樣本數量對白樺群體遺傳參數估算的影響

畢志宏，魏敏靜，劉瑩瑩，楊傳平，魏志剛（東北林業大學 林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

樣本數量對白樺群體遺傳參數估算的影響

畢志宏，魏敏靜，劉瑩瑩，楊傳平，魏志剛
（東北林業大學 林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

群體遺傳參數是群體遺傳學研究的主要內容之一，估算值的大小受群體樣本數量的影響。以帽兒山試驗林場白樺Betula platyphylla種源試驗林為對象，采用序列相關擴增多態性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）技術分析了種源內不同樣本數量對白樺群體遺傳多樣性的影響。結果表明：不同樣本數量對白樺的估算的各遺傳參數有一定影響，但影響各異。其中，對白樺群體多態位點百分率、群體內遺傳變異和群體間遺傳參數影響顯著，對總位點數、多態位點數和基因流影響不顯著。樣本數量對于群體間與群體內遺傳變異的大小的研究結果也產生影響，如樣本數量超過8個，顯示白樺種源內的遺傳變異幅度大于種源間；而樣本數量為4個，顯示為種源間遺傳變異幅度大于種源內。此外，不同樣本數量揭示出的種源間親緣關系不同，如樣本數量超過8個，15個種源的聚類結果基本一致；而樣本數量為4個，聚類結果無法反映白樺群體的親緣關系。最后，提出了白樺遺傳多樣性研究時樣本數量的計算公式，認為白樺多態位點百分率達98.5%的樣本數量應為11個。圖4表3參23

林木遺傳育種學；白樺；遺傳多樣性；樣本容量

林木種質資源是陸地生物的避護所和主基因庫。林木種質資源的丟失，將引起鄰近生物種及其種質以4～13倍的速率丟失［1］。了解林木群體的遺傳背景、遺傳結構及群體間的親緣關系，是林木遺傳多樣研究和采取科學有效措施保護其種質資源的前提和基礎［2］，也為林木資源的開發與利用提供信息。到目前為止，先后采用不同的標記技術對眾多的林木遺傳多樣性進行了研究［3-6］。群體遺傳參數是群體遺傳學研究的主要內容之一，估算值的大小受群體樣本數量的影響。林木為異交物種，需要一定的數量才能代表1個群體，因此群體內個體數量的多少可能對群體遺傳參數估算產生一定影響。然而，長期以來，在樹木遺傳多樣性研究中，群體內個體數量對遺傳參數研究結果的影響研究尚無報道。序列相關擴增多態性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）標記建立以來，由于其操作簡便、成本低、可信度高、易于測序等特點倍受分子生物學家的青睞［7］，被迅速應用到花生Arachis hypogaea，油菜Brassica napus等植物［8-14］的種質資源鑒定評價、遺傳圖譜構建、重要性狀標記以及基因克隆等方面。白樺Betula platyphylla是一種分布范圍廣、適用性強、用途廣泛的闊葉速生樹種，然而，有關白樺遺傳多樣性研究中，同樣也沒有重視種源內樣本數量對遺傳參數估算的影響問題［15］。本研究以東北林業大學帽兒山試驗林場15個白樺種源為對象，采用SRAP技術分析了白樺種源內不同樣本數量對其遺傳多樣性參數估算的影響，以期確定白樺遺傳多樣性分析的種源內個體最優數量，也為其他樹種遺傳多樣性研究提供參考。

1　材料與方法

1.1植物材料

試驗材料來自東北林業大學帽兒山實驗林場內白樺種源試驗林，共15個種源，分別為涼水、汪清、新疆、露水河、小北湖、輝南、桓仁、莫爾道嘎、草河口、綽爾、寧夏、清源、東方紅、帽兒山、烏伊嶺。隨機選取個體20個·種源-1，共計300個樣本。2012年6月采取當年生嫩葉，用密封袋封好，做好標記，放在冰盒中帶回，置于－70℃冰箱中保存，以備提取DNA。

1.2試驗方法

1.2.1白樺葉片基因組DNA提取白樺葉片基因組DNA提取參考文獻［16］。

1.2.2SRAP標記分析SRAP反應體系為20.00 μL：0.21×106μg·L－1DNA，1.50 μL；25 mmol·L－1Mg2+，1.40 μL；5×16.67 μkat·L－1Taq酶，0.25 μL；2.5 mmol·L－1三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs），2.00 μL；10 μmol·L－1引物，0.35 μL。聚合酶鏈式反應（PCR）反應程序為：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，35℃復性1 min，72℃延伸1 min，5個循環；94℃變性1 min，50℃復性1 min，72℃延伸1 min，30個循環，72℃延伸7 min。根據文獻［17］中的引物序列，本研究中所用SRAP引物由上海生工合成。從親緣關系最近的2個種源（莫爾道嘎和桓仁）中分別選5個個體用于多態性引物的篩選。

