微小RNA簇miR-302s條件性基因打靶小鼠的制備和鑒定

余　飛, 錢麗萍, 丁利軍（南京大學醫學院附屬鼓樓醫院. 動物實驗中心, . 生殖醫學中心, 南京0008）

微小RNA簇miR-302s條件性基因打靶小鼠的制備和鑒定

余飛1, 錢麗萍1, 丁利軍2
（南京大學醫學院附屬鼓樓醫院1. 動物實驗中心, 2. 生殖醫學中心, 南京210008）

目的制備微小RNA簇miR-302s條件性基因打靶小鼠。方法構建miR-302s打靶載體,通過電穿孔的方法轉染胚胎干細胞（ES細胞），用正負篩選法篩選陽性ES細胞并進行PCR鑒定和Southern分析。利用顯微注射技術將正確同源重組的ES細胞注射至B6（Cg）-Tyr＜sup＞c-2J＜/sup＞/J小鼠囊胚腔內，注射后的囊胚植入受體小鼠子宮。將得到的嵌合體小鼠與野生型雌鼠交配獲得miR-302s-LoxP基因打靶小鼠。結果獲得嵌合體小鼠11只, 其中4只嵌合雄鼠嵌合率＞50%。利用嵌合體小鼠進行繁育交配，得到miR-302s基因打靶雜合子小鼠11只。結論成功建立miR-302s條件性基因打靶小鼠模型，為進一步研究miR-302s基因功能打下基礎。

miR-302s； 條件性基因打靶小鼠； 胚胎干細胞； 同源重組

MicroRNAs （miRNAs）是人類新發現的一類長約22 nt的非編碼單鏈小RNA分子，通過堿基配對原則與靶mRNA的3'UTR區結合，誘發轉錄后抑制與降解, 從而調控靶基因的表達［1］。miR-302家族有miR-302a, 302b, 302c, 302d四個高度同源的成員，合稱為miR-302s。小鼠miR-302s位于3號染色體內串聯排列, 調節大約445個基因, 且各個miRNA所調節的靶基因基本相同, 這些基因的功能涉及早期胚胎發育相關的信號或影響干細胞分化［2-4］。miR-302s在調節基因組DNA表觀遺傳，維持干細胞特性方面具有重要作用［5,6］。本實驗嘗試制備miR-302s條件性基因打靶小鼠模型，為進一步研究miR-302s維持胚胎發育和干細胞分化的機制打下基礎。

1　材料與方法

1.1材料

基因打靶所用胚胎干細胞： 源自B6/BLU雄性小鼠（毛色為黑色）, 南京大學模式動物研究所提供, 輻照后MEF為飼養層, 小鼠胚胎干細胞（ES細胞）培養基配制參考文獻［7］。注射用囊胚： B6（Cg）-Tyr＜sup＞c-2J＜/sup＞/J雌鼠（毛色為白色）通過超數排卵、自然受孕和胚胎體內發育至囊胚階段, 用于顯微注射。胚胎操作液為M2, 胚胎培養液為M16, 購自美國Sigma公司。假孕受體小鼠為封閉群ICR小鼠。小鼠均購于南京大學模式動物研究所［SCXK（蘇）2015-0001］，飼養于南京大學模式動物研究所屏障環境下［SYXK（蘇）2015-0001］。生物試劑： 各種限制性內切酶、T4DNA 連接酶、Taq酶等購自TaKaRa 及NEB公司, DNA marker（1 kb ladder） 購自晶美生物工程公司, 質粒抽提試劑盒及凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司。細胞培養所需試劑為Invitrogen公司產品。引物合成和測序由上海英駿生物技術有限公司完成。

1.2方法

1.2.1miR-302s條件性基因打靶載體的構建和鑒定以含有neo-tk基因的pLoxPneo載體為基本骨架, 用涵蓋8個miRNAs的mir-302基因簇 （miR-302b*-b-c*-c-a*-a-d-367）片段為構建載體的重組DNA片段，引入LoxP，建立miR-302s的條件性打靶載體（圖1）。終載體構建完成后經PCR、酶切等方法進行驗證。PCR引物為miR-302s-loxptF： 5'-CCTCCTTTACTTTAACATGGAGG-3'； miR-302s-loxptR： 5'-CTCTACTGAGGAGGAGAAGGAGA-3'。PCR產物大小379 bp。圖2為最終載體圖譜, 并對載體進行測序。

圖1　miR-302s 基因打靶小鼠打靶載體構建策略

圖2　miR-302s 基因打靶載體質粒圖譜

1.2.2miR-302s條件性基因打靶載體的線性化將測序正確的100 μg miR-302s條件性基因打靶載體質粒NotⅠ（酶用量： 300 IU） 酶切線性化，酶切體積300 μL，37 ℃消化過夜。等體積苯酚-三氯甲烷、三氯甲烷處理后，無水乙醇沉淀，100 μL無菌PBS重懸備用。

