柏薏灌腸液的提取工藝研究

李　燕，趙利剛，王慧麗，鄭麗娜，闞淑月

（1.唐山市婦幼保健院藥劑科，河北唐山　063000；2.華北理工大學藥學院，河北唐山　063000）

柏薏灌腸液的提取工藝研究

李燕1＊，趙利剛2，王慧麗1，鄭麗娜1，闞淑月1

（1.唐山市婦幼保健院藥劑科，河北唐山063000；2.華北理工大學藥學院，河北唐山063000）

目的：優化柏薏灌腸液的提取工藝。方法：采用星點設計-響應面法。以鹽酸小檗堿、阿魏酸和干膏率的總評歸一值（OD）為評價指標，考察加水量和提取時間對提取工藝的影響；同時進行驗證試驗。結果：最優提取工藝為第1次加11倍水煎煮70 min，第2次加5倍水煎煮30 min。驗證試驗中第1次提取的OD值為0.940 0，與預測值偏差-2.07%；第2次提取的OD值為0.851 8，與預測值偏差-2.41%。結論：柏薏灌腸液的提取工藝合理可行，適用于工業化生產。

柏薏灌腸液；星點設計-響應面法；鹽酸小檗堿；阿魏酸；干膏率

柏薏灌腸液處方由黃柏、薏苡仁、蒲公英、紫花地丁、三棱、莪術、桃仁、紅花、路路通、益母草、車前子、牛膝等12味藥材組成，具有清熱利濕、消炎止痛之功效，治療濕熱蘊結型盆腔炎療效顯著。該方劑在唐山市婦幼保健院臨床應用已有十余年，療效確切。但以往一直憑醫師、藥師經驗對處方中藥材進行煎煮提取，缺乏系統性。為對提取工藝進行系統研究，筆者采用星點設計-響應面分析法［1-3］，優化了柏薏灌腸液的提取工藝。

1　材料

1.1儀器

高效液相色譜儀，配置LC-20AT泵、SPD-20A紫外可見光檢測器、SL-20A自動進樣器、島津LC Solution色譜工作站（日本島津公司）；BP211D型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；HH-S型恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫療儀器廠）。

1.2藥品、試劑與藥材

鹽酸小糪堿對照品（批號：110713-201212，純度：96.7%）、阿魏酸對照品（批號：110773-201313，純度：99.6%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，甲醇、三氯甲烷、磷酸、鹽酸、乙醚為分析純，均購自天津四友公司；黃柏（批號：20140201）、薏苡仁（批號：20140401）、蒲公英（批號：20140101）、紫花地?。ㄅ枺?0140101）、三棱（批號：20140301）、莪術（批號：20140301）、桃仁（批號：20140201）、紅花（批號：20140401）、路路通（批號：20140401）、益母草（批號：20140301）、車前子（批號：20140201）、牛膝（批號：20140401）均購自石家莊柏林藥材加工廠，經我院藥材鑒別師鑒定均符合2010年版《中國藥典》（一部）各項下規定。

2　方法與結果

2.1提取液的制備

按照處方比例稱取藥材，加水煎煮得第1次提取液，濾過、濃縮、備用；第1次煎煮所得濾渣加水煎煮得第2次提取液，濾過、濃縮、備用。

2.2鹽酸小檗堿含量的測定[4]

2.2.1色譜條件色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（40∶60，V/V）；檢測波長：265 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μl。

2.2.2對照品溶液的制備精密稱取鹽酸小檗堿對照品12.10 mg于100 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液；精密量取對照品貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，置于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備分別精密量取“2.1”項下制備的第1次、第2次提取液各20 ml，加濃氨溶液5 ml，用三氯甲烷振搖提取3次，每次20 ml；合并三氯甲烷提取液，過濾，蒸干濾液，殘渣加甲醇溶解至10 ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm針式濾器過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.4方法學考察根據相應方法進行試驗。結果鹽酸小檗堿的回歸方程為y=1.435×104x-2.324×104（r=0.999 8），線性范圍為6.05～60.5 μg/ml；精密度試驗中峰面積RSD=0.7% （n=9）；重復性試驗中鹽酸小檗堿含量RSD=1.3%（n=6）；平均加樣回收率為98.3%，RSD=1.5%（n=6）；檢測限（信噪比為3時）為0.101 μg/ml，定量限（信噪比為10時）為0.336 μg/ml；鹽酸小檗堿與相鄰雜質峰的分離度為2.01，表明該方法可用于柏薏灌腸液中鹽酸小檗堿的含量測定。

2.3阿魏酸含量的測定[5-6]

2.3.1色譜條件色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（30∶70，V/V）；檢測波長：322 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μl。

