達氏鱘精巢細胞消化分離和超低溫冷凍保存

頡　璇,厲　萍,席萌丹,3,郭　威,3,喬新美,杜　浩,劉志剛,危起偉,3

(1.西南大學生命科學學院，重慶　400715；2.農業部淡水生物多樣性保護重點實驗室，中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢　430223；3.中國科學院水生生物研究所，武漢　430072)

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達氏鱘精巢細胞消化分離和超低溫冷凍保存

頡璇1,2,厲萍2,席萌丹2,3,郭威2,3,喬新美2,杜浩2,劉志剛2,危起偉1,2,3

(1.西南大學生命科學學院，重慶400715；2.農業部淡水生物多樣性保護重點實驗室，中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢430223；3.中國科學院水生生物研究所，武漢430072)

通過研究兩種酶對精巢細胞的消化效果，探究抗凍劑、降溫程序、糖類和卵磷脂對達氏鱘(Acipenserdabryanus)精巢細胞凍存效果的影響，獲得消化凍存后高存活率的細胞。實驗使用0.25%胰蛋白酶和2 mg/mL膠原酶 H+500 U/mL中性酶II的組合酶對達氏鱘精巢細胞進行消化，獲得不同消化時間內的活細胞數量。另外，還研究了冷凍稀釋液中分別添加10% 二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇(EG)、甲醇(MET)作為抗凍劑，采用-1 ℃/min慢速降溫以及直接投入液氮中的快速降溫方法凍存，冷凍稀釋液采用D-海藻糖或同濃度D-蔗糖，以及添加5%、8%、11%卵磷脂對凍存效果的影響。結果顯示：兩種消化酶在同一時間消化所得的活細胞數和活細胞率無顯著差異，并且都在3 h獲得最多活細胞。慢速降溫的凍存效果極顯著地好于快速降溫(P=0.01)。不同抗凍劑的保存效果差異顯著，復蘇后細胞相對存活率EG(51.70%±5.24%)>MET(45.09%±3.15%)>DMSO(40.18%±3.90%)。不同糖對達氏鱘精巢細胞凍存效果無顯著影響；不同濃度的卵磷脂凍存效果有極顯著差異。含8%卵磷脂的凍存液對細胞的凍存效果最好，細胞存活率可達(93.55±2.56)%，培養10 d后細胞數目為0 d時的3.19倍。

達氏鱘(Acipenserdabryanus)；胰蛋白酶；冷凍保存；抗凍劑；卵磷脂

達氏鱘(Acipenserdabryanus)屬鱘形目鱘科鱘屬，又名沙臘子、長江鱘，是我國特有物種，為淡水定居性鱘魚類[1]，主要分布于金沙江下游及長江上游，具有較高的經濟價值和科研價值。近30年來，由于葛洲壩工程的興建以及長江上游的環境污染、過度捕撈等原因，達氏鱘的資源已極為稀少[2-3],1990年以來未發現其自然繁殖，物種以人工群體維持延續，亟待加強其保護及其相關研究。

魚類種質資源保護和利用的策略包括個體水平以及細胞水平上的遺傳保護。目前魚類精子的超低溫保存技術已較為成熟，近年有關其他種質細胞的研究也逐步深入，其中有不少學者將研究集中于魚類生殖細胞的體外保存，與細胞移植技術結合，為魚類種質細胞的保存開辟了新的領域[4]。由于達氏鱘個體較大，性成熟時間長，因此養殖成本較高，通過對達氏鱘精巢細胞的保存可以有效地降低成本；此外，保存達氏鱘精巢細胞可以保護達氏鱘的遺傳多樣性，同時還可借助同種生殖細胞移植技術產生具有遺傳多樣性的可育后代，應用于保種和人工增殖放流。

