液氮蒸汽熏蒸時間對犬精子冷凍效果的影響

滑志民，張似青，趙熠群，張陳華，曾　暉，杜　波

(上海農林職業技術學院 動物科學技術系，上海 201699)

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液氮蒸汽熏蒸時間對犬精子冷凍效果的影響

滑志民，張似青，趙熠群，張陳華，曾暉，杜波

(上海農林職業技術學院 動物科學技術系，上海 201699)

本試驗研究了0.5 mL細管冷凍保存犬精液過程中液氮熏蒸時間對精子冷凍效果的影響。試驗分為5組，將精液細管置于液氮液面上方2 cm處，分別熏蒸0 min(直接投入液氮)、1 min、2 min、4 min、8 min。解凍后通過活率、活力、畸形率及頂體完整率對精子進行評估。結果：液氮蒸汽熏蒸0 min和1 min組精子活率和活力顯著低于其它各組(P<0.05)。與直接投入液氮相比，在液氮蒸汽中預冷凍超過2 min能夠提高精子頂體完整率(P<0.05)。本試驗表明在使用0.5 mL細管冷凍犬精子時，液氮熏蒸時間在4～8 min較為適宜。

犬；精子冷凍；液氮熏蒸

犬精子冷凍技術可有效解決名貴種公犬稀少，跨地域配種，種公犬因腿傷不能配種等問題，還可充分發揮種公犬的繁殖潛能，加快優良基因的擴散及種質資源保存等。在我國，犬采用冷凍精液人工授精還沒有廣泛開展，但也有一些研究和嘗試。在精液冷凍過程中降溫速度是影響冷凍效果的重要因素之一，有些研究已經開始用程序降溫冷凍儀來精確控制冷凍降溫速度和過程，但多數還是用液氮熏蒸法冷凍犬的精液，該法操作簡單，無需特殊冷凍設備。本試驗就液氮熏蒸時間對犬精子冷凍效果進行了研究。

1　材料與方法

1.1試驗動物

試驗犬為中型畢格公犬5只，2～6歲，健康，繁殖性能良好，均能正常采精。飼養于上海農林職業技術學院實驗動物場，犬舍帶有運動場，每日飼喂兩次商品犬糧，自由飲水。

1.2主要器材和試劑

0.5 mL細管(富士平)、顯微鏡(SMZ745，尼康公司)、顯微鏡用恒溫板(HW-1，金壇市宏華儀器廠)，自動精液分析儀(北京偉力新世紀科技發展有限公司)、恒溫臺(QB2000，海南其林貝爾儀器制造有限公司)、電熱恒溫水浴箱(HH-W420金壇市醫療儀器廠)、電子天平(AL204，梅特勒-托利多公司)。冷凍液配制所需藥品及試劑均購自Sigma公司。

1.3精液采集

采用按摩法采精，每3 d采精1次。采精前用37°C無菌生理鹽水清洗包皮內外，然后用一只手握住陰莖龜頭球部位進行反復按摩，待其陰莖充分勃起射精后，另一手持無菌燒杯收集乳白色富含精子的部分。將燒杯中的精液轉移入無菌離心管，置于37°C水浴中保溫。經鏡檢，活力達到0.7以上為合格精液，用于試驗研究[1]。

1.4精液冷凍保護液的配制

將2.4 g三羥甲基氨基甲烷(Tris)，1.4 mg/mL檸檬酸，0.8 g葡萄糖，5萬IU青霉素，5萬IU鏈霉素溶于100 mL純水中，用磁力攪拌器攪拌30 min混合均勻，過濾除菌備用。上述溶液配好后加入20%的卵黃和5%的甘油配成精液稀釋液。

1.5精液稀釋與冷凍

將采集的所有精液混合，精液密度儀測定密度，按照稀釋后密度為8×107個/mL來計算稀釋倍數，采用二次稀釋法立即稀釋。首先將已預熱到37°C的稀釋液緩慢地注入到含有鮮精的試管中，精液與稀釋液比例為1∶1，緩慢搖勻后放入4 ℃冰箱平衡1.5 h，從冰箱中取出，加入4°C稀釋液，最終精子的密度調整為8×107個/mL，再次放入4 ℃冰箱平衡30 min，精液分裝于0.5 mL的細管中，封口，做好標記，準備冷凍。