2.3.2對照品溶液的制備精密稱取阿魏酸對照品10.40 mg 于100 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品貯備液；精密量取對照品貯備液0.2、0.4、0.8、1.5、2.0 ml，置于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列對照品溶液。

2.3.3供試品溶液的制備精密量取“2.1”項下制備的提取液50 ml，加濃鹽酸（37.5%）2.5 ml，用乙醚振搖提取3次，每次50 ml；合并乙醚提取液，過濾，蒸干，殘渣加甲醇溶解（第1次提取液至10 ml量瓶中，第2次提取液至5 ml量瓶中）稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm針式濾器過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.3.4方法學考察結果根據相應方法進行試驗。結果阿魏酸的回歸方程為y=1.682×104x-2.632×104（r=0.999 4），線性范圍為6.05～60.5 μg/ml；精密度試驗中峰面積RSD=0.9% （n=9）；重復性試驗中阿魏酸含量RSD=1.7%（n=6）；平均加樣回收率為98.6%，RSD=1.8%（n=6）；檢測限（信噪比為3時）為0.125 μg/ml，定量限（信噪比為10時）為0.416 μg/ml；阿魏酸與相鄰雜質峰的分離度為3.20，表明該方法可用于柏薏灌腸液中阿魏酸的含量測定。

2.4干膏率的測定

精密量取“2.1”項下制備的提取液20 ml，置于干燥至恒質量的蒸發皿中，水浴蒸干，105℃干燥至恒質量，計算干膏率（%）=干膏質量/復方藥材質量×100%。

2.5提取工藝優化

2.5.1因素及水平考察根據處方中藥材特性，結合實際生產經驗，采用水煎提取法，影響提取工藝的主要因素有加水倍量（A）、提取時間（B）和提取次數。其中提取次數為非連續變量，不適合回歸處理，故預先對提取次數進行單因素考察，結果以2次為佳。根據預試驗結果，確定第1次和第2次提取的加水倍量和提取時間的水平，因素與水平見表1、表2。

表1　第1次提取的因素與水平Tab 1　Factors and levels of the first extraction

表2　第2次提取的因素與水平Tab 2　Factors and levels of the second extraction

2.5.2試驗設計根據星點設計法則設計試驗，按處方比例稱取藥材飲片（黃柏30 g、薏苡仁60 g、蒲公英60 g、紫花地丁60 g、三棱20 g、莪術20 g、桃仁20 g、紅花20 g、路路通20 g、益母草24 g、車前子24 g、牛膝20 g，相當于1 000 ml制劑量），按照不同的加水倍量和提取時間進行提取。第1次提取液濃縮至1 000 ml，濾過，進樣測定；第2次提取液濃縮至500 ml，濾過，進樣測定。將鹽酸小檗堿和阿魏酸的含量及干膏得率的總評歸一值（OD）作為評價指標。將鹽酸小檗堿含量、阿魏酸含量、干膏得率3個指標用Hansan法進行歸一化，每個指標均標準化為0～1之間的歸一值，公式為：di=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）（di為各指標的歸一值，Yi為各指標的實測值，Ymin為各指標中的最小值，Ymax為各指標中的最大值）。再以各指標歸一值求算幾何平均數，公式為：OD=（d1×d2…×dk）1/k（k為指標數）［7-8］。試驗安排與結果見表3、表4。

表3　第1次提取的試驗安排與結果Tab 3　Arrangement and results of the first extraction

表4　第2次提取的試驗安排與結果Tab 4　Arrangement and results of the second extraction

2.5.3模型擬合及方差分析以OD值為因變量，使用Desgin Expert 8.0.6對2次提取的因素進行二次式擬合，Y1和Y2分別為第1次和第2次提取的擬合方程的因變量。結果Y1=-2.925 91+ 0.575 60A+0.017 797B+1.827 05×10-4AB-0.025 886A2-1.436 18×10-4B2、Y2=-0.580 52+0.487 45A+7.705 23×10-3B+ 2.789 98×10-3AB-0.053 962A2-3.285 05×10-4B2。方差分析結果見表5、表6。

表5　第1次提取的方差分析Tab 5　Analysis of variance for the first extraction

由方差分析結果可知，第1次和第2次提取的回歸方程，模型項P均小于0.05，失擬項P均大于0.05，相關系數r1= 0.900 2，r2=0.908 6，說明回歸方程擬合度良好，模型準確度較好，可以用該模型對實際情況進行預測。

