玉屏風散對肺氣虛證模型大鼠免疫功能的影響Δ

楊　勝，張仲林，袁明勇，鄭玲利，李　燕，廖昌軍

（1.成都醫學院藥學院，成都　610083；2.成都醫學院第一附屬醫院藥劑科，成都　610500）

玉屏風散對肺氣虛證模型大鼠免疫功能的影響Δ

楊勝1＊，張仲林1，袁明勇2#，鄭玲利2，李燕2，廖昌軍1

（1.成都醫學院藥學院，成都610083；2.成都醫學院第一附屬醫院藥劑科，成都610500）

目的：考察玉屏風散對肺氣虛證模型大鼠免疫功能的影響。方法：將60只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、陽性組［人參北芪片0.6 g（生藥）/kg］和玉屏風散高、中、低劑量組［24、12、6 g（生藥）/kg］，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠均采用二氧化硫+風寒綜合刺激法復制肺氣虛證模型。造模成功后，各給藥組大鼠ig相應藥液，正常組和模型組大鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續13 d。給藥結束后，測定大鼠血清中白細胞介素（IL）-3、IL-6水平及T淋巴細胞中CD3+、CD4+、CD8+比例，觀察肺、支氣管組織病理變化。結果：與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-3、IL-6水平及T淋巴細胞中CD8+比例明顯升高，T淋巴細胞中CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值降低（P＜0.01）；肺、支氣管明顯損傷并伴有炎癥反應。與模型組比較，陽性組和玉屏風散高劑量組大鼠血清中IL-3水平明顯降低；陽性組和玉屏風散高、中劑量組大鼠血清中IL-6水平、T淋巴細胞中CD8+比例明顯降低，T淋巴細胞中CD3+比例明顯升高；各給藥組大鼠血清中CD4+比例、CD4+/CD8+比值明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；肺、支氣管損傷及炎癥反應程度減輕。結論：玉屏風散可增強肺氣虛證模型大鼠的免疫功能。

玉屏風散；肺氣虛證；免疫功能；T淋巴細胞；大鼠

玉屏風散出自朱丹溪的《丹溪心法》，具有益氣、固表、止汗之功效，主要用于治療氣虛自汗、易感風寒的中醫肺氣虛證，多用于反復呼吸道感染、慢性支氣管炎、支氣管哮喘、肺氣腫、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）等多種慢性肺系疾病。研究顯示，肺氣虛時常伴有免疫功能降低或紊亂的現象，且隨病情的加重免疫功能異常更為明顯［1］。據報道，玉屏風散具有提高機體自身免疫力的功效［2］，但系統研究其對肺氣虛證大鼠系列免疫細胞因子及肺、支氣管組織病理改變的報道相對較少。本課題組前期研究了玉屏風散對肺氣虛證大鼠血清免疫球蛋白E、脾淋巴細胞增殖活性、腹腔巨噬細胞活性、脾自然殺傷（NK）細胞殺傷活性的影響［3］。本實驗在此基礎上，通過復制中醫肺氣虛大鼠模型，進一步研究其對肺氣虛證大鼠白細胞介素（IL）-3、IL-6和T淋巴細胞增殖及對肺、支氣管組織病理的影響。

1　材料

1.1儀器

Power Wave XS2酶標儀（美國Bio Tek公司）；KDC-40低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；FACS-Calibur流式細胞儀（美國BD公司）；CX21BIM-SET6生物顯微鏡（美國Olympus公司）。

1.2藥品與試劑

人參北芪片（黑龍江鼎恒升藥業有限公司，批號：120713，規格：0.3 g/片）；IL-3酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號：wti31512i）；IL-6 ELISA檢測試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，批號：wti61512i）；CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞ELISA檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，批號：wtc31512c、wtc41512c、wtc81512c）。

1.3藥材

黃芪、炒白術、防風（四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號：1507063、1510052、1506022），經成都醫學院生藥教研室李羿教授鑒定均為合格藥材。

1.4動物

健康SPF級SD大鼠60只，♀♂各半，體質量250～280 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供［動物合格證號：SCXK-（川）2013-24號］。

2　方法

2.1玉屏風散藥液制備

按2015版《中國藥典》（一部）［4］玉屏風口服液處方配比及文獻方法［5］，稱取黃芪約180 g、炒白術約60 g、防風約60 g。將防風剪碎，提取揮發油；將剩余藥渣與黃芪、白術一起加8倍量水浸泡30 min，煎煮2次，第1次1.5 h，第2次1 h，合并煎液，濾過，收集濾液。用70%乙醇使藥渣沉淀，取上清液，減壓回收乙醇，加水攪勻，靜置。取上清液濾過，液濾于70～80℃水浴中濃縮為每1 ml藥液相當于2 g生藥量的浸膏，再加入防風揮發油，混勻，4℃保存，備用。

