗劑對氯化鋰-匹羅卡品誘導的幼年SD大鼠內側顳葉癲癇(mesial temporal lobe epilepsy，MTLE)模型急性期的影響。方法實驗分為4組：microRNA-132拮抗劑側腦室置管組；microRNA-132拮抗劑陰性對照置管組；microRNA-132拮抗劑直接注射組；microRNA-132拮抗劑陰性對照直接側腦室注射組；實驗各組藥物干預在造模前24 h進行。利用氯化鋰-匹羅卡品建立SD大鼠MTLE模型，通過行為學觀察各組大鼠癲癇持續狀態發作潛伏時長，Racine評分觀察各組大鼠抽搐發作的嚴重程度，腦電圖監測癲癇樣放電的頻率及波幅，并統計實驗各組大鼠誘導SE的成功率及24 h后的死亡率。結果在實驗各組中，建模成功率無顯著性差異，microRNA-132拮抗劑直接注射組幼年SD大鼠造模以后達到SE的潛伏時較其陰性對照組明顯延長、癲癇發作的Racine評分明顯下降、腦電圖結果顯示癇樣放電的幅度及頻率顯著下降，死亡率降低，結果有統計學意義(P<0.05)。MicroRNA-132拮抗劑側腦室置管注射組與microRNA-132拮抗劑側腦室直接注射組結果無統計學差異(P>0.05)。結論microRNA-132拮抗劑預處理SD大鼠能明顯延長氯化鋰-匹羅卡品誘導的SD幼年大鼠癲癇發作的潛伏期，減輕急性期抽搐嚴重程度及大腦樣癇放電，降低大鼠癲癇持續狀態后的死亡率。提示microRNA-132拮抗劑對氯化鋰-匹羅卡品誘導的幼年SD大鼠MTLE的發生具有抑制作用，抑制microRNA-132有可能成為癲癇持續狀態藥物治療的潛在靶點和新方向。

microRNA-132；拮抗劑；氯化；匹羅卡品；癲癇

內側顳葉癲癇(mesial temporal lobe epilepsy，MTLE)是指源于海馬、海馬旁回、杏仁核的局灶性癲癇發作，是兒童時期最為常見的難治性癲癇之一[1～3]。MTLE多于兒童時期起病，病初常常表現為熱性驚厥，早期有效的治療對改善疾病的預后十分重要。盡管科學日新月異，新的抗癲癇藥物不斷涌現，作為難治性癲癇MTLE的治療仍函待解決。深化對其機制的認識、探討新藥研發靶點，仍是目前的主題。

microRNA是近年來發現的一類新的調控家族，與神經發育以及成人神經生物網絡的多基因調控相關。已有學者發現在癥狀性癲癇發生后，不同海馬組織中miRNAs的表達改變不同[4，5]，其中microRNA-132和microRNA-134在這些腦組織及體液中呈現異常表達，提示其可能作為癲癇等腦損傷后的生物學標記。在一些癲癇患者中，持續癲癇發作伴隨的海馬組織中microRNA-132表達水平增加，可能導致神經形態學的改變，引起神經元的過度興奮和大腦認知功能障礙[6]。前期我們課題組也發現在幼年MTLE大鼠模型各期microRNA-132 呈顯持續性表達增高，提示microRNA-132與MTLE的發生發展關系密切[7]。

前期有研究證實，在體外培養原代神經元中，通過有效干預改變microRNA-132的表達，可對神經細胞突觸形態及細胞興奮性產生影響，過度表達的microRNA-132可導致神經突重塑和樹突出芽，增加興奮性電流，促進神經元細胞的異常放電[8，9]。但相關的在體研究卻未見明顯進展。

