果寡糖對急性氨氮應激下團頭魴非特異性免疫指標的影響

張春暖，任洪濤，張紀亮，吳秋玨，高小蟬，劉文斌

(1.河南科技大學動物科技學院，河南洛陽　471003;2.南京農業大學動物科技學院，南京　210095)

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果寡糖對急性氨氮應激下團頭魴非特異性免疫指標的影響

張春暖1，任洪濤1，張紀亮1，吳秋玨1，高小蟬1，劉文斌2

(1.河南科技大學動物科技學院，河南洛陽471003;2.南京農業大學動物科技學院，南京210095)

為研究氨氮應激條件下果寡糖對團頭魴(Megalobramaamblycephala)非特異免疫指標的影響，試驗選擇360尾初重為13.5 g的團頭魴隨機分為3組，每組4個重復，每缸30尾魚，對照組投喂基礎日糧，試驗組分別投喂果寡糖(FOS)添加量為0.4%和0.8%的日糧，飼養8周，養殖試驗結束后，用10 mg/L的NH4Cl對24尾魚進行氨氮應激試驗。試驗結果顯示，氨氮應激前，0.4% FOS組的血液谷丙轉氨酶(GPT)活性顯著低于對照組和0.8% FOS組，在氨氮應激后,0.4% FOS組的GOT活性有降低的趨勢，但僅在24 h時顯著低于0.8%組，0.8%組和對照組之間并無顯著差異；血清酸性磷酸酶、補體3(C3)、補體4(C4)、酚氧化酶都出現先升高后降低的趨勢，分別在應激后的3、24、12、12 h達到最大值。此外，應激前0.4% FOS組補體C3、C4、酚氧化酶的活性都顯著高于對照組，應激后0.4%FOS組C3在3 h處顯著高于對照組，但是在其它時間點各組差異并不顯著，果寡糖添加水平和采樣時間對這些免疫指標都無顯著的交互作用。結果表明飼料中添加0.4%的果寡糖能夠提高團頭魴的免疫力指標活性，提高了團頭魴抗氨氮應激的能力。

團頭魴(Megalobramaamblycephala)；果寡糖；氨氮應激；免疫

氨氮是水產養殖環境中重要的污染脅迫因子之一，在水體中以離子氨(NH4+)和非離子氨(NH3)2兩種形態存在,它們之間可以相互轉換，其中非離子氨因為不帶電荷，具有較強的脂溶性，能夠穿透細胞膜,表現出毒性效應[1]。水體中過高的氨氮和亞硝酸鹽氮能對魚蝦產生直接毒害作用，因為外界高濃度氨氮,會使魚類血液中氨氮濃度迅速升高而對魚類產生很大的毒害[2]。池水積累一定量非離子氨會對魚鰓表皮細胞造成損傷而使魚的免疫力降低[3]，許多學者研究認為在低于致死濃度的條件下，氨氮對魚、蝦鰓組織和生理功能(如氧消耗、氨排泄、滲透調節等)具有顯著影響[4]，近年來，由于高密度、集約化的養殖模式，水產動物排泄物的氨化作用增強，餌料利用率低，殘餌剩余較多，再加上硬骨魚類對氨氮毒性又非常敏感[5]，容易造成免疫力下降，病原菌感染加劇，死亡率升高。

果寡糖(GPT)是蔗糖分子以β-1,2糖苷鍵結合幾個(8個以下)D-果糖而形成的寡糖，作為有益微生物的一種養分來源，它們可通過選擇性刺激腸道中原有或外來菌種的生長和活性來影響宿主，對動物胃腸道微生物區系、免疫等功能有重要影響，在對三角魴(Megalobramaterminalis)、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)等研究的結果表明果寡糖能顯著提高其白細胞吞噬活性、血清溶菌酶活力、血清超氧化物歧化酶活力和補體含量[6-8]，但研究果寡糖在應激條件下，對魚類免疫狀況的影響至今還是空白。本實驗以團頭魴為研究對象，研究果寡糖在急性氨氮脅迫下對團頭魴(Megalobramaamblycephala)非特異性免疫反應的影響。為團頭魴養殖水環境調控和病害防治提供科學依據。

