青海省果洛藏獒血液乳酸脫氫酶同工酶酶譜的研究

晁生玉，張才駿，張居農

(1.青海省海西動物疫控中心，青海 德令哈 817099；2.青海大學，西寧 810016；3.石河子大學，832000)

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青海省果洛藏獒血液乳酸脫氫酶同工酶酶譜的研究

晁生玉1，張才駿2，張居農3

(1.青海省海西動物疫控中心，青海 德令哈 817099；2.青海大學，西寧 810016；3.石河子大學，832000)

采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳法對青海省果洛州39 只藏獒的血清乳酸脫氫酶(S-LDH)和紅細胞乳酸脫氫酶(RBC-LDH)同工酶酶譜及其多態性進行了研究。結果發現：1)被檢藏獒的S-LDH 經電泳可分離出S-LDH1、S-LDH2、S-LDH3、S-LDH4 和S-LDH5等5條區帶，呈現出S-LDH1A(20.51%)和S-LDH1a(79.49%)兩種電泳表型而表現出多態性；2)RBC-LDH 經電泳可分離出RBC-LDH1、RBC-LDH2和RBC-LDH3等3條區帶，呈現出RBC-LDH2A(43.24%)和RBC-LDH2a(56.76%)兩種電泳表型；3)S-LDH同工酶5條區帶的相對電泳遷移率分別為53.0%、40.8%、25.5%、9.5%和3.8%。

藏獒；血清乳酸脫氫酶；紅細胞乳酸脫氫酶；同工酶

藏獒(Tibetan mastiff)是青藏高原一種特有的古老珍貴犬種，也是被公認的惟一不懼怕暴力的犬種。因其對高原低氧、干旱、寒冷多變的氣候有極強的適應性，且體大、兇悍、忠于主人以及護家性能強而深受廣大牧民群眾的喜愛，享有“東方神犬”的美稱，由此引起了國內外許多學者的關注。

近年來，有關藏獒的生物學特性、繁殖性能、疾病防治方面的報道明顯增加[1～4]。有關藏獒的血液學特性也有頗多報道，如晁生玉等對青海省德令哈藏獒的血液生化指標[5]，李動等對果洛藏獒血清蛋白質指標[6]，鮑林等對青海藏獒的血鉀濃度進行了研究[7]。LDH 是動物體內參與糖酵解的重要酶類，國內外學者對各種家畜LDH 同工酶酶譜進行了廣泛深入的研究，而晁生玉曾經對德令哈藏獒的血液乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)同工酶酶譜[8]做過研究，但目前尚未見青海省果洛州藏獒血液LDH 同工酶酶譜方面的資料。鑒于此，本實驗采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對果洛州藏獒的血清LDH 和紅細胞LDH 同工酶酶譜進行了研究。

1　材料與方法

1.1實驗藏獒

選用青海省果洛州瑪沁縣牧民自繁的藏獒 39只，其中公藏獒 22只，母藏獒17 只，臨床健康，營養良好。實驗用藏獒生活地的海拔高度在3 600～4 200 m。

1.2血樣的采集與處理

將藏獒側臥保定，剪毛消毒后，從其后肢外側小隱靜脈采取肝素鈉抗凝血和非抗凝血各3 mL，非抗凝血迅速送實驗室分離出血清，供血清LDH(S-LDH)同工酶酶譜分析?？鼓? 000 r/min 離心后傾去血漿，沉淀的紅細胞用0.154 mol/L(0.9%)氯化鈉溶液洗滌3 次，洗凈的紅細胞加入2 倍量蒸餾水，使紅細胞溶解，再次離心后制成透明紅色的紅細胞溶血液，供紅細胞LDH(RBC-LDH)同工酶酶譜分析。

1.3電泳

采用聚丙烯酰胺凝膠(PAG)垂直平板電泳法進行 LDH 同工酶酶譜的分析。電泳時，分離膠濃度為60 g/L，用pH 8.9 的Tris-HCl 緩沖液配制，濃縮膠濃度為30 g/L，用pH 6.7 的Tris-HCl 緩沖液配制，電泳槽內采用pH 8.3Tris-Gly 緩沖液。電泳時所用其他試劑按方丁等[9]描述的方法配制。電泳時使用DY-W2 型電泳儀(北京生化儀器廠出品)，DY-Ⅲ22A電泳槽(北京六一儀器廠出品)。電泳起始電流為15 mA，20 min 后增至25 mA，穩流電泳5 h。