表6　第2次提取的方差分析Tab 6　Analysis of variance for the second extraction

2.5.4提取工藝條件的確定根據回歸方程，繪制相應的響應曲面圖，詳見圖1、圖2。通過Design Expert 8.0軟件分析，得到2次提取的OD值的最大值點。結果，第1次和第2次最佳的加水倍量和提取時間分別為11.36倍、69.16 min，5.41倍、34.71 min。結合實際生產，確定2次提取的工藝參數分別為11倍、70 min和5倍、30 min。

圖1　第1次提取的三維響應面圖Fig 1　3D response surface of the first extraction

圖2　第2次提取的三維響應面圖Fig 2　3D response surface of the second extraction

2.6驗證試驗

依照最佳提取工藝參數對第1次和第2次提取工藝進行3次驗證試驗，結果見表7。第1次提取實際OD值為0.940 0，與預測值0.959 9偏差-2.07%；第2次提取實際OD值為0.851 8，與預測值0.872 8偏差-2.41%，表明本研究建立的數學模型具有良好的預測性，可用于該制劑提取工藝的優化。

表7　工藝驗證試驗結果Tab 7　Results of validation test

3　討論

柏薏灌腸液以黃柏、薏苡仁解祛濕邪為君藥：黃柏性寒、味苦，為清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡之主藥，其有效成分主要為小檗堿、黃柏堿、巴馬汀等生物堿類成分［9］；薏苡仁具有利水滲濕、健脾止瀉、除痹排膿、解毒散結之功。蒲公英、紫花地丁清熱解毒為臣藥：蒲公英主要有效成分為咖啡酸、綠原酸、阿魏酸等酚酸類，具有抗菌、抗炎、抗病毒的作用［10］。三棱、莪術、桃仁、紅花、路路通、益母草、車前子活血祛瘀為佐藥。牛膝補益肝腎為使藥?，F代研究表明，藥材中含有的生物堿類和酚酸類成分均易溶于熱水［11-12］，故仍然采用傳統水煎提取工藝。

君藥黃柏的有效成分為鹽酸小檗堿，蒲公英、益母草、三棱、牛膝中均含有阿魏酸有效成分，故本研究選擇鹽酸小檗堿和阿魏酸作為評價指標，分別以生物堿類和有機酸類有效成分的轉移率來考察提取工藝。筆者在預實驗中曾選擇咖啡酸作為評價指標，但咖啡酸在提取過程中不穩定、難以測準，故最終選擇測定方法較為成熟穩定的阿魏酸。薏苡仁雖為君藥，但因其活性成分含量較少、測定方法復雜，故未對其進行定量測定。由于中藥制劑成分復雜、有效成分較多，因此結合干膏率共同作為評價指標。

星點設計-效應面法在試驗設計和結果表達方面較正交設計法和均勻設計法更適宜進行非線性模型擬合，能夠提高優化預測的精確性，更好地體現因素、指標與效應值的關系［13-14］。本研究還通過歸一化消除了不同評價指標的量綱不同帶來的影響，然后運用OD值對多個評價指標進行綜合評分，再進行模型擬合，從而預測最佳提取條件，適合于多成分中藥制劑的工藝優化。

本研究采用星點設計-效應面法優化了柏薏灌腸液的2次提取工藝條件，建立的工藝合理可行、提取率高、重現性好，適用于工業化生產。

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（編輯：劉明偉）

Optimization of Extraction Technology for Baiyi Rectal Solution

LI Yan1，ZHAO Ligang2，WANG Huili1，ZHENG Lina1，KAN Shuyue1
（1.Dept.of Pharmacy，Tangshan Maternal and Child Health Hospital，Hebei Tangshan 063000，China；2.College of Pharmacy，North China University of Science and Technology，Hebei Tangshan 063000，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Baiyi rectal solution.METHODS：The effects of water amount and extraction time on extraction technology were investigated by central composite design-response surface method using OD value of berberine hydrochloride and ferulic acid and the extract yield as index.Validation test was also conducted.RESULTS：The optimal extraction technology was as 11-fold water，decocting 70 min for the first time；5-fold water，decocting 30 min for the second time.In validation test，OD value of first extraction was 0.940 0，and the bias between observed and predicted values was-2.07%；that of second extraction was 0.851 8，and the bias was-2.41%.CONCLUSIONS：The extraction technology of Baiyi rectal solution is reasonable，feasible and suitable for industrial production.

Baiyi rectal solution；Central composite design-response surface methodology；Berberine hydrochloride；Ferulic acid；Extract yield

TQ461

A

1001-0408（2016）22-3145-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.36

＊主管藥師，碩士。研究方向：醫院制劑。電話：0315-3726722。E-mail：liyan_syphu@163.com

2015-10-19

2016-06-14）