1　材料與方法

1.1試驗飼料

基礎日糧飼料配方及養分水平如表1所示。對照組投喂基礎日糧，試驗組飼料是在基礎日糧中分別添加0.4%、0.8%的果寡糖,其中，果寡糖由日本明治集團提供，果寡糖由蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)組成，且GF2+GF3+GF4≥95%，其它成分<5%；飼料原料購自江蘇帥豐飼料公司，原料粉碎后，均過60目篩，用逐級擴大法混勻后制成直徑為1.5 mm的顆粒飼料，自然風干后，放置于﹣20 ℃冰箱中保存備用。

表1　基礎日糧組成及營養水平(風干基礎)Tab.1　Composition and nutrient levels of basal diets(air dry basis)　%

注：每千克飼料包含以下礦物質和維生素：CuSO4·5H2O,20 mg;FeSO4·7H2O,250 mg;ZnSO4·7H2O,220 mg;MnSO4·4H2O,70 mg;Na2SeO3,0.4 mg;KI,0.26 mg;CoCl2·6H2O,1 mg;VA,9 000 IU;VD,2 000 IU;VE,45 mg;VK3,2.2 mg;VB1,3.2 mg;VB2,10.9 mg;煙酸 28 mg;VB5,20 mg;VB6,5 mg;VB12,0.016 mg;VC,50 mg;泛酸,10 mg;葉酸,1.65 mg;膽堿,600 mg。

1.2試驗魚與飼養管理

試驗用魚團頭魴由江蘇南京浦口基地提供。試驗魚在網箱中馴養15 d 后，選擇體質健壯，規格一致的幼魚，初始體質量(13.5±0.5)g的團頭魴360尾，隨機分成3組，其中1組為對照組，另外2組為試驗組，每組4重復，每個重復30尾魚，分別飼養于室外網箱(規格：1 m×1 m×1 m)中，每天投餌量為魚體重的3%～6%，根據吃食情況進行適度調整，每天投喂3次，投喂時間分別為7:30、12:30、17:30，試驗期間保持水體pH 7.0～8.0，溶氧>5.0 mg/L，氨氮<0.3 mg/L，亞硝酸鹽<0.1 mg/L，以保證水質優良。每天對天氣、水溫、攝食、死魚等情況進行記錄，養殖周期為8周。

1.3氨氮應激試驗

飼養結束后，把魚轉移到水族箱中，穩定2 d后，用氯化銨調制水中氨氮質量濃度10 mg/L，氨氮濃度的測定用次溴酸鹽氧化法，每隔2 h測一次水中氨氮濃度和pH值，保證其基本穩定，分別于應激前0 h和應激后3、6、12、24、48 h進行采樣。

1.4樣品采集與測定

分別在應激前后的各個時間點隨機從每缸中取3尾魚，用MS-222(100 mg/L)進行麻醉，尾靜脈采血，放入用一定濃度的肝素鈉潤過的離心管中。血樣于4 ℃冰箱中靜置2 h，然后在4 ℃,3000 g離心10 min，上清液移置-20 ℃冰箱中保存備用。

谷丙轉氨酶(GPT)和谷草轉氨酶(GOT)的測定采用葡萄糖氧化酶法，堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)的測定采用比色法，補體3(C3)、補體4(C4)和酚氧化物酶(PO)含量的測定采用的酶聯免疫吸附法，以上試劑盒均購自南京建成生物有限公司，詳細操作步驟見說明書。

1.5數據處理

試驗數據用SPSS 16.0軟件進行處理，用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)的方法分析果寡糖水平和采樣時間是否存在交互作用，若交互顯著則采用Tukey′s多重比較法檢驗各組間差異，P<0.05表示差異顯著。實驗結果以平均值±標準誤(Mean±SEM)表示。