1.4孵育與顯色

電泳膠板在 37 ℃水浴條件下孵育，孵育液按方丁等[9]描述的方法配制。經50～60 min，待紫色區帶清晰可見時，傾去孵育液，用蒸餾水沖洗電泳膠板后，在1.23 mol/L(7%)冰乙酸溶液中漂洗至膠板的背景呈無色為止。

1.5遷移率測定

用相對遷移率(Rf)表示，按張才駿等[10]記載的方法進行，即區帶移動距離(d)與指示線移動距離(D)之比(Rf=d/D)。

2　結果

2.1S-LDH 同工酶酶譜

被檢藏獒的 S-LDH 全部由5條同工酶區帶組成，從陽極到陰極依次為S-LDH1、S-LDH2、S-LDH3、S-LDH4 和S-LDH5。各同工酶區帶的Rf：S-LDH1 為53.0%，S-LDH2 為40.8%，S-LDH3 為25.5%，S-LDH4 為9.5%和S-LDH5 為3.8%。

2.2S-LDH 的多態性

根據 S-LDH 同工酶區帶著染強度，果洛藏獒的 S-LDH1 同工酶存在高活性的S-LDH1A 和低活性的S-LDH1a 兩種表型而表現出多態性(見圖1)。8 只果洛藏獒的S-LDH1 同工酶為高活性者，占20.5%(8/39)，31 只果洛藏獒的S-LDH1 為低活性者，占79.5%(31/39)。

2.3RBC-LDH 同工酶酶譜

被檢藏獒的 RBC-LDH 全部由3條同工酶區帶組成，從陽極到陰極依次為RBC-LDH1、RBC-LDH2 和RBC-LDH3。它們的Rf 分別與S-LDH1、S-LDH2、S-LDH3 相當。在3種同工酶中以RBC-LDH1 的染色強度最強(見圖1)。

2.4RBC-LDH 的多態性

根據 RBC-LDH 同工酶區帶著染強度，果洛藏獒的 RBC-LDH2同工酶存在高活性的RBC-LDH2A 和低活性的RBC-LDH2a 兩種電泳表型而表現出多態性。16 只藏獒為高活性的RBC-LDH2A 型，其RBC-LDH2 區帶濃染且寬，占43.24%(16/37)，21 只藏獒為低活性的RBC-LDH2a 型，其RBC-LDH2 區帶淡染且窄，占56.76%(21/37)。

藏獒 S-LDH和 RBC-LDH電泳模式圖1.RBC-LDH2A 型：2.RBC-LDH2a 型；3.S-LDH1a 型；4.S-LDH1A 型。

3　討論

3.1關于 S-LDH 同工酶

據報道[9]，動物的 S-LDH 從陽極到陰極通常有 LDH1、LDH2、LDH3、LDH4 和LDH5 五種同工酶。由于動物的種類不同，每種同工酶的比例可能有所差別。有關犬的 S-LDH，袁忠濱等[10]采用醋酸纖維素薄膜電泳法對新疆土種犬的 S-LDH 活性及其同工酶進行了研究，發現犬的S-LDH 也由 LDH1、LDH2、LDH3、LDH4 和 LDH5 五種同工酶組成，五種同工酶的活性從高到低依次為LDH5、LDH1、LDH2、LDH3 和LDH4。晁生玉等[8]對德令哈藏獒 S-LDH 的研究也發現，藏獒的 S-LDH 同樣由 LDH1、LDH2、LDH3、LDH4和LDH5五種同工酶組成。S-LDH同工酶的活性從高到低依次為LDH3、LDH1、LDH2、LDH4 和LDH5。本實驗發現果洛藏獒的S-LDH 也由五種同工酶組成。從區帶的著染強度來看，各種 S-LDH 同工酶活性的排序與晁生玉等[8]的排序相同。