1.2.3遺傳多樣性參數的估算15個白樺種源，每個種源按包含4，8，12和20個個體為研究對象，利用篩選出的17對引物對其擴增后分析各項的遺傳參數。電泳圖譜中的每條帶均代表了引物與模板DNA互補的一對結合位點，可記為1個分子標記。根據分子量標準對照反應產物在膠上的對應位置，估計擴增產物的分子量大小，有帶的記為 “1”，無帶的記為 “0”。所得結果為一二元數據矩陣，利用Popgene 32軟件計算各項遺傳參數。利用NTsys 2.10e軟件分析各源間聚類關系，利用Mintable 15軟件分析群體多態位點百分數與群體內個體數量之間的關系和作圖。

2　結果與分析

2.1基因組DNA的質量檢測及多態性SRAP引物篩選

使用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取的白樺基因組DNA在質量濃度為10.0 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳成像后如圖1所示。樣品DNA為1條清晰明亮的條帶，無明顯拖尾、彌散或其他異?，F象。隨機抽取部分樣品經紫外分光光度計檢測，D（260）/D（280）值約1.8。因此可以認為提取的DNA純度較高，符合SRAP-PCR擴增要求［18］。

前期基于表型研究的白樺種源實驗結果表明：莫爾道嘎和桓仁親緣關系最近，因此，本研究中，從這2個種源內各隨機選擇5個個體用于引物的篩選。以條帶清晰并且群體與個體間有差異條帶的引物為選擇標準，從合成的30對引物中進行篩選。圖2中5個泳道為1組擴增結果，從左開始分別為莫爾道嘎和桓仁的種源及個體，圖2為引物me2em3組合擴增結果。從圖2可看出：該引物擴增時，不僅2個種源間存在差異性條帶，且同一種源內不同個體間也有清晰差異條帶。這表明引物me2em3符合引物選擇的標準，可用于白樺群體遺傳多樣性的研究。按此標準，從合成的30對引物中，篩選出17個條帶清晰、多態性高的引物用于實驗分析（表1）。

圖1　部分白樺樣本基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果Figure 1　Detection of Betula platyphlla genomic DNA using agarose gel electrophoresis

圖2　白樺SRAP引物（me2em3）的篩選Figure 2　Primer selected for SRPA of B.platyphlla

表1　SRAP引物序列Table 1　primer sequences of SRAP

2.2白樺種源不同樣本數量估算的群體遺傳多樣性

表2　不同樣本數量估算的遺傳參數比較Table 2　Comparison of different sample size estimation for genetic parameters

利用17對SRAP引物分別對包含4，8，12和20個樣本個體的白樺共15個種源進行擴增后分析，并利用POP gene軟件計算各遺傳參數。表2為不同樣本數量時白樺群體遺傳多樣性各參數的平均值。結果發現：樣本數量不同時，各項遺傳參數平均數也存在一定差異。這說明樣本數量對白樺群體的遺傳參數估算有一定的影響。如當群體樣本數量分別為4，8，12，16和20時，各群體的多態位點分別為129，132，133，133和134個，多態位點百分率為95.56%～99.26%。平均等位基因數為1.955 6～1.985 2，有效等位基因數為1.420 7～1.427 0，Nei's指數的變動范圍為0.256 9～0.259 3，Shannon指數的變動范圍為0.400 8～0.404 1。進一步分析發現，在不同樣本數量條件下，各項遺傳參數變異最大種源均為涼水，如當群體樣本數量為 4時，共檢測到 135個位點，其中多態位點有 129個，多態位點百分率達95.56%。多態位點百分率為 17.78%～52.33%，平均等位基因數為1.177 8～1.533 3，有效等位基因數為1.112 6～1.356 6，Nei's指數的變動范圍為0.066 0～0.205 9，Shannon指數的變動范圍為0.098 3～0.304 2，上述的遺傳參數均表現為涼水種源各項遺傳參數最大，且在15個種源間變化趨勢一致。當群體樣本數為8，12，16，20時涼水種源各項遺傳參數均最大。而各項遺傳參數最小的種源隨樣本數量的變異均不同，如樣本數量為12時，共檢測到135個位點，其中多態位點有133個，多態位點百分率達98.52%，多態位點百分率為34.07%～77.78%，平均等位基因數為1.340 7～1.777 8，有效等位基因數為1.166 7～1.420 9，Nei's指數為0.101 5～0.249 2，Shannon指數為0.156 6～0.378 5。上述遺傳參數中，汪清種源各項遺傳參數最??；而樣本數量為16時，共檢測到135個位點，其中多態位點有 133個，多態位點百分率達98.52%，種源的多態位點數為47～108，多態位點百分率為34.81%～80.00%，平均等位基因數為1.348 1～1.800 0，有效等位基因數為1.180 0～1.425 4，Nei's指數為0.108 1～0.251 1，Shannon指數為0.165 0～0.381 2，上述遺傳參數中，清源種源的各項遺傳參數最??；樣本數量為8和4時，各項遺傳參數最小的為淖爾種源。此外，4個樣本數量與其他樣本數量之間的平均等位基因數，多態位點數，多態位點百分率，Ht，Hs，Gst和Nm差異較大。