2　結果

2.1果寡糖對團頭魴血清谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性的影響

由圖1,2可知，在氨氮應激下，各組團頭魴血清谷丙轉氨酶(GPT)和谷草轉氨酶(GOT)的活性呈升高趨勢。在應激前，各組GOT水平的差異不顯著，GPT活性 0.4% FOS組顯著低于對照組和0.8%FOS組。應激后，0.4%添加組的GPT活性有的趨勢，但僅在24 h時顯著低于0.8%組，0.8%組和對照組之間并無顯著差異，另外，FOS添加水平和采樣時間不存在交互作用。

圖1　氨氮應激下果寡糖對團頭魴血液 谷草轉氨酶活性的影響Fig.1　Effects of FOS on plasma GOT levels of blunt snout bream under ammonia stress

大寫字母表示同一個組在不同時間點的變化情況，小寫字母表示同一時間點各組之間的差異。(注釋下同)

圖2　氨氮應激下果寡糖對團頭魴血液 谷丙轉氨酶活性的影響Fig.2　Effects of FOS on plasma GPT levels of blunt snout bream under ammonia stress

2.2果寡糖對團頭魴血清堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的影響

由圖3，4可知，在氨氮應激下，各組血清堿性磷酸酶出現顯著降低趨勢，并在24～48 h幾乎趨于穩定；而酸性磷酸酶出現先升高后降低的趨勢，在3～6 h達到最高；飼料中添加FOS后，AKP、ACP活性都有所升高，但各組在采樣前后差異均不顯著，且雙因素分析得出果寡糖添加水平和采樣時間并無交互作用。

圖3　氨氮應激下果寡糖對團頭魴血液 堿性磷酸酶含量的影響Fig.3　Effects of FOS on plasma AKP levels of blunt snout bream under ammonia stress

圖4　氨氮應激下果寡糖對團頭魴血液 酸性磷酸酶活性的影響Fig.4　Effects of FOS on plasma ACP levels of blunt snout bream under ammonia stress

2.3果寡糖對團頭魴血清補體C3、C4和酚氧化物酶的影響

由圖5，6可知，在氨氮應激下各組血清補體C3在0～24 h呈升高趨勢，而C4在0～12 h呈升高趨勢，之后出現了降低趨勢；添加0.4% FOS組在應激前C3、C4都顯著高于對照組，且0.8% FOS組C3出現相似結果，氨氮應激后添加0.4%FOS組C3、C4都有升高趨勢，但是各組差異并不顯著；由圖7得出，氨氮應激前，酚氧化物酶(PO)在0.4%組顯著高于對照組，而0.8%組和對照組無顯著差異，氨氮應激后對照組呈先升高后降低的趨勢，但其它兩組并無顯著變化，且FOS水平和采樣時間對C3、C4和PO都無交互作用。

圖5　氨氮應激下果寡糖對團頭魴血液補體C3的影響Fig.5　Effects of FOS on plasma C3 levels of blunt snout bream under ammonia stress

圖6　氨氮應激下果寡糖對團頭魴血液補體C4的影響Fig.6　Effects of FOS on plasma C4 levels of blunt snout bream under ammonia stress