1.2.3ES細胞打靶及篩選基因打靶所用胚胎干細胞為來源于B6/BLU雄性小鼠的ES細胞。使用線性化的miR-302s基因打靶載體DNA 30 μg進行電穿孔轉染，電穿孔條件為電壓240 V，電容500 μF；實際通電時間9.6 ms，實際電壓256 V。打靶后克隆用300 μg /mL G418 和 2 μmol /L羥甲基無環鳥苷（Gancyclovir）篩選8 d后獲得雙藥抗性ES細胞?？寺『蟪樘峄蚪MDNA, 通過PCR、Southern雜交等方法鑒定2條同源臂并測序，確定成功同源重組的ES細胞克隆，以構建的重組載體作為陽性對照?？?'或3'臂和插入片段的長鏈PCR鑒定引物如下。位于同源臂5'臂PCR引物miR-302s-5F1：5'-GTCAGAACCACTGAAATTTTG-3', Neo-5R：5'-GGCTGGACGTAAACTCCTC-3', 目的片段為5.4 kb, PCR 反應條件為： 95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s, 64 ℃ 390 s, 40 個循環； 64 ℃ 10 min。位于同源臂3' 臂PCR引物為 ES-2F4： GCATCGCATTGTCTGAGTAGGTG，miR-302s-3R2： CTCTGCTTTAGATCTAGTGG, 目的片段為5.4 kb，PCR 反應條件為： 95 ℃ 5 min； 95 ℃30 s，64 ℃ 390 s，40個循環； 64 ℃ 10 min。兩套Southern探針（分別位于5'臂外側和3'臂外側）引物，miR-302s-P5F： 5'-CTCAGTCATACTCAGAGAAACGGAT-3'，miR-302s-P5R： 5'-AAGGGTCTCACACCATTTAGTCT-3', 產物長度447 bp, 陽性重組ES細胞的目的條帶7.5 kb； mir-302s-P3F： 5'-GGAACAAGTTACAGACCAAACAGAA-3', mir-302s-P3R： 5'-CACAGAAATGAGAAAA-CTTCCAGAC-3', 產物長度414 bp, 陽性重組ES細胞的目的條帶5.0 kb。鑒定完畢后選擇狀態良好的陽性細胞留作受體小鼠（毛色呈現白色）囊胚腔內注射。

1.2.4陽性ES細胞顯微注射取4周齡B6（Cg）-Tyr ＜sup＞c-2J＜/sup＞/J雌鼠，48 h間隔注射孕馬血清促性腺激素（PMSG） 10 IU 和人絨毛膜促性腺激素（hCG） 10 IU促排卵。與B6（Cg）-Tyr＜sup＞c-2J＜/ sup＞/J雄鼠合籠后次日早晨檢查陰栓，記為0.5 dpc （day post coitum）。2.5 dpc取胚胎，培養過夜后用于顯微注射。每個囊胚腔注射12～15個ES細胞。顯微注射后的囊胚培養2 h后移植。

1.2.5基因打靶小鼠的獲得和鑒定嵌合體小鼠出生后，將嵌合率＞50%的成熟雄性小鼠與野生型雌性小鼠進行交配，后代小鼠經提取尾基因組DNA進行PCR鑒定，得到重組雜合子小鼠。

PCR引物為miR-302s-loxptF（P1）： 5'-CCTCCTTTACTTTAACATGGAGG-3'； miR-302s-loxptR（P2）：5'-CTCTACTGAGGAGGAGAAGGAGA-3', 片段長度為： wt/wt=337 bp, wt/fln=337 bp/379 bp, fln/fln=379 bp；miR-302s-frttF（P3）： 5'-AGGCATATGTTTACA-TTATTTG-3'； Neo-5R（P4）： 5'-GGCTGGACGTAAACTCCTC-3', 片段長度為： wt/wt=0, wt/fln=0/287 bp, fln/fln=287 bp。miR-302s-frttR（P5）： 5'-AGCTGTTTGAAGATACATCTAC； ZMK-2F4（P6）： 5'-GCATCGCATTGTCTGAGTAGGTG-3', 片段長度為： wt/wt=0, wt/fln=0/437 bp, fln/fln=437 bp。

每只小鼠均用3套引物檢測, 反應條件為： 95 ℃30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 40 個循環； 72 ℃ 5 min。

圖3　miR-302s打靶載體的PCR驗證

2　結果

2.1miR-302s條件性基因打靶載體鑒定

構建的miR-302s打靶載體質粒經PCR鑒定結果如圖3所示，PCR產物長度379 bp。以31#基因打靶載體質粒為模板，經ApaLⅠ、ScaⅠ酶切，可以釋放出陽性片段miR-302s，鑒定結果如圖4。

圖4　miR-302s條件性基因打靶載體質粒DNA 的ApaL I ScaI酶切鑒定

2.2陽性胚胎干細胞的鑒定

電穿孔轉染后得到藥物抗性ES細胞克隆共93個，經PCR鑒定，其中10個ES細胞克?。–4, F4, G4, H4, A5, F5, G6, D8, B9, E10）發生雙臂同源重組（圖5、6）。