2.2動物分組、給藥與造模

將60只SD大鼠隨機分為6組，即正常組、模型組、陽性組和玉屏風散高、中、低劑量組，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠均采用二氧化硫+風寒綜合刺激法［6］復制肺氣虛證模型；造模期間大鼠正常飲食。造模成功后，陽性組大鼠ig人參北芪片藥液0.6 g（生藥）/kg（人臨床給藥劑量的10倍劑量），玉屏風散各劑量組大鼠分別ig玉屏風散藥液24、12、6 g（生藥）/kg（分別為人臨床用量的50、25、12.5倍劑量），正常組和模型組大鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續給藥13 d；給藥期間各組大鼠正常飲食。

2.3指標檢測

實驗結束后，于大鼠股動脈取血，將血液于4℃靜置過夜，以離心半徑為16 cm、3 000 r/min離心10 min，收集血清。采用ELISA法檢測血清中IL-3、IL-6含量，具體操作按照相應試劑盒說明書進行。于眼眶靜脈取血，分離血清，用流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+和CD8+比例。取血完成后，脫頸椎處死大鼠，分離肺、支氣管組織，于10%甲醛溶液中固定，常規洗滌、脫水、石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察大鼠肺、支氣管病理變化。

2.4統計學方法

3　結果

3.1各組大鼠血清中IL-3、IL-6含量檢測結果

與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-3、IL-6含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，陽性組和玉屏風散高劑量組大鼠血清中IL-3、IL-6含量顯著減少，玉屏風散中劑量組大鼠血清中IL-6含量顯著減少（P＜0.01）。各組大鼠血清中IL-3、IL-6含量檢測結果表1。

3.2各組大鼠外周血T淋巴細胞中CD3+、CD4+、CD8+比例檢測結果

與正常組比較，模型組大鼠外周血T淋巴細胞中CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值均顯著降低，CD8+比例顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，陽性組及玉屏風散高、中劑量組大鼠外周血T淋巴細胞中CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值均顯著升高，CD8+比例顯著降低（P＜0.01）；玉屏風散低劑量組大鼠外周血T淋巴細胞中CD4+比例顯著升高，CD4+/CD8+比值顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠外周血T淋巴細胞中CD3+、CD4+、CD8+比例檢測結果見表2。

表1　各組大鼠血清中IL-3、IL-6含量檢測結果（±s，n=10）Tab 1　Content results of IL-3 and IL-6 in serum of rats in each group（±s，n=10）

表1　各組大鼠血清中IL-3、IL-6含量檢測結果（±s，n=10）Tab 1　Content results of IL-3 and IL-6 in serum of rats in each group（±s，n=10）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.01

IL-6，ng/ml 107.4±9.77 165.9±10.77＊110.3±11.41#123.9±5.53#131.6±14.71#161.1±8.51組別正常組模型組陽性組玉屏風散高劑量組玉屏風散中劑量組玉屏風散低劑量組劑量，g/kg 0.6 24 12 6 IL-3，pg/ml 108.1±6.93 158.2±11.62＊116.3±14.91#145.7±12.68#152.9±13.11 153.9±10.67

表2　各組大鼠外周血T淋巴細胞中CD3+、CD4+、CD8+比例檢測結果（±s，n=10）Tab 2　Proportions results of CD3+，CD4+and CD8+in T lymphocyte of peripheral blood in rats in each group（±s，n=10）

表2　各組大鼠外周血T淋巴細胞中CD3+、CD4+、CD8+比例檢測結果（±s，n=10）Tab 2　Proportions results of CD3+，CD4+and CD8+in T lymphocyte of peripheral blood in rats in each group（±s，n=10）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

5.1±0.94 1.1±0.14＊4.4±0.43##2.9±0.37##2.4±0.35##1.6±0.23#組別正常組模型組陽性組玉屏風散高劑量組玉屏風散中劑量組玉屏風散低劑量組劑量，g/kg CD3+，%CD4+/CD8+0.6 24 12 6 70.9±5.29 51.3±2.12＊68.7±4.59##65.3±3.93##63.8±2.75##53.3±2.15 CD4+，% 66.0±6.88 24.1±3.66＊59.7±3.98##41.2±4.20##36.7±3.49##33.1±4.06##CD8+，% 13.1±1.23 22.5±1.67＊13.6±1.44##14.5±1.00##15.5±2.54##21.4±2.19

