黃芪對大鼠視網膜缺血再灌注損傷中HIF-1α 和VEGF表達的影響

賈茜鈺　劉勤　白慧玲　董文

·臨床研究·

黃芪對大鼠視網膜缺血再灌注損傷中HIF-1α 和VEGF表達的影響

賈茜鈺劉勤白慧玲董文

目的：研究中藥黃芪對不同時間段大鼠視網膜缺血再灌注損傷（RIRI）實驗過程中缺氧誘導因子1-α（HIF-1α）和血管內皮生長因子（VEGF）表達的影響。方法：將78只SD大鼠分為正常組、黃芪組和缺血再灌注組，前房加壓法造模，黃芪組及缺血再灌注組分為6h、12h、24h、48h、3d和7d以上6各時間段處死大鼠，取材，行免疫組織化學法測定大鼠視網膜缺血再灌注損傷后大鼠視網膜中HIF-1α和VEGF表達的變化。結果：正常組大鼠視網膜中均未觀察到HIF-1α和VEGF的表達，缺血再灌注組6只中均可檢測到HIF-1α的表達，缺血再灌注6h即可檢測到HIF-1α表達，24h達到相對高峰，黃芪組各時間段表達低于缺血再灌注組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。缺血再灌注后12h后缺血再灌注組和黃芪組開始出現VEGF的表達，48h達到高峰。各時間點黃芪組VEGF表達水平明顯低于缺血再灌注組視網膜中VEGF表達水平，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論：中藥黃芪能改善對視網膜缺血再灌注損傷所致的相關缺血缺氧損害，可能通過抑制RIRI后視網膜中HIF-1α與VEGF的表達為主要機制，缺氧誘導因子-1α與內皮生長因子的表達率均隨著RIRI時間的推移而表達升高，HIF-1α可能通過上調VEGF的蛋白表達，它們共同參與了損傷視網膜缺血再灌注的發生以及發展。

黃芪；大鼠視網膜；缺血再灌注損傷；HIF-1α；VEGF

視網膜缺血再灌注損傷（retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI）主要發生在青光眼、缺血性視神經病變、增值性視網膜病變、視網膜血管性疾病、新生兒視網膜病變等眼部疾病，是眼科臨床診療工作中常見的視網膜病理過程，視網膜缺血再灌注損傷的發生機制尚不完全清楚，但研究表明可能與眾多因素密切相關［1］?，F代藥理研究表明中藥黃芪［2］對各個器官組織細胞的缺血、缺氧損傷具有保護作用，如肝臟缺血再灌注、心肌缺血再灌注損傷等。研究表明黃芪還可以通過營養相關神經組織抑制缺氧缺血，缺氧誘導因子-1 （hypoxia inducible factor 1，HIF-1）是缺氧誘導因子的細胞核提取物中存在的DNA結合蛋白，是能夠反映缺氧調節的重要因子并能抑制細胞的生長，在缺氧的條件下可誘導相關細胞凋亡［3］。HIF-1α通過介導和調控相關轉錄因子從而適應機體組織的缺氧調節，缺血缺氧所導致的新生血管形成主要原因為氧化應激反應［4］。血管內皮生長因子（VEGF）是目前促進血管生成的最重要因子之一，在缺氧缺血誘導的新生血管生成中起重要作用［5］。本實驗通過建立SD大鼠視網膜缺血再灌注損傷模型，觀察視網膜中缺氧誘導因子-1α及血管內皮生長因子的相關表達，探討中藥黃芪對RIRI的保護作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組實驗動物選用健康成年、裂隙燈下檢查眼前節均正常SD大鼠78只，雌雄各半，體重（220±20）g［由甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供動物，合格證號：SCXK（甘）2011-0001C］。正常對照組6只（無任何處理，每個時間點直接處死）；其余72只大鼠按隨機數字表法分為2組:黃芪組36只，RIRI造模前7d開始黃芪注射液（神威藥業有限公司、10mg），6g/kg進行腹腔注射，每日1次，直至處死；缺血再灌注組36只，RIRI造模前7d開始同等體積生理鹽水進行腹腔注射，每日1次，直至處死；按缺血再灌注時間將黃芪組和缺血再灌注組分為6 h、12 h、24 h、48 h、3d和7 d組，每小組6只。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠視網膜缺血再灌注模型的建立。實驗模型采用大鼠眼球前房內生理鹽水灌注法［6］。每只SD大鼠稱重后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠至睡眠狀態，后將大鼠取俯臥位鼠臺上固定后，1%丁卡因滴眼液點眼進行雙眼局部麻醉，復方托吡卡胺滴眼液進行大鼠雙眼散瞳，生理鹽水沖洗雙眼結膜囊，生理鹽水瓶輸液管連接7號頭皮針，沿大鼠顳側眼角鞏膜緣將頭皮針針頭刺入大鼠眼球前房（應注意眼球前房刺入時應避免虹膜、晶狀體的損傷），為固定針頭用醫用膠布粘于大鼠眼球同側耳緣處。慢慢升高生理鹽水輸液瓶的高度直至輸液瓶與大鼠眼球垂直距離為150cm，輸液瓶與大鼠眼球高度至150cm可使大鼠眼內壓升高至110mmHg（1mmHg=0.133 kPa），可觀察到大鼠球結膜、虹膜漸漸變白，輸液瓶與大鼠眼球高度至150cm時大鼠眼球結膜及虹膜為蒼白改變，直接眼底鏡可觀察到大鼠視網膜顏色蒼白，表明大鼠供給視網膜血流的視網膜中央動脈的阻斷。1h后將生理鹽水輸液瓶高度緩慢降與大鼠眼球水平狀態，繼而關閉輸液器開關，拔出輸液針頭，造模期間妥布霉素滴眼液頻繁點眼以預防感染并保持角膜濕潤，拔出針頭后觀察到球結膜以及虹膜顏色由蒼白恢復正常，直接眼底鏡下可見大鼠視網膜變為橘紅色，表明大鼠視網膜的缺血動脈為重新開放，紅霉素眼膏涂雙眼結膜囊，造模完畢，等待大鼠清醒后回籠。