對于細胞的超低溫冷凍保存研究，在哺乳動物中，目前已經有胚胎細胞、成纖維細胞、造血干細胞及生殖細胞凍存的報道[5-9]。在魚類中，丁鱥[10]、虹鱒[11]等魚類成功地保存了生殖細胞。目前，有學者研究了西伯利亞鱘精原細胞與卵原細胞的分離保存方法[12]，將分離后的細胞移植入小體鱘體內并成功增殖[13]，而對于達氏鱘種質細胞保存等方面的研究尚未見報道。本試驗研究了兩種酶對達氏鱘精巢細胞的消化效果，并從抗凍劑、降溫程序、糖類和卵磷脂四個角度探討了最適宜達氏鱘精巢細胞的冷凍保存方案。為鱘魚類精巢細胞的體外保存提供有效的理論依據和技術方案，為達氏鱘的生殖細胞移植做必要準備。

1　材料與方法

1.1實驗材料

本實驗所用達氏鱘來自長江水產研究所荊州市太湖中華鱘養殖基地。所用精巢樣本采集自20—24月齡雄性達氏鱘，該年齡的達氏鱘精巢處于II期末期。共12尾，體質量為( 6.27±0.83) kg；全長為( 107.33±2.11) cm。

1.2主要試劑

胰蛋白酶粉末(Worthington)；2.5% 胰蛋白酶-EDTA (Gibco)；膠原酶H(Roche)；D-海藻糖(Biosharp)；胎牛血清(FBS,四季青)；二甲基亞砜(DMSO,Wako)；Dipsae II，L-15 培養液，DNase I，D-蔗糖，卵磷脂，牛血清白蛋白(BSA)均購自Sigma公司。表皮細胞生長因子(EGF)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)購自普飛生物。甲醇(MET)、乙二醇(EG)為國產分析純。

1.3溶液配制

(1)冷凍稀釋液I：50 mmol/L D-海藻糖，5 mg/mL BSA，200 mL/L胎牛血清，溶于PBS (pH 8.0)；再加入青霉素 200 units/mL，鏈霉素 20 mg/L，兩性霉素B 50 mg/L；于0.2 μm過濾滅菌。

冷凍稀釋液II：50 mmol/L D-蔗糖，5 mg/mL BSA，200 mL/L胎牛血清，溶于PBS (pH 8.0)；再加入青霉素 200 units/mL，鏈霉素 20 mg/L，兩性霉素B 50 mg/L；于0.2 μm過濾滅菌。

(2)消化酶溶液：

a.5% 胰蛋白酶溶液 50 μL；胎牛血清 50 μL；膠原酶 H 100 μL；1% DNaseI 50 μL ；L-15培養液 750 μL，制成1 mL 0.25%胰蛋白酶消化液。于0.2 μm無菌過濾，現用現配。

B.50 μL 40 mg/mL膠原酶H，50 μL 10 000 U/mL 中性酶II，900 μL L-15 培養液；制成1 mL 2 mg/mL膠原酶 H+500 U/mL中性酶II組合酶溶液。于0.2 μm無菌過濾，現用現配。

1.4方法

1.4.1達氏鱘精巢細胞懸液制備

將雄性達氏鱘魚體全身消毒，帶入無菌間。迅速摘取無菌雙側精巢，置于盛有適量磷酸緩沖液(PBS,pH7.2～7.4)和抗生素(青霉素、鏈霉素及兩性霉素B)的培養皿中；剝去組織外膜和血管，將精巢組織剪碎至1 mm3小塊。精巢組織塊用L-15培養液加抗生素反復清洗，1 000 r/min，4 ℃離心5 min；重復清洗三次以上。將精巢組織放入事先稱重的離心管內稱重，以組織塊∶消化液=1∶4(w/v)分別加入胰蛋白酶溶液及組合酶溶液，將其移至六孔板內，分別放置于20 ℃和25 ℃(分別為0.25%胰蛋白酶和組合酶的最適溫度)培養箱中消化，每30 min吹打一次。消化2、3、4、5 h時加入胎牛血清終止消化，40 μm濾網過濾；濾液以1 000 r/min，4 ℃離心5 min。再用1 mL L-15+20% FBS溶液重懸細胞。并于顯微鏡下測定細胞活率。實驗重復6次，用于實驗的雄性達氏鱘6尾。