表2同時也表明：樣本數量對白樺群體內與群體間遺傳變異大小的研究結果也有影響。如當群體樣本數量為4時，47.78%的遺傳變異存在于種源內，52.22%的遺傳變異存在于種源間。當群體內樣本數量超過8時，研究反映出白樺種群內遺傳變異幅度超過群體間；如群體樣本數量為8時，58.82%的遺傳變異存在于種源內，41.18%的遺傳變異存在于種源間；當群體樣本數量為20時，65.88%的遺傳變異存在于種源內，34.12%存在于種源間。

2.3不同樣本數量對群體間親緣關系分析結果的影響

為了進一步分析種源內樣本數量差異對于白樺遺傳結構研究結果的影響，筆者又研究了不同樣本數量下的白樺種源遺傳進化關系。圖3表明：樣本數量對于白樺種源遺傳進化關系分析結果有一定的影響。如種源樣本數量超過12時，15個種源的聚類結果基本一致（圖3 C，圖3D和圖3E），均可在遺傳距離為0.17時，分成4個類群，而且每個類群包括的種源基本一致。樣本數量為8時，在0.17的遺傳距離處，15個種源則劃分為5個類群，其中涼水種源單獨聚成一類（圖3B）。而種源樣本數量為4時，在0.17的遺傳距離處，15個種源被劃分成7個類群，反映不出群體進化的基本規律（圖3A）。此時，只有當遺傳距離達到0.25左右時，15個種源才可劃分成4類，但涼水種源單獨聚成一類，帽兒山、東方紅和烏伊嶺種源聚成一類，新疆和露水河種源聚成一類，其余9個種源聚成一類。由此可見：當樣本數量僅有4個時，其揭示的白樺群體間的親緣關系與樣本數量為8個和超過12時存在差異。而且，種源樣本數量為4時，15個種源遺傳距離變化范圍為0.050 6～0.280 0，其中清源和寧夏種源的遺傳距離最小，桓仁和烏伊嶺種源的遺傳距離最大。當種源樣本數量為分別8，12，16和20，15個種源間在0.044 0～0.212 5范圍內變化，而此時淖爾和涼水種源間的遺傳距離最大，莫爾道嘎和桓仁種源的遺傳距離最小。

2.4樣本數量和主要遺傳參數的相關分析

由于樣本數量對白樺遺傳參數與遺傳結構的分析結果均產生一定的影響，因此為弄清樣本數量與各遺傳參數之間的具體關系，分析了不同樣本數量與其對應的各項遺傳參數作相關性。結果（表3）表明：種源內不同樣本數量與白樺群體多態位點百分率、群體內遺傳變異和群體間遺傳變異參數相關性顯著，與總位點數、多態位點數和基因流的相關性不顯著。這進一步表明，在研究異交群體遺傳多樣性時，應科學估算出群體樣本的最佳數量。

2.5白樺遺傳多樣性研究時樣本數量的確定

表3　樣本容量與主要遺傳參數的相關性Table 3　Correlation between sample size and main genetic parameters

白樺種源樣本數量與一些遺傳參數之間存在顯著或極顯著相關性，這為確定白樺遺傳多樣性研究時，確定合理的樣本數量提供了可能。在群體遺傳多樣性研究中，多態位點百分率越高越有利于分析和研究群體遺傳多樣和遺傳結構，因此對白樺種源不同樣本數量與多態位點百分率進行擬合分析（圖4），在95%的置信區間內，兩者之間呈一元二次曲線關系，決定系數為89%，表明兩者之間存在較好的相關性。我們在白樺遺傳多樣性研究時，在綜合考慮成本、技術難度等基礎上，根據所需多態位點百分率大小，計算出所需樣本的數量。如當白樺遺傳多樣性研究時，以最低所需多態位點百分率98.5%為標準，則每個種源所需樣本數量為10.673個，實際操作中可設為11個樣本個體。

圖3　不同樣本數量時15個白樺種源聚類圖Figure 3　Different number of samples for 15 birch provenance clustering map