3　討論

3.1果寡糖對團頭魴血清谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性的影響

谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶是在動物組織細胞內參與氨基酸合成與分解的重要氨基酸轉移酶，在谷氨酸和丙氨酸的轉化中起著催化劑的作用，對蛋白質的代謝起著重要作用，它們的變化在一定程度上能夠反映機體肝細胞和心肌細胞的受損程度[9]，機體在正常情況下，血清中只有很少量的谷丙轉氨酶，但是但機體的肝組織受到損傷時，細胞膜的通透性會隨之增加，細胞漿內的谷丙轉氨酶釋放到血液中，本研究得出谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶都隨著氨氮應激時間的延長呈現先增高后降低的趨勢，并在應激后的12 h達到最大值，這可能是由于高濃度的氨氮脅迫導致機體脂質過氧化物增多，肝細胞受到損傷，影響了肝細胞的正常的生理功能，Jeney等[10]研究表明鯉(Cyprinuscarpio)受到高濃度氨氮脅迫后，血清谷丙轉氨酶活力出現類似的趨勢，胡毅等[11]的研究指出當用10 mg/L或20 mg/L的氨氮脅迫青魚時，其血清也出現谷丙轉氨酶升高的趨勢。這可能是因為隨著應激時間的延長，破壞魚類血清酸堿平衡和血清離子的衡態，影響了魚體內環境的穩定。非特異性免疫系統遭到破壞，免疫力下降，病原菌的易感染性也增強。但是在添加果寡糖0.4%組谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶的活性與對照組相比，都有一定程度的降低，這表明果寡糖在氨氮應激下有保護肝細胞和心肌細胞作用。

圖7　氨氮應激下果寡糖對團頭魴血液酚氧化物酶的影響Fig.7　Effects of FOS on plasma PO levels of blunt snout bream under ammonia stress

3.2果寡糖對氨氮應激下團頭魴血清酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性的影響

酸性磷酸酶在體內直接參與磷酸基團的轉移和代謝，間接增強機體的非特異性免疫能力，堿性磷酸酶是生物體內的一種重要的代謝調控酶,直接參與磷酸基團的轉移和鈣磷代謝,在魚類對營養物質的吸收與利用過程中發揮著重要作用。另外，堿性磷酸酶能夠改變病原體的表面結構，從而增強機體對病原體的識別和吞噬能力[12]。本實驗得出血清中酸性磷酸酶的活性呈先升高后下降的變化趨勢。堿性磷酸酶一直處于降化可能是因為魚生活在氨氮濃度較高的環境中，機體會進行一些適應性調節。在適當的環境脅迫下，可能會刺激一些酶活性的表達，酶的活性增強，但是隨著應激時間的延長，某些酶的構象會發生變化，不利于酶與底物的結合，從而導致活力下降，這說明機體對外界不良刺激的抵抗力下降，機體很容易受到外界不利因素的刺激而引發疾病，環境因子對組織中酶活性的影響及其作用機制還有待于進一步研究。本研究得出在應激前后血清酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性在0.4%果寡糖組顯著高于對照組和0.8%組，這表明果寡糖可以提高團頭魴的非特異性免疫，增強其抵抗氨氮應激的能力。這可能與果寡糖促進了益生菌比如芽孢桿菌和乳酸菌的生長和增殖有關[8]，而這些細菌的細胞壁的組成成分比如一些脂多糖等都具有增強免疫功能并能刺激機體的免疫反應，提高免疫力，另外，這些微生物能夠促進免疫因子和免疫球蛋白的分泌，增強機體的免疫活性[13]。

3.3果寡糖對氨氮應激下團頭魴血清補體C3、C4和PO活性的影響

血清補體活性已被證實是一項非常重要的非特異性防御指標，能夠保護機體抵御病原菌的感染[14]，補體C3、C4是補體系統中的固有成分，有調節機體非特異性免疫的功能[15]，本研究發現隨著應激時間的延長，補體C3、C4都出現先升高后降低的趨勢，這可能是因為魚類在受到氨氮脅迫后，引起了魚體的急性應激反應[9]，其通過大量分泌皮質醇來促進糖的合成、脂肪降解以獲得能量，并通過增加特定蛋白(如溶菌酶、補體和C反應蛋白等)的水平來增強機體的免疫力[9,16]，共同抵抗病原菌的侵襲，從而導致血清中某些蛋白的水平升高，當應激強度超出魚體防御機能時，這些蛋白的合成能力就會減弱，從而表現為某些酶的活性降低。周顯青等[17]研究結果表明，應激能夠降低中華幼鱉補體活性和含量，魚類受到氨氮應激后，魚體的免疫機能會受到影響，但是影響程度還會因種類的不同而有所差異[18]。