3.2RBC-LDH 同工酶

據Серов等[11]在綿羊、Yegorov 等[12]在卡拉庫爾羊和希薩羊以及張才駿等[13，14]在藏羊和青海細毛羊中的的研究結果，綿羊的RBC-LDH 具有多態性，并證實它們受常染體位點一對共顯性等位基因的控制。張才駿等[15]還發現牦牛的RBC-LDH 也存在多態性。晁生玉等[8]對德令哈藏獒RBC-LDH 的研究發現，藏獒的RBC-LDH 同工酶也存在多態性，但其多態性出現在RBC-LDH2 同工酶中，即存在高活性的RBC-LDH2A(57.89%)和低活性的RBC-LDH2a(42.11%)兩種表型而表現出多態性，以RBC-LDH2A為優勢表型。本實驗對果洛藏獒RBC-LDH 的研究結果與晁生玉等[8]對德令哈藏獒RBC-LDH的研究結果相同，也存在高活性的RBC-LDH2A(43.24%)和低活性的RBC-LDH2a(56.76%)兩種表型而表現出多態性，但以RBC-LDH2a 為優勢表型。然而，經χ2 檢驗，果洛藏獒的RBC-LDH2 的表型頻率與德令哈藏獒的沒有顯著的差異(P>0.05)。但藏獒RBC-LDH2 多態性的遺傳規律尚待進一步加以研究證實。

[1]崔泰保，鄢珣.藏獒的選擇與養殖[M].北京：金盾出版社，2007.

[2]京九獒園.藏獒的生物學特性[EB/OL] mht!http：//www.sqjjay.cn/View_Article.asp?doc_id=156，2007-03-07.

[3]拉毛杰，喬桌瑪，李芙琴，等.瑪沁縣藏獒絳蟲感染情況調查[J].中國獸醫科技，2003，33(12)：43.

[4]湯澤桃，洪冬勝.藏獒因水土不服而致應激的治療[J].畜牧與獸醫，2004，36(1)：47.

[5]晁生玉，陳加英.德令哈藏獒15 項血液生化指標測定[J].青海畜牧獸醫雜志，1998，28(1)：6-7.

[6]李動，李才讓，尼瑪才讓，等.果洛藏獒血清蛋白質指標的研究[J].畜牧與獸醫，2000，32(1)：11-12.

[7]鮑林，李曉成，羅玉珠，等.藏獒血鉀濃度的測定[J].中國獸醫雜志，2004，40(6)：35.

[8]晁生玉.藏獒血清乳酸脫氫酶同工酶酶譜的電泳研究[J].青海畜牧獸醫雜志，2000，30(5)：15-16.

[9]方丁，房世榮.同工酶在醫學上的應用[M].北京：人民衛生出版社，1982.66-94.

[10]袁忠濱，楊麗華.犬LDH 活性及其同工酶的測定[J].中國獸醫科技，1988，(6)：55.

[11]Серов，О.Л.，Глазко，В.И.и Корочкин，Л.И.Генетический контроль зкспрессин гена алактатдегидрогеназы в зритроцитах овец[J].Генетика，1975，11(9)：27-31.

[12]YegorovE A，Balsayer S T，Prokhorva L M.Genetic control of lactate dehydrogenase polymorphism in sheeperythrocytes[J].Animal Breeding Abstracts，1979，47(6)：318.

[13]張才駿，張武學.三角城藏羊紅細胞乳酸脫氫酶同工酶酶譜[J].青海畜牧獸醫雜志，1993，23(6)：12-15.

[14]張才駿，張武學，李軍祥.青海細毛羊紅細胞乳酸脫氫酶同工酶的研究[J].中國養羊，1996，(2)：13-16.

[15]張才駿，魏雅萍，盧福山.大通家牦牛和含野血牦牛的紅細胞乳酸脫氫酶同工酶酶譜[J].青海畜牧獸醫雜志，1997，27(6)：4-6.

2016-05-26

晁生玉(1966-)，男，畜牧師。

E-mail：csy@163.com

張居農(1954-)，男，教授。

E-mail：zjnprof@sina.com

S829.2

A

1005-2739(2016)05-0016-04