3.3各組大鼠肺、支氣管組織病理觀察結果

3.3.1肺組織病理觀察結果正常組大鼠肺泡間隔連續、無纖維組織增生，肺泡腔內無分泌物及炎性滲出、間質小血管無擴張；模型組大鼠肺泡組織輕度擴張，部分肺泡間隔斷裂、纖維組織增生、管腔縮小，肺泡腔內見少量滲出物及紅細胞，肺間質內小血管明顯充血（淤血）、可見較多炎性細胞浸潤；陽性組大鼠肺泡未見擴張，肺泡間隔無增厚、無斷裂，間質未見血管擴張充血，無炎性細胞浸潤；玉屏風散低劑量組大鼠肺泡中度擴張，肺泡間隔稍增厚、偶見斷裂，間質血管擴張充血，有炎性細胞浸潤；玉屏風散中劑量組大鼠肺泡輕度擴張，部分肺泡間隔稍增厚、偶見斷裂，間質有少許血管擴張充血、少量炎性細胞浸潤；玉屏風散高劑量組大鼠肺泡間隔偶見斷裂，無纖維組織增生、紅細胞及炎性滲出，間質小血管不擴張，散在少數淋巴細胞。各組大鼠肺組織HE染色結果見圖1。

3.3.2支氣管組織病理觀察結果正常組大鼠支氣管管腔無擴張、腔內無分滲出物，黏膜上皮完整、纖毛不倒伏，黏膜上皮下間質無水腫、散在少數淋巴細胞；模型組大鼠支氣管黏膜上皮不連續，見大量脫失、斷裂，支氣管腔內可見較多滲出物、管壁小血管輕度擴張充血，黏膜上皮下間質明顯水腫，其間可見較多炎性細胞浸潤；陽性組大鼠支氣管管腔無擴張、纖毛規則、管腔內無滲出、管壁間質小血管無充血、無炎性細胞浸潤；玉屏風散低劑量組大鼠支氣管管腔擴張、纖毛粘連倒伏，管腔內見滲出，管壁間質小血管中度充血、有炎性細胞浸潤；玉屏風散中劑量組大鼠支氣管管腔擴張、纖毛粘連倒伏，管腔內見少量滲出，管壁間質小血管輕度充血、有部分炎性細胞浸潤；玉屏風散高劑量組大鼠支氣管管腔無明顯擴張，支氣管黏膜柱狀上皮完整，纖毛粘連倒伏，見少許滲出，管壁散在少數淋巴細胞。各組大鼠支氣管組織HE染色結果見圖2。

4　討論

圖1　各組大鼠肺組織HE染色結果（×200）Fig 1　HE staining of lung tissue of rats in each group（×200）

圖2　各組大鼠支氣管組織HE染色結果（×200）Fig 2　HE staining of bronchus tissue of rats in each group（× 200）

由T淋巴細胞分泌合成的IL-3對肥大細胞、嗜酸性粒細胞等的增殖、分化具有較強的促進作用，可使嗜酸性粒細胞向呼吸道炎癥區浸潤，從而使血管內皮發生炎性反應，刺激支氣管，最終導致哮喘等疾病的發生。研究表明，支原體肺炎伴喘息患兒血液中IL-3含量顯著增加，而后逐漸出現哮喘癥狀；而由巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞等多種細胞釋放的IL-6是構成COPD氣道炎癥的重要炎癥因子，其能促進、加速局部炎癥的發生發展，最終導致氣道結構的重塑和氣道阻塞的形成［7-8］。在COPD患者肺組織中存在明顯的氣道重塑，表現為氣道平滑肌組織增生，氣道壁纖維化，炎癥細胞在氣道、肺血管、肺實質的浸潤等。本研究復制的肺氣虛大鼠的肺、支氣管病理改變與文獻報道一致，說明本研究復制的肺氣虛癥大鼠模型是成功的。在急性加重期COPD患者血清、痰液中IL-6含量明顯高于緩解期［9-11］，患者體內IL-3、IL-6含量與患者病情輕重具有相關性，且與患者預后也有一定的聯系，同時對藥物治療有明顯的指導作用。本研究結果顯示，玉屏風散能顯著降低肺氣虛大鼠外周血中IL-3、IL-6含量（P＜0.01），進而抑制嗜酸性粒細胞的活化和減少嗜酸性粒細胞浸潤，最終改善氣道阻塞形成的氣虛癥狀。人參北芪片具有扶正固本、補氣升陽、補虛生津的功用，用于肢體倦怠、神疲乏力、多夢健忘等癥，對肺氣虛證有明確的治療作用［3］，故在本研究中以此為陽性藥物。