3　討論與結論

對于異交植物，種群內和種群間遺傳變異較大，必須有一定數量個體才能代表該種群的基因庫，因此群體樣本數量會對研究結果產生影響。如HENSEN等［19］在研究白鮮Dictamnus albus時發現，其遺傳多樣性及多態位點隨群體樣本容量的不同而發生變化，而且群體大小、多態位點百分率和遺傳多樣性間存在顯著的相關性。本研究表明：白樺種源內樣本數量對白樺群體多態位點百分率、群體內遺傳變異和群體間遺傳參數影響顯著，對總位點數、多態位點數和基因流影響不顯著。ZHAO等［20］研究發現不同樣本容量的野生大豆Glycine soja種群間得到的遺傳多樣性指數存在較大差異。本研究同樣發現：白樺種源樣本數量不同時，其估算的遺傳多樣性指數也存在一定差異。如樣本數量為4時，多態位點數和百分率最大與最小的種源分別為涼水和淖爾，而樣本數量超過8個時，則為涼水和清源。此外，種源內不同個體數量反映的種源內與種源間的遺傳變異不同，如種源內樣本數為4時，白樺種源間的遺傳變異大于種源內。而當群體樣本數量超過8時，白樺種源內的遺傳變異幅度大于種源間。

本研究發現：群體樣本數量對遺傳群體間遺傳距離的分析結果產生一定的影響，如源樣本數量為4時，清源和寧夏種源的遺傳距離最小，桓仁和烏伊嶺種源的遺傳距離最大。而樣本數量超過8時，淖爾和涼水的遺傳距離最大，莫爾道嘎和桓仁的遺傳距離最小。這與樣本數量超過10時，通過表型分析得到的研究結果相同，如高玉池等［21］利用表型性狀對帽兒山地區10年生白樺種源間的親緣關系進行了分析，結果表明淖爾和涼水的遺傳距離最大，莫爾道嘎和桓仁的遺傳距離相對較小。此外，樣本數量也對白樺種源間的遺傳進化關系分析結果有一定的影響，如在相同的遺傳距離處（0.17），樣本數量為4時，15個種源被劃分成7個類群；樣本數量為8時，15個種源被劃分成5個類群；樣本數量超過12時，15個種源被劃分成4個類群。上述分析表明：群體樣本數量不僅對白樺各群體的遺傳參數產生影響，也對群體間遺傳進化關系的分析結果有一定的影響。

圖4　白樺種源樣本數量與多態位點百分率的關系Figure 4　Relationship between Betula platyphylla provenances samples and the percentage of polymorphic loci

異交植物多少個體才能代表一個群體，才能得到較為客觀真實的遺傳多樣性參數在草本植物或花卉植物中有所研究。如SINGH等［22］在研究野生二粒小麥Triticum dicoccoides的遺傳多樣性時發現，有的群體5～6個個體就可以使多樣性標準差不大于10%，個別一些則需12個以上的個體。JULIO等［23］發現，薔薇Rosaceae種群個體數超過10個以后，就不能提供更多的種群雜合度信息。本研究發現：白樺種源內樣本的數量與其多態位點百分率呈一元二次曲線相關，且決定系數達89%。并以此為公式計算白樺遺傳多樣性研究時，如設定要探測到的多態位點百分率達98.5%以上時，每個種源至少必須含有11個樣本個體。

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Genetic parameters of Betula platyphylla provenances due to sample size

BI Zhihong，WEI Minjing，LIU Yingying，YANG Chuanping，WEI Zhigang
（State Key Laboratory of Forest Genetics and Breeding，Northeast Forestry University，Harbin 150040，Heilongjiang，China）

Population genetic parameters，one of the main constituents of population genetics，and the size of estimated values are influenced by the number of population samples.In this study Betula platyphylla （birch）from Cap Mountain Experimental Forest Farm's Provenance Testing Forest was chosen as the experimental object and sequence related amplified polymorphism（SRAP）technology was used for analysis.Results showed that genetic parameters with different sample sizes had different effects on birch.Genetic variation，population of birch groups，and the percentage of polymorphic numbers within populations influenced genetic parameters.Influence from genetic variation and genetic parameters between groups was strong，but total numbers，polymorphic numbers，and gene flow were not affected.When the sample size was greater than eight，genetic variation amplitude of the birch source was greater than that of the provenances；when the sample size was four，genetic variation was greater than the source of genetic variation among provenances for different samples.For genetic relationships of different provenances with sample size greater than eight，15 kinds of source clustering results were basically the same.However，with a sample size of four，clustering results did not reflect the evolutionary relationship between birch groups.Also，11 birch samples were found to have a polymorphic number that was 98.5%.［Ch，4 fig.3 tab.23 ref.］

forest tree breeding；Betula platyphylla；genetic diversity；sample capacity

S722.3

A

2095-0756（2016）04-0564-07

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.04.003

2015-06-10；

2015-10-09

國家高技術研究發展計劃（“863”計劃）項目（2011AA100202）

畢志宏，從事木材次生生長等研究。E-mail：bizhihong9191@163.com。通信作者：魏志剛，教授，博士，從事林木遺傳育種等研究。E-mail：zhigangwei1973@163.com