故本研究通過側腦室給藥下調microRNA-132表達，之后進行氯化鋰-匹羅卡品誘導建立幼年SD大鼠SE模型，通過行為學觀察統計潛伏時間、Racine評分評價大鼠抽搐嚴重程度、腦電圖監測大腦癲癇放電指數、統計SE后大鼠死亡率，觀察microRNA-132拮抗劑對大鼠癲癇持續狀態發生的影響，探討調控microRNA-132對大鼠癲癇發作的在體影響，為后續機制研究奠定良好的基礎。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組3周齡健康雄性SD大鼠(清潔級)，由中南大學湘雅醫學院動物部提供。分為microRNA-132拮抗劑置管組；microRNA-132拮抗劑陰性對照置管組；microRNA-132拮抗劑直接注射組；microRNA-132拮抗劑陰性對照直接注射組，每組15只。

1.2主要試劑及儀器匹羅卡品(美國Sigma-Aldrich公司)；氯化鋰(美國Genview公司)；腦電圖記錄儀(日本Olympus公司)；腦立體定位儀、微量注射器、套管針、電極導絲(深圳瑞沃德公司)；微型手持式顱鉆(STRONG90)(韓國SAESHIN公司)；microRNA-132拮抗劑、拮抗劑陰性對照(美國abcan公司)。

1.3側腦室置管及腦電圖電極定位以實驗動物前囟中點為參照點，置管組在前囟中點旁開1.2 cm，后移0.6 cm，深度4.1 cm置入套管針，牙科水泥固定。直接側腦室注射定位為前囟中點旁開1.2 cm，后移0.6 cm，深度3.7 cm。海馬電極定位為前囟后3.8 mm，旁開2.5 mm，顱骨下3.8 mm。小腦參考電極定位為正中線人之縫后1 mm突破顱骨即可。

1.4microRNA-132拮抗劑預處理置管組在側腦室成功置管后1 w、建模前24 h；直接注射組在建模前24 h，分別側腦室注射microRNA-132拮抗劑、microRNA-132拮抗劑陰性對照，劑量為1 nmol(50 μl)。

1.5模型制備參照Zeng LH的方法(J Neurosci，2009，29：6964)，氯化鋰125 mg/kg腹腔注射，18～20 h后注射匹羅卡品(50 mg/kg)，誘導至癲癇發作，根據Racine’s 評分判定癲癇發作的程度，達到癲癇持續狀態(status epilepticus SE)，30 min判定為建模成功，45 min后或頻危時予水合氯醛300 mg/kg腹腔注射終止發作。

1.6觀察指標通過行為學觀察統計潛伏時間，Racine評分評價大鼠抽搐嚴重程度，統計死亡率。通過腦電圖觀察癲癇放電，監測時長為注射匹羅卡品后3 h。

2　結　果

2.1SE模型制備結果各組給予氯化鋰誘導后，注射匹羅卡品5～30 min，動物開始出現機械性咀嚼、連續性點頭、單側前肢陣攣、前肢交替陣攣，隨后出現雙側前肢陣攣、后退、摔倒，最后出現狂奔嘶叫、強直發作。microRNA-132拮抗置管組、陰性對照組和microRNA-132拮抗直接注射組以及陰性對照組分別有7、7、7、7只達到SE，誘導成功，成功率約(53.8%～58.3%)，各組間差異無顯著性。與非干預癲癇組無差別(未顯示)。

2.2各組大鼠抽搐Racine評分實驗大鼠出現面部陣攣+節律性點頭+前肢陣攣+后肢站立評為4分，出現面部陣攣+節律性點頭+前肢陣攣+后肢站立+跌倒評為5分，伴有嘶叫狂奔評為6分，強直評為7分，通過各組評分我們發現：microRNA-132拮抗劑置管組和直接注射組預處理后，SD大鼠的Racine評分兩組間無差異(t=1.00，P=0.32)；microRNA-132拮抗劑置管和注射組均與其陰性對照相比亦存在顯著性差異(t=3.075，P=0.022；t=2.09，P=0.045)。