1.4.2細胞存活率測定

取少量細胞懸液和0.4% 臺盼藍溶液1∶1(v/v)混合后，顯微鏡下(40×,Leica,Germany)用血球計數板計細胞總數以及細胞存活率。

1.4.3細胞凍存

(1)抗凍劑和降溫方法篩選

在冷凍稀釋液I中分別添加10% DMSO，10% EG及10% MET作為抗凍劑，制成三種細胞冷凍保存液。設置兩種降溫程序：Cryo-I：慢速降溫：冰上平衡15 min，然后使用程序降溫盒，以1 ℃/min的速率降溫至-80 ℃，在-80 ℃停留30 min，投入液氮中。Cryo-II：快速降溫：冰上平衡15 min，然后直接投入液氮中。將以上三種細胞冷凍保存液和兩種降溫程序兩兩配伍，共設置6種保存方法。將精巢組織用0.25%胰酶消化2 h，檢測細胞活率后重新離心，用細胞冷凍保存液以1×105個/mL重懸細胞，分裝至凍存管中，再分別用兩種降溫方式凍存。每個實驗樣本保存3管，實驗重復3次，用于實驗的雄性達氏鱘3尾。

(2)糖和卵磷脂濃度篩選

在冷凍稀釋液I和冷凍稀釋液II中分別添加10% EG。制成兩種細胞冷凍保存液。在冷凍保存液中分別添加0%(空白對照)，5%，8%，11% 卵磷脂，于0.2 μm過濾除菌。將以上兩種細胞冷凍保存液和4個濃度的卵磷脂兩兩配伍，共設置8種保存方法。將精巢組織用0.25%胰酶消化2 h，檢測細胞活率后重新離心，用細胞冷凍保存液以1×105個/mL重懸細胞，分裝至凍存管中。冰上平衡15 min，然后使用程序降溫盒，以1 ℃/min的速率降溫至-80 ℃，在-80 ℃停留30 min，投入液氮中。每個實驗樣本保存3管，實驗重復3次，用于實驗的雄性達氏鱘3尾。

1.4.4細胞復蘇及復蘇率測定

從液氮中取出冷凍管，迅速放置于37 ℃水浴35 s，使其恰好融化，用適量L-15+10% FBS離心清洗細胞3次(1000 r，4 ℃離心5 min)；顯微鏡下臺盼藍染色計算細胞活率，觀察復蘇細胞形態，每次取樣統計細胞總數不低于800個。并將上述實驗方案細胞存活率最高的復蘇后接種于12孔板中，L-15+20% FBS+25 ng/mL EGF+25 ng/mL bFGF作為培養液，25 ℃恒溫培養箱中培養，觀察細胞生長狀況。

1.5統計分析

本實驗中，不同酶對達氏鱘精巢細胞的消化效果結果采用t-檢驗(t-test)分析；降溫方式、抗凍劑、糖及卵磷脂對精巢細胞凍存效果的研究采用雙因素方差分析(Two-Way ANOVA)進行統計分析。所有統計檢驗均應用spss 19.0軟件執行。

2　結果

2.1不同酶對達氏鱘精巢細胞的消化效果

兩種酶在不同時間的消化效果如表1。通過t檢驗分析，0.25% 胰蛋白酶和膠原酶+中性酶的組合酶在同一時間消化獲得的活細胞數無顯著差異(P>0.05)。兩種酶均在精巢組織被消化3 h可獲得最多的活細胞。

2.2降溫方法和抗凍劑對細胞活率的影響

學生要提高自我約束的能力。[4]高職院校管理相對高中較為松散，而學生的自我控制能力較差，容易導致整體學習積極性不高，學習風氣差。因此，學校要加強管理，學生要強化自我約束意識，加強紀律觀念，時刻銘記校風校紀，并以校風校紀約束自己。

對降溫方法、抗凍劑進行雙因素方差分析，結果顯示，降溫方法、抗凍劑交互作用不顯著(P>0.05)，兩種降溫方法對凍存細胞存活率的影響差異極顯著(P<0.05)，三種抗凍劑對細胞的保存效果也具有顯著差異(P<0.05)；從表2可看出，使用慢速降溫法的細胞存活率都高于使用快速降溫法的細胞；其中，EG作為抗凍劑保存的細胞凍存效果最好；復蘇后活細胞率為凍存前活細胞率的(51.70±5.24)%；而MET作為抗凍劑凍存的效果差于EG，DSMO的凍存效果最差。使用DMSO、EG、MET作為抗凍劑，通過快速降溫法保存的細胞相對存活率較低。顯微鏡觀察細胞形態，用慢速降溫復蘇后的細胞多數呈現透明、圓形飽滿良好的活細胞形態，而采用快速降溫保存的細胞復蘇后形態都有不同程度的破壞，細胞發生變形、破碎。

表1　不同酶消化達氏鱘精巢細胞的活細胞數量Tab.1　The quantity of living cells digested with two different types of enzymes.