1.2.2標本取材、固定及切片。不同時間段各組大鼠腹腔注射過量水合氯醛處死后，立即摘除眼球，大鼠眼視神經可保留0.5～1.0mm，隨后將眼球置于4%多聚甲醛內常溫固定24 h，去除眼前節，剝離視網膜，常規脫水、透明、浸蠟，制成石蠟切片，常規石蠟包埋。

1.2.3免疫組織化學檢測。每個組織塊均取3μm的切片用于免疫組化染色。將3μm的切片常規脫蠟至水，加入3%H2O2，95℃微波10分鐘將抗原修復，加入兔抗鼠HIF-lα（1∶300）抗體一抗（美國immnunoway公司），以0.1 mol/L的PBS代替一抗作為陰性對照。溫度保持4℃過夜，PBS緩沖液沖洗，滴加生物素標記二抗，37℃孵育30分鐘，PBS緩沖液沖洗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，37℃孵育30分鐘，PBS緩沖液沖洗，二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）顯色，自來水沖洗，蘇木精復染1min，脫水透明后封片處理，觀察并采集圖像。血管內皮生長因子（VEGF）免疫組化檢測滴加（1∶200）一抗-小鼠抗大鼠VEGF單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），其余步驟同HIF-lα。

1.2.4計算機圖像分析。切片組織中細胞（細胞核、細胞質或細胞膜）顯示出較多棕黃色顆粒為陽性表達，無棕黃色顆粒顯現則為陰性表達。應用Image-Pro Plus圖像分析軟件計算陽性細胞的平均吸光度，舊稱光密度（OD），每張切片隨機取3個視野。

1.3統計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，實驗測試指標的數據資料以平均數±標準差（±s）表示，對各組視網膜平均光密度值（A值）進行單因素方差分析并進行兩兩比較。

2　結果

2.1視網膜中HIF-1α蛋白的表達正常組未能檢測到HIF-1α的表達（圖1）。缺血再灌注組HIF-1α在再灌注后6h開始出現陽性表達，在24h表達最強，主要在視網膜神經節細胞層表達（圖2）。黃芪組HIF-1α的表達變化規律同缺血再灌注組，但是6組時間點HIF-1α的表達量均低于缺血再灌注組（圖3）。視網膜缺血再灌注各時段HIF-Ia蛋白IOD值，見表1。