2.3各組大鼠抽搐潛伏期時長非處理癲癇組平均潛伏期平均為(50.17±2.42)分(未顯示)，與其相比，microRNA-132拮抗劑置管組和直接注射潛伏時間均有延長，分別為(57.33±2.84)分(t=-2.595，P=0.049)和(57.42 ±2.82)分(t=3.248，P=0.023)，具有統計學意義；而microRNA-132拮抗劑置管組和直接注射組組間無差異(t=2.067，P=0.356)；microRNA-132拮抗劑直接注射和置管組均與其陰性對照組之間亦存在顯著性差異(分別為t=3.075，P=0.022；t=2.09，P=0.041)。

2.4腦電圖監測腦電圖監測結果顯示，在誘導SE后2 h，microRNA-132拮抗劑直接注射組和置管組注射組大鼠其腦電圖的均可見到高波幅尖棘波發放，但波幅及頻率明顯低于其陰性對照組(P<0.05)(見圖1及表4)。

2.5各組死亡率的比較SE誘導成功后24 h通過觀察各期的大鼠死亡情況我們發現，d1-3各組均有不同程度的死亡，microRNA-132拮抗劑注射和

置管組死亡率均低于癲癇組(未顯示)及其陰性對照組，而microRNA-132拮抗劑注射和置管組兩組間死亡率無差別，其他時間段無顯著性差異(見表5)。

A：microRNA-132拮抗劑置管組；B：microRNA-132拮抗劑置管陰性對照組；C：microRNA-132拮抗劑直接注射組；D：microRNA-132拮抗劑直接注射陰性對照組

表1　各組SE誘導成功情況表

表2　動物抽搐評分及潛伏期比較

表3　各組SD大鼠潛伏期比較

表4　各組放電頻率及幅度比較

表5　各組死亡率比較

3　討　論

MicroRNA是微小非編碼RNA，參與各種生物的分化、增殖及凋亡等生理、病理過程。microRNA-132被認為是突觸優勢表達microRNA[10]，與正常神經分化、生長及擴展以及突觸重塑等諸多神經功能有關。

既往發現microRNA-132在海馬齒狀回區域神經元高度表達，在胚胎后期神經元樹突區域或者成年大腦的突觸碎片均有表達。除了成熟體，microRNA-132前體也在軸突富集[8，9]。microRNA-132表達增加能促進錐體細胞和顆粒細胞向神經元的成熟，促使顆粒細胞神經元分化成熟。在不同的軸突中，microRNA-132調節Rasal的表達，展示了軸突microRNA功能。在培養的原代神經元，microRNA-132富集于軸突，作為調節軸突延伸發展的正性調節因子，作用于軸突局部，調節Rasal mRNA，促進軸突延伸，與神經元形態和突觸可塑相關，是調節突觸活動的神經結構和功能的可塑性的重要因素[10～12]。

有研究發現microRNA-132表達異常與神經系統的許多疾病相關[12～14]。同時，在多種MTLE模型中，microRNA-132均表達上調，認為其與癲癇的發生、發展有關系[12，13]。有觀點認為MTLE發生時，急性期存在大量神經元的丟失，同時，星形膠質細胞和小膠質細胞大量增生從而對癲癇的反復發作產生長期的影響，由于大量神經元丟失，星形膠質細胞、小膠質細胞增生，海馬硬化發生[7，15]。在體外培養原代神經元中，過度表達microRNA-132導致神經突和樹突出芽，增加興奮性電流，對神經元細胞的異常放電有影響[8，9]。也有研究在誘導癲癇前給予干預，使用microRNA-132 拮抗劑，抑制microRNA-132的表達，可減少SE后海馬CA3區域的神經元細胞死亡[4，10～12]。在本研究中我們通過置管或直接側腦室注射microRNA-132拮抗劑，從腦電圖來看，其急性期的放電頻率和幅度均低于非干預癲癇組，可能與此有關。而通過比較達到Racine4級的潛伏期時長，干預組潛伏期均長于癲癇組，總體死亡率亦低于癲癇組，可以推測microRNA-132可能通過某些信號途徑調節，減少神經元的死亡而發揮神經保護作用，而相關機制的研究，是我們進一步的研究方向。