注：圖中顯示數據表示平均數±標準差(n=6)。兩種酶消化效果無顯著差異(P>0.05)。

表2　不同抗凍劑和降溫方式保存細胞相對存活率 (n=3)Tab.2　Relative percentage of living cells cryopreserved by different cryoprotectants and freezing rate (n=3)

注：如圖所示細胞相對存活率±標準差；雙因素方差分析得出降溫方法、抗凍劑交互作用不顯著(P>0.05)，不同降溫方法對凍存細胞存活率的影響差異極顯著(P≤0.01)，不同抗凍劑對細胞的保存效果具有顯著差異(P<0.05)。

2.3糖和卵磷脂濃度對精巢細胞活率的影響

將細胞復蘇后檢測細胞活率，通過雙因素方差分析(two-way ANOVA)顯示，糖和卵磷脂交互作用顯著(P<0.05)。冷凍稀釋液中添加海藻糖與添加蔗糖的保存效果差異不顯著(P>0.05)，而不同濃度卵磷脂的添加對細胞凍存的影響差異極顯著(P<0.01)。從表3可看出，冷凍稀釋液使用海藻糖并添加8%的卵磷脂時，保存效果最好，細胞相對存活率可達(93.55±2.56)%。

表3　不同糖和卵磷脂濃度保存細胞相對存活率 (n=3)Tab.3　Relative percentage of living cells cryopreserved by different sugars and concentration of lecithin (n=3)

注：如圖所示細胞相對存活率±標準差；雙因素方差分析得出糖、卵磷脂濃度交互作用顯著(P<0.05)，不同糖對凍存細胞存活率的影響差異不顯著(P>0.05)，不同濃度卵磷脂的添加對細胞凍存的影響差異極顯著(P<0.01)。

冷凍稀釋液使用海藻糖時，添加卵磷脂的凍存效果普遍好于未添加卵磷脂組。用含11%卵磷脂的細胞保存液凍存細胞，細胞相對存活率低于含8%卵磷脂組。

冷凍稀釋液使用蔗糖，添加8%卵磷脂凍存細胞時凍存效果最好，復蘇后的細胞活率是凍存前的(90.78±1.36)%；用含11%卵磷脂的細胞保存液凍存細胞，細胞相對存活率低于含8%卵磷脂組。顯微鏡觀察細胞形態，可見復蘇后添加卵磷脂的處理組細胞大多都狀態良好，呈現活細胞形態，復蘇培養2 d后，可見細胞分裂增殖，細胞數目增多。將添加8%卵磷脂的海藻糖組細胞復蘇培養，10 d后細胞總數為0 d時的3.19倍(圖1)。

圖1　復蘇后培養的精巢細胞Fig.1　Testicular cells cultured after thawing A.復蘇培養0 d的精巢細胞；B.復蘇培養10 d的精巢細胞

3　討論

3.1不同酶對達氏鱘精巢細胞的消化效果

采用適當的程序及消化方法也是制備良好單細胞懸液的關鍵環節之一。檢驗不同種類的酶和不同消化時間對達氏鱘精巢細胞的消化效果的影響，可為精原細胞的純化做準備，得到高活率的細胞是純化后實現精原細胞高存活率的保證。