2.2視網膜中VEGF蛋白的表達正常組及缺血再灌注組、黃芪組缺血再灌注后6h均未見VEGF的表達（圖4），缺血再灌注組在再灌注后12h主要在視錐視桿細胞層、INL和RGCs層開始出現VEGF的表達，表達逐漸增加，RIRI后48h表達達到高峰（圖5），繼而血管內皮生長因子的表達漸弱，7d時仍可檢測到VEGF的表達。除RIRI后6h外，其余各個時間點黃芪組VEGF蛋白的表達均較缺血再灌注組明顯減弱（圖6）。表2為每組RIRI各時段VEGF蛋白的平均光密度（IOD）的變化，缺血再灌注組和黃芪組與正常組比較差異均有統計學意義。

圖1　正常組未見HIF-1α（×400）

圖2　缺血再灌注組可見HIF-1α（×400）

圖3　黃芪組HIF-1α表達減弱（×400）

表1　視網膜缺血再灌注各時段HIF-1α蛋白平均IOD值的變化（±s）

表1　視網膜缺血再灌注各時段HIF-1α蛋白平均IOD值的變化（±s）

注:與正常組比較bP＜0.05；與缺血再灌注組比較aP＜0.05

組別　n　6h　12h　24h　48h　3d　7d正常組　6　0.06±0.03　0.06±0.03　0.06±0.03　0.06±0.03　0.06±0.03　0.06±0.03缺血再灌注組　6　0.172±0.03b　0.311±0.04b　0.361±0.04b　0.320±0.05b　0.252±0.04b　0.224±0.03b黃芪組　6　0.121±0.03ba　0.200±0.04ba　0.301±0.03ba　0.240±0.04ba　0.199±0.03ba　0.184±0.04ba

圖4　正常組未見VEGF表達（×400）

圖5　缺血再灌注組VEGF強陽性表達（×400）

圖6　黃芪組VEGF陽性表達明顯減弱（×400）

表2　視網膜缺血再灌注各時段VEGF蛋白平均IOD值的變化（±s）

表2　視網膜缺血再灌注各時段VEGF蛋白平均IOD值的變化（±s）

注:與正常組比較bP＜0.05；與缺血再灌注組比較aP＜0.05

組別　n　6h　12h　24h　48h　3d　7d正常組　6　0.059±0.03　0.059±0.03　0.059±0.03　0.059±0.03　0.059±0.03　0.059±0.03缺血再灌注組　6　0.075±0.04b　0.219±0.05b　0.420±0.06b　0.510±0.06b　0.320±0.06b　0.220±0.05b黃芪組　6　0.072±0.04ba　0.189±0.04ba　0.280±0.05ba　0.349±0.06ba　0.219±0.04ba　0.151±0.04ba

3　討論

視網膜缺血再灌注損傷是眼科臨床常見的疾病，如青光眼、缺血性視神經病變、增值性視網膜病變、視網膜血管性疾病、新生兒視網膜病變等眼部疾病。青光眼發病后能造成眼組織，特別是視網膜的損傷，關于高眼壓造成視網膜、視神經等組織損傷的機理有較多研究，循環障礙和軸漿流學說得到較多的支持，近年來自由基學說對各種疾病的病理生理過程的研究起到重要作用。急性高眼壓時視網膜氧分壓降低、缺血、缺氧，導致了一系列的代謝障礙及病理學改變。視網膜血管性疾病中視網膜中央動脈阻塞通常發生于視乳頭鞏膜篩板或后部，少許也可以發生于篩板前，視網膜氧分壓也降低，出現一系列的缺血缺氧病理狀態。本實驗運用大鼠前房生理鹽水灌注法造成視網膜血管斷流形成大鼠RIRI模型，實驗中將輸液瓶高度保持150cm從而形成14.63 kPa的壓力能夠造成大鼠視網膜血管斷流，這與大鼠的體循環收縮壓相接近，造模成功后應用免疫組化方法檢測RIRI后視網膜HIF-1α及VEGF表達情況；探討黃芪對HIF-1α和VEGF表達的影響。HIF-1α的靶基因產物如GLUTs-1、VEGF、HO-1、iNOS及編碼p21、BcL-2等基因在相關腫瘤的細胞代謝、新生血管生成、腫瘤增殖和轉移中也具有重要的作用。HIF-1α可調節VEGF表達從而促新生血管形成［7］。