酚氧化酶是重要的免疫應答因子，在異物識別中起到重要作用。它在機體受到外界異物侵襲或者外界環境發生變化時，細胞會通過胞吐作用把酚氧化酶原釋放到周圍介質中，從而使酚氧化酶被激活，活性升高[19]。本實驗結果表明酚氧化酶隨著應激時間的延長呈現先升高后降低的趨勢，在應激后的12 h出現最大值，這表明氨氮急性應激刺激機體發生應激反應，神經內分泌系統分泌生物胺等內分泌因子，誘發啟動了proPO系統，酚氧化酶原系統釋放到周圍的細胞間質中，出現酶活性升高的現象，這與投喂芽孢桿菌的斑節對蝦在注射嗜水氣單胞菌后血液酚氧化酶活性有升高的現象相似。但是隨著應激時間的增長，酶活性出現下降趨勢，這可能是由于長時間的氨氮應激對酚氧化酶原的顆粒細胞造成了損傷[20]，導致PO活性的降低，黃鶴忠等[21]研究表明高濃度的氨氮隨著脅迫時間的延長，中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)血液中溶菌酶、酚氧化酶和超氧化酶的活性都出現下降的趨勢，機體的非特異免疫系統遭到損害，機體的細胞和組織都受到一定程度的損傷，由以上結果可以得出，氨氮對酚氧化酶的影響是一個比較復雜的過程，在一定程度上反映了機體的健康狀況，其作用機制還需進一步的研究。

飼料中0.4%的果寡糖提高了血清中C3、C4的含量和酚氧化物酶的活性，增強了團頭魴的免疫功能，并提高了抗氨氮應激的能力。

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(責任編輯：鄧薇)

Effects of fructooligosaccharide on nonspecific immunity of blunt snout bream (Megalobrama amblycephala) under high ammonia stress

ZHANG Chun-nuan1,REN Hong-tao1,ZHANG Ji-liang1,WU Qiu-jue1,GAO Xiao-chan1,LIU Wen-bin2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HenanUniversityofScientificandTechnology,Luoyang471003,Henan,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

This study aimed to determine the effects of fructooligosaccharide (FOS) on immune response of blunt snout bream (Megalobramaamblycephala) under high ammonia stress.A total of 360 fish were randomly distributed into three groups (each with four replicates) and were fed three levels of FOS (0,0.4% and 0.8%) for 8 weeks.After the feeding trial,24 fish per tank were exposed to ammonia at 10 mg/L.From the results,we found that Glutamic Pyruvic Transaminase (GPT) levels of fish fed 0.4% FOS were all significantly lower than that of the other groups at 0h and 24 h.After stress,Plasma acid phosphatase (ACP),complement 3 (C3),complement 4 (C4) and phenoloxidase (PO) activities all increased significantly with the maximum levels being attained at 3,24,12 and12 h,respectively.Thereafter,these parameters all decreased significantly.In addition,fish fed 0.4% FOS showed higher C3,C4and PO compared to that of control group before stress.Whereas,only the C3of fish fed 0.4% FOS showed higher than that of control group at 3 h after stress.There was no significant difference at other times and there was no significant interaction between the FOS levels and the time.The results indicated that the supplementation of 0.4% FOS could increase the non-specific immunity of blunt snout bream,and enhance its resistance to high ammonia stress.

Megalobramaamblycephala;fructooligosaccharide;ammonia stress;immunity

2015-12-16；

2016-06-20

國家大宗淡水魚類產業體系-鯉和團頭魴營養與飼料崗位(CARS-46-20)

張春暖(1987-)，女，河南平頂山人，講師，從事水產動物營養與飼料的研究。E-mail:zhangchunnuan12@163.com

劉文斌。E-mail:wbliu@njau.edu.cn

S963.73

A

1000-6907-(2016)05-0064-06