通過監測外周血中T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+比例，可以判斷機體的細胞免疫功能，對臨床疾病的發病機制的探討及預后判斷具有重要意義。據文獻［12-13］報道，慢性支氣管炎大鼠外周血中淋巴細胞增多，以CD8+為主；同時CD8+活化浸潤與血管內皮生長因子（VEGF）的表達和小氣道炎癥損傷浸出相關。CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值降低越明顯，提示患者的免疫功能越紊亂，機體抵抗力下降。姜素麗等［14］報道，具有益肺健脾等功效的中藥能顯著改善COPD穩定期患者細胞免疫功能。玉屏風散可通過刺激未成熟的粒細胞、巨噬細胞分化成熟，提高機體的免疫功能［15］。方中炒白術健脾，白術多糖對氫化可的松導致免疫抵制小鼠的脾臟T淋巴細胞增殖反應有明顯的恢復作用［16］；防風走表，驅散風邪，防風多糖能明顯增加體外培養的巨噬細胞釋放IL-1和IL-8［17］；防風和黃芪共同使免疫功能降低并趨向正常，而當機體免疫功能偏低時，黃芪則能使之增強。本研究結果顯示，肺氣虛證大鼠經玉屏風散治療后，外周血T淋巴細胞中的CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值均明顯升高，CD8+比例明顯降低，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），說明玉屏風散有直接或間接升高肺氣虛大鼠外周血中CD3+、CD4+比例和CD4+/CD8+比值及降低CD8+比例的功能，從而發揮對機體的免疫調節作用。

綜上所述，玉屏風散對肺氣虛證大鼠肺、支氣管損傷具有一定的保護作用，可能是通過調節大鼠免疫功能實現的。本研究為后續分析玉屏風散調節免疫功能化學成分及探討發揮免疫調節作用的具體藥效物質基礎提供了實驗依據。

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（編輯：林靜）

Effects of Yupingfeng Powder on Immune Function of Rats with Lung-qi Deficiency Syndrome

YANG Sheng1，ZHANG Zhonglin1，YUAN Mingyong2，ZHENG Lingli2，LI Yan2，LIAO Changjun1
（1.School of Pharmacy，Chengdu Medical College，Chengdu 610083，China；2.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China）

OBJECTIVE：To study the effects of Yupingfeng powder on immune function of rats with lung-qi deficiency syndrome.METHODS：60 SD rats were randomly divided into normal group，model group，positive group［Renshen beiqi tablet 0.6 g （crude drug）/kg］and Yupingfeng powder high-dose，medium-dose and low-dose groups［24，12，6 g（crude drug）/kg］，with 10 rats in each group.Except for normal group，those groups were given SO2+comprehensive cold stimulation to induce lung-qi deficiency syndrome model.After modeling，treatment groups were given relevant drug solutions intragastrically，and normal group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically，once a day，for consecutive 13 d.After administration，serum levels of IL-3 and IL-6，the proportion of CD3+，CD4+，CD8+in T lymphocyte were determined，and pathological changes of lung and bronchus were observed.RESULTS：Compared with normal group，serum levels of IL-3 and IL-6 and the proportion of CD8+in T lymphocyte increased significantly in model group，while the proportions of CD3+and CD4+in T lymphocyte and the ratio of CD4+/CD8+decreased（P＜0.01）；obvious lung and bronchus injury and inflammatory reaction were observed.Compared with model group，serum level of IL-3 decreased significantly in positive group and Yupingfeng powder high-dose group；serum level of IL-6 and the proportion of CD8+in T lymphocyte decreased significantly in positive group and Yupingfeng powder highdose and medium-dose groups，while the proportion of CD3+in T lymphocyte increased significantly；the proportion of CD4+and the ratio of CD4+/CD8+increased significantly in treatment groups（P＜0.05 or P＜0.01）；lung and bronchial injury，and inflammation reaction were relieved.CONCLUSIONS：Yupingfeng powder can enhance immune function of rats with lung-qi deficiency syndrome.

Yupingfeng powder；Lung-qi deficiency；Immune function；T lymphocyte；Rats

R285

A

1001-0408（2016）22-3041-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.06

四川省科技廳立項科研課題（No.2012JY0035）；四川省衛生廳立項科研課題（No.130391）

＊講師，碩士。研究方向：中藥藥理學。電話：028-62308610。E-mail：1310832723@qq.com

副主任藥師，碩士。研究方向：中藥藥理學、臨床藥學、藥事管理。電話：028-83016983。E-mail：yuanmingyong226@163.com

2016-03-21

2016-05-16）