中藥黃芪作為祖國的傳統中藥，屬補虛藥中補氣藥，其有效成分有黃芪總黃酮、黃芪總皂甙、黃芪總多糖和膽堿等。近年來研究發現黃芪具有清除機體氧自由基代謝產物、改善記憶和保護大腦的作用。黃芪的有效成分黃芪總酮和黃芪總甙具有清除氧自由基和調控NO的作用，可防止生物膜的脂質過氧化，其中黃芪總酮的作用最為明顯，是黃芪抗脂質過氧化的主要活性成分。在臨床及科研上作用廣泛，這與其藥理作用有著密切的聯系，而視網膜缺血再灌注由于自由基造成生物膜損傷，特別是線粒體腫脹，可致酶活性降低，氧化磷酸化受到抑制，能量產生障礙，進而使微粒體的多聚核蛋白體解聚脫落，抑制蛋白合成，溶解膜體受損［8］。黃芪中的主要成分黃芪多糖通過提高血中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及谷胱甘肽-過氧化物酶活力，來提高抗氧化能力。此外黃芪黃酮在體內也具有較好的抗氧化作用，相關研究［9］證實黃芪可以明顯減輕視網膜內層水腫，可通過平衡鈣離子穩態，減少神經型一氧化氮合成酶的激活，使體內一氧化氮的生成減少，調節脂質過氧化反應等，從而對RIRI后損傷具有保護作用。黃芪也可使神經節細胞中B-淋巴細胞瘤-2表達增強，B-淋巴細胞瘤-2家族成員之一Bax表達減弱，抑制視網膜神經節細胞凋亡對RIRI起到保護作用［10］。本研究結果顯示，大鼠視網膜缺血再灌注損傷后缺氧誘導因子-1α在再灌注后6 h表達開始出現，在24h表達最強，之后開始下降。在RIRI后12h VEGF的表達開始增加并逐漸增強，再灌注損傷后48h達到峰值，之后開始下降。缺血再灌注組中HIF-1α和VEGF的表達明顯高于正常組，黃芪組視網膜HIF-1α 和VEGF的表達明顯低于缺血再灌注組，實驗結果提示中藥黃芪可以通過抑制RIRI中HIF-1α及VEGF的表達而發揮對視網膜的保護性作用，這可能和視網膜組織缺血缺氧時自由基大量產生，自由基與脂質、蛋白質的反應將造成多種生物膜損傷有關，誘導HIF-1α表達增加主要通過抑制HIF-1α降解途徑，并非增加HIF-1α mRNA翻譯，VEGF促進血管內皮細胞的分裂、移行，增加血管的通透性，使組織產生新生血管來緩解組織缺血缺氧。

本研究表明，視網膜缺血再灌注損傷的發生發展可能與HIF-1α通過上調VEGF蛋白表達相關聯，黃芪可以通過抑制缺血視網膜組織中HIF-1α及VEGF的表達而對其起保護作用，但關于黃芪對HIF-1α及VEGF的具體細胞分子途徑目前尚不完全清楚，有待進一步研究。

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［9］趙奎卿，賀經.黃芪對大鼠視網膜缺血再灌注損傷的影響［J］.國際眼科雜志，2006，6（1）:1042-1044.

［10］高峰麗，戚雪.黃芪對大鼠視網膜缺血再灌注損傷中Bcl-2和Bax表達的影響［J］.國際眼科雜志，2012，12（5）:826-828.

A

1004-2725（2016）02-0105-04

730000甘肅 蘭州，甘肅中醫藥大學中醫臨床學院（賈茜鈺、董文）；730000甘肅 蘭州，甘肅省人民醫院眼科（劉勤、白慧玲）

劉勤，E-mail：summliu@126.com