精液冷凍采用液氮熏蒸法預冷，將裝入精液的細管置于冷凍架上，細管與液氮面保持2 cm。根據試驗設計設置不同的熏蒸時間，熏蒸后投入液氮中保存1周以上。

1.6精液的解凍與質量評定

將細管從液氮中取出，迅速投入37 ℃的水浴中，保持20 s解凍，顯微鏡下檢測精子活率和活力，通過Giemsa染色檢查精子畸形率和頂體完整率[1]。

1.7試驗設計

試驗分為5組，根據細管在液氮蒸汽中熏蒸時間的不同分為：0 min(直接投入液氮)、1 min、2 min、4 min、6 min和8 min組。冷凍好的精子解凍后，檢查其活率、活力、畸形率和頂體完整率，來確定較適當的熏蒸時間。每組取3只細管解凍檢查，數據以3次平均值來表示。

1.8數據分析

數據分析應用Excel軟件中的方差分析。

2　結果

通過表1可看出，液氮蒸汽預冷凍2 min、4 min、8 min三組間精子活率和精子活力沒有顯著差異(P>0.05)，而三組均極顯著高于液氮蒸汽熏蒸0 min組(P<0.01)，顯著高于液氮蒸汽熏蒸1 min組。同時液氮蒸汽熏蒸1 min組的精子活率和精子活力均顯著高于液氮蒸汽熏蒸0 min組(P<0.05)。

表1液氮蒸汽熏蒸時間對精子活動力的影響

液氮蒸汽熏蒸時間/min01248精子活率/%3.26±0.58aA23.09±2.21bAB41.95±5.84cB49.20±3.96cB48.73±4.57cB精子活力/%2.48±0.39aA18.73±1.88bAB33.52±3.28cB42.83±4.02cB42.49±4.13cB

注：同一行內不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，同一行內不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

表2液氮蒸汽熏蒸時間對精子頂體和形態的影響

形態檢查液氮蒸汽熏蒸時間/min01248頂體完整率/%26.59±3.56a37.93±5.79a58.46±5.73b61.18±5.04b60.62±3.68b畸形率/%29.39±2.87a31.76±2.02a33.58±3.37a35.37±3.52a36.21±3.98a

注：同一行內不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表2可知，在頂體完整率方面，液氮蒸汽熏蒸2 min、4 min、8 min三組無顯著差異(P>0.05)，但三組均比液氮蒸汽熏蒸1 min和0 min組有顯著升高(P<0.05)?；温史矫?，各組之間沒有顯著差異(P>0.05)。

3　討論

本試驗表明，在使用0.5 mL細管冷凍保存犬精液時，熏蒸0 min，即直接投入液氮，解凍后精子存活率和精子活力極低，分別只有3.26%和2.48%。而樣品即使在液氮蒸汽中熏蒸1 min，精子運動能力也顯著提高，精子存活率和精子活力達到了23.09%和18.73%，在液氮蒸汽預冷凍大于2 min，效果更顯著，精子活率達40%以上。這表明過于快速的降溫對精子會造成致死性的損傷。在熏蒸2 min以上各組精子頂體完整率較直接投入液氮也有顯著提高。精子的頂體是覆蓋于精子核前2/3以上區域的囊性結構，冷凍過程會導致精子質膜和頂體受到不同程度的損傷。有研究認為冷凍對犬精子頂體結構破壞較牛精子更為嚴重，主要表現為頂體的空泡化和膨脹[3]。本試驗表明，將犬精液細管不經液氮蒸汽預冷凍，直接投入液氮，對精子頂體會造成較嚴重的損傷。在精液冷凍過程中，如果降溫速度太快，大量的水分會滯留在細胞中，導致細胞內冰晶的形成，細胞膜受損，進而死亡。另外一方面，如果降溫速度太慢，細胞外液先形成冰晶，細胞內水分子會向細胞外流動，細胞可能皺縮，胞內溶質濃度過高，也會對精子造成損害?？傊?，合適的降溫速度是精液冷凍成功的關鍵因素之一。當然，降溫速度通常還與細管的容量、冷凍保護液的成分、熏蒸時細管距液氮面的高度等因素有關。

本試驗表明，在使用0.5 mL細管冷凍犬精子時，細管在距液氮面2 cm的情況下，液氮熏蒸時間不應低于2 min，推薦熏蒸時間在4～8 min較為適宜。

[1]高雅，羅桂河，李衛東，等.不同濃度乙二醇和甘油對犬精液冷凍效果的影響[J].中國農學通報，2010，26(8)：25-28.

[2]劉璐，張劭俁，張彧，等.犬常規冷凍稀釋液中添加谷胱甘肽的研究[J].北京農業，2010，4月下旬刊：1-9.

[3]Luberda Z.The role of glutathione in mammalian gametes[J].Reprod Biol，2005，5(1)：5-17.

2016-05-27

上海農林職業技術學院院內科研課題(091124)

滑志民(1979-)，男，碩士，講師。研究方向：動物繁殖調控與胚胎工程。

E-mail：huazhimincn@163.com

S829.2

A

1005-2739(2016)05-0014-03