目前，分離各種動物細胞普遍采用胰蛋白酶、膠原酶或幾種酶的組合。在魚類中，Lacerda 等[14]用膠原酶、胰蛋白酶和DNase I組合酶消化尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)精巢細胞，再梯度離心分離精原細胞，最后得到的細胞活細胞率較高。Shikina等[11]同樣用胰蛋白酶、膠原酶、中性酶及其組合酶分離虹鱒(Oncorhynchusmykiss)精巢細胞，得到的細胞通過原代培養仍可增殖。Linhartova 等[10]用0.1% 膠原酶和胰蛋白酶消化分離丁鱥(Tincatinca)性腺，并通過Percoll 密度梯度離心純化精原細胞。王愛珍[15]對吉富羅非魚精原細胞分離培養的研究中，分別用0.1%膠原酶IV，0.25%胰蛋白酶，0.04% EDTA·Na2及其組合酶消化吉富羅非魚精巢，其中經過胰蛋白酶消化活細胞率最高，為86.60%。

本研究采用的是0.25% 胰蛋白酶和膠原酶與中性酶的組合酶消化達氏鱘精巢細胞。實驗發現，兩種酶消化相同重量的精巢組織時，可獲得的活細胞數沒有顯著差異，但這兩種酶消化所得的細胞數會隨時間變化。由此可見，兩種酶的消化效果都比較溫和，經過2～3 h才可獲得最多的活細胞。因此在消化過程中膠原酶與中性酶的組合酶對精巢細胞的損傷較小。但是由于組合酶消化過程耗時較長，而且組合酶中的膠原酶價格昂貴，而采用胰蛋白酶分離精巢細胞不僅得到的活細胞率高、操作方便，而且消化時間相對較短。

3.2不同冷凍方案的凍存效果比較

影響細胞凍存效果的因素主要有抗凍劑、降溫方式及冷凍稀釋液種類[16]?？箖鰟儆跐B透性冷凍保護劑，近年來常用的抗凍劑有DMSO、EG、MET及甘油(GLY)。滲透性冷凍保護劑對不同物種的保存效果存在很大的差異，因此選擇恰當的冷凍保護劑對其冷凍保存效果至關重要[17]。Yoshizaki等[4]采用1.8 mol/L EG，0.5% BSA，5.5 mmol/L D-葡萄糖作為凍存液保存虹鱒生殖細胞，復蘇后存活率為45.4%。本實驗通過對幾種抗凍劑對精巢細胞凍存的研究，結果顯示，用EG的冷凍效果最好，可達(51.70±5.24)%。有研究顯示EG也是西伯利亞鱘生殖細胞的最佳抗凍劑，用1.5 mol/L EG，0.5% BSA，5.5 mmol/L D-葡萄糖保存西伯利亞鱘生殖細胞，復蘇率為61.75%[5]?？梢妼τ邝\來說，EG可能是較為合適的細胞抗凍劑。

降溫速率直接關系到冷凍效果，降溫速率過快或過慢都會對細胞膜造成損傷。不同的組織細胞中均有一個存活率最高的冷凍速率范圍，稱為“適宜冷凍速率”[18]。本研究選擇了緩慢冷凍法和快速冷凍法兩種降溫方式，實驗結果顯示兩種方法差異較大，通過慢速冷凍的手段可得到較高的細胞復蘇率?？梢?1 ℃/min 對于達氏鱘精巢細胞來說是較為適宜的降溫速率。Linhartova等[10]對丁鱥原始生殖細胞凍存的研究，同樣采用-1 ℃/min的降溫速率降至-80 ℃可獲得較好的凍存效果(57.69±16.85)%。

糖類，例如海藻糖和蔗糖，屬于非滲透保護劑，添加糖類的凍存液配方可顯著提高多種類型細胞的凍存效果，包括胚胎細胞、成纖維細胞、造血干細胞及生殖細胞[5-8]。Aurich等[19]認為，動物細胞膜中含有的卵磷脂具有親脂親水的特性，細胞凍存液中添加卵磷脂，可以有效保持水分不至過多流失，提供能源，從而保護細胞減少冷凍傷害。本文對于細胞凍存液的進一步研究顯示，含海藻糖或蔗糖的冷凍稀釋液在凍存達氏鱘精巢細胞時無顯著差異，在相同卵磷脂濃度下，復蘇后的相對存活率差異較??；0%卵磷脂的蔗糖組細胞相對存活率最低，添加8%卵磷脂時，細胞的相對存活率最高。有研究指出，卵磷脂沒有冷凍毒性[20]，但是在我們的研究中顯示當卵磷脂濃度升高至11%時細胞復蘇后存活率反而降低，同樣的結果出現在用卵磷脂冷凍保存馬精液[21]的研究中，這可能是由于當卵磷脂的濃度增加時，稀釋液中的糖和鹽類析出形成沉淀引起滲透壓下降，從而造成細胞損傷。