以往研究通過干預改變microRNA-132的表達，會對神經系統造成改變。在培養的海馬軸突中，敲除microRNA-132減少延伸，而過度表達則促進延伸。microRNA-132 類似物治療增加了脊柱樹突的蘑菇短而粗的棘部分，主要增加了絲狀偽足的比例。清除體內的microRNA-132，與突觸長度和寬度減少有關，而且使得突觸轉運受損。在本研究中，直接或置管側腦室注射microRNA-132拮抗劑干預后，期望改變體內microRNA-132的水平，我們觀察到注射microRNA-132的SD大鼠誘導癲癇持續狀態，其急性期死亡率均明顯低于對照組，可以證實microRNA-132對癲癇疾患存在保護作用，但由于為小樣本資料，結果仍值得商榷。

側腦室置管術是神經系統實驗常用的注藥方式，但國內外microRNA類似物及拮抗劑常采用單次注藥方式，但由于側腦室置管術后SD大鼠的搔抓，容易導致導管的脫落、移位，我們嘗試用直接定位注射方式，通過本實驗觀察到，無論是抽搐潛伏期時間長短，還是抽搐Racine評分還是死亡率，直接注射和側腦室置管術之間無顯著性差別，故本實驗認為采用直接定位注射亦是可行的。

綜上所述，通過使用microRNA-132拮抗劑，對氯化鋰-匹羅卡品誘導的幼年SD大鼠發生發生癲癇持續狀態具有抑制作用，因此抑制microRNA-132有可能成為癲癇持續狀態藥物治療的潛在靶點和新方向。

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The effect of two different injection of microRNA-132 antagonists on the acute epilepsy stage of lithium-pilocarpine young SD rats

WUTianhui，YINRei，PENGJing，etal.

(ThepediatricdepartmentofXiangYahospitalofCentralSouthUniversity，Changsha410008，China)

ObjectiveTo investigate the effect of microRNA-132 antagonist of acute epilepsy stage which was induced by lithium-pilocarpine in young SD rats. MethodsThe young SD rats were randomly divided into four groups：microRNA-132 antagonist lateral ventricle catheter group，microRNA-132 antagonist negative control catheter group，microRNA-132 antagonist direct injection group，microRNA-132 antagonist negative control direct injection group. MicroRNA-132 antagonist was pretreated 24 hours before the SD rats were induced to Status epilepsy(SE). The establishment of MTLE rat model was induced by lithium-pilocarpine，then observed the behavior of the rats，measured the latency of epilepsy，used Racine scores to assessed the severity of rats seizures，and EEG to know the frequency and amplitude of epileptiform discharges，and calculated and the success rate and the mortality rate of the rats after 24h of SE. ResultsThe success rate of MTLE was not significantly different between those groups，and the microRNA-132 antagonist direct injection group had significantly prolonged SE latency than the negative control direct injection group，and the same time，the Racine score decreased and the EEG showed significant decrease in the amplitude and frequency of epileptic seizures and the mortality. These results were statistically significant (P<0.05). There were no significant difference between the microRNA-132 antagonist lateral ventricle catheter group and the microRNA-132 antagonists direct injection group. ConclusionIt could significantly prolong the seizure latency if the SD rats were pretreated by microRNA-132 antagonists，and reduced the epilepsy severity and brain like epileptic discharge in acute stage，relieved the mortality after SE. Pretreated with microRNA-132 antagonists can inhibit the occurrence and development of SE，so may be a potential target or direction for drug treatment of SE.

microRNA-132；Antagonist；Lithium；Pilocarpine；Epilepsy

1003-2754(2016)07-0600-04

2016-01-20；

2016-04-16

國家自然科學基金(No. 81371434)

(1.中南大學湘雅醫院兒科，湖南 長沙 410008；2.湖南省兒童醫院腎內科，湖南 長沙 410007)

彭鏡，E-mail：pengjing4346@163.com

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