圖5　打靶載體電穿孔轉染ES細胞后5’臂PCR結果

進一步抽提ES細胞DNA5'臂經Bgll1酶切、3'臂經EcoRV酶切，經過Southern-blot分析，確定其中6個ES克?。℅4，H4，A5，F5，G6和B9）為陽性（圖7）。

2.3基因打靶小鼠的鑒定

取篩選出的6個ES陽性細胞克隆中的2個（G4、F5）進行顯微注射, 共注射158枚胚胎, 存活140枚, 注射后的囊胚移植8只ICR受體。受體妊娠7只, 共出生存活小鼠34只, 嵌合體小鼠11只, 其中4只嵌合雄鼠嵌合率＞50%。利用嵌合體小鼠進行繁育交配, 已經獲得miR-302s-loxp重組雜合子小鼠11只（4#, 6#, 9#, 10#, 11#, 14#, 15#, 16#, 30#, 31#,32#），毛色為黑色，PCR鑒定結果如圖8。

圖6　打靶載體電轉ES細胞后3’臂PCR結果

圖7　ES細胞DNA的Southern分析

圖8　miR-302s基因打靶小鼠PCR檢測

3　討論

miRNAs廣泛分布于真核細胞內。miRNAs通過與靶基因互補位點配對結合，在轉錄后水平負性調控靶基因的表達，參與生長發育、細胞增殖、細胞凋亡、細胞分化等生命過程。Lin等［8,9］研究表明，miR-302s高表達于人ES細胞，隨細胞的分化其含量迅速減少, miR-302s是維持ES細胞自我更新和多潛能性的重要因子。當人腫瘤細胞轉入miR-302s（轉入后為mirPS細胞）, mirPS細胞不僅表達ES細胞的表面標志物如Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4、Sox2和Nanog等，而且基因組高度去甲基化。最近研究［10, 11］顯示，利用miR-302b轉染人成纖維細胞可以重編程為誘導的多能干細胞（iPSCs），提示其在維持干細胞全能性中的重要作用。本實驗室預研究表明，miR-302s可能抑制腫瘤細胞子宮內膜癌Ishikawa和HEC-1-B細胞的增殖和遷移。此外，將Ishikawa細胞移植至免疫缺陷小鼠顯示miR-302s可抑制腫瘤生長［12］。作者近期的研究表明，miR-302s可能參與早期胚胎基因組的低甲基化水平的維持（未發表資料），但其調節早期胚胎發育表觀遺傳的機制尚不清楚。

基因敲除小鼠是研究基因功能的重要動物模型，為了更好地研究miR-302s的功能和作用機制，本研究制備了miR-302s條件性基因打靶小鼠，為進一步研究該基因提供了良好的平臺。本研究中重組載體的構建策略是將loxp位點插入到miR-302d和miR-367之間（這段距離為43 bp）的位置，并導入neo基因作為正篩選基因。通過電穿孔轉染和正負篩選得到陽性ES細胞并經顯微注射到B6（Cg）-Tyr＜sup＞c-2J＜/sup＞/J小鼠的囊胚中，再移植到假孕受體小鼠子宮后得到嵌合體小鼠。嵌合體小鼠與野生型小鼠交配獲得miR-302s-LoxP基因打靶小鼠。獲得的miR-302s-LoxP基因打靶小鼠可以與各種Cre小鼠交配，獲得在不同發育階段、不同組織部位miR-302s缺失的條件性基因敲除小鼠。

在獲得miR-302s-LoxP基因打靶小鼠后，作者已嘗試將其與卵母細胞特異表達的Zp3-Cre小鼠交配以獲得miR-302s基因敲除小鼠, 但繁育實驗顯示獲得的陽性純合子小鼠在胚胎種植后不久即退化或出生后因腦積水而死亡（未發表資料）, 提示miR-302s在胚胎植入前后的發育過程和腦發育中可能具有重要作用，有待進一步研究。

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Generation and Identification of miR-302s Conditional Gene Targeting Mice

YU Fei1, QIAN Li-ping1, DING Li-jun2
（1. Experimental Animal Center； 2. Reproductive Medicine Center， Nangjing Drum Tower Hospital The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School， Nanjing 210008， China）

ObjectiveTo generate microRNA miR-302s gene targeting mice. MethodsThe conditional gene targeting vector were generated by molecular cloning, and then the electroporation of embryonic stem （ES） cells were carried out. The targeted ES cells were screened by positive-negative selection and identified by PCR and Southern blot, and then the correct targeted ES cells were microinjected into blastula of B6（Cg）-Tyr＜sup＞c-2J＜/sup＞/J mice. Chimerical mice were generated after transplantation of the injected blastula into the host mice, and the miR-302s-LoxP gene recombinat mice were obtained after breeding. ResultsEleven miR-