4　結論

本研究通過探討兩種酶消化分離達氏鱘精巢細胞的效果以及比較抗凍劑、降溫程序、糖類和卵磷脂對達氏鱘精巢細胞凍存效果的影響，得出保存達氏鱘精巢細胞效果最佳方法為：先用0.25%胰蛋白酶消化3 h分離達氏鱘精巢細胞，再用50 mmol/L D-海藻糖，5 mg/mL BSA，200 mL/L胎牛血清，10% EG及8%卵磷脂作為冷凍保存液，以-1 ℃/min慢速降溫保存達氏鱘精巢細胞效果最佳。

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(責任編輯：鄧薇)

Digestion,isolation and cryopreservation of testicular cells from Dabry sturgeon (Acipenser dabryanus)

XIE Xuan1,2,LI Ping2,XI Meng-dan2,3,GUO Wei2,3,QIAO Xin-mei2,DU Hao2,LIU Zhig-ang2,WEI Qi-wei1,2,3

(1.SchoolofLifeScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China;2.KeyLaboratoryofFreshwaterBiodiversityConservation,MinistryofAgricultureofChina;YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuhan430223,China3.InstituteofHydrobiology,ChineseAcademyofSciences,Wuhan430072,China)

In this study,to obtain high recovery ratio of living cells after thawing for Dabry′s sturgeon (Acipenserdabryanus) testicular cells,we evaluate the effect of enzymatic dissociation on testicular cells,and the influence of cryoprotectants,freezing ratio,sugars and lecithin on testicular cells cryopreservation.Testes were dissociated and digested with 0.25% trypsin or a combination of 2 mg/mL collagenase H and 500 U/mL Dispase II.The number of testicular cells was counted respectively when tests were dissociated by these two enzymes for 2,3,4 and 5 h.The result showed that there was no significant difference between those enzymes.Per gram testis can obtain 1.27×107living cells dissociated by 0.25% trypsin and 1.07×107by the combined enzymes on average.We also investigate the effect of cryoprotectants,freezing rate,sugars and lecithin on testicular cells cryopreservation.Cells was diluted in 50 mM D-trehalose,5 mg/mL Bovine serum albumin,200 mL/L fetal bovine serum (pH 8.0) supplemented with 10% dimethyl sulfoxide (DMSO),ethylene glycol (EG) or methanol (MET) respectively,freezing on a cooling protocol from 0 ℃ to -80 ℃at a rate of -1 ℃/min,or transferring into liquid nitrogen (LN2) directly.The results demonstrated that cryopreservation with those cryoprotectants significantly influenced recovery rate of living cells,in the following sequence:EG(51.70%±5.24%)>MET(45.09%±3.15%)>DMSO(40.18%±3.90%).And freezing on slow rate,-1 ℃/min,showed obviously high rate of living cells after thawing.Based on the previous study,D-trehalose in the extenders was replaced by D-sucrose,and supplemented 0%,5%,8%,11% lecithin.Almost the same viability rates were obtained with no significant differences among tested sugars,but the differences performed obviously on lecithin.The results showed that (93.55±2.56)% living cells can be obtained after thawing when 8% lecithin was supplemented.The number of testicular cells increased 3.19 times for 10 days culture.

Acipenserdabryanus;trypsin;cryopreservation;cryoprotectant;lecithin

2016-03-01；

2016-03-23

中央級公益性科研院所基本科研業務費(2015B02YQ01)；公益性行業(農業)科研專項(201203086)；國家自然基金青年項目(31402301)

頡璇(1991-)，女，碩士研究生，專業方向為細胞生物學。E-mail:xiexuan_1111@163.com

危起偉。E-mail:weiqw@yfi.ac.cn

S917.4

A

1000-6907-(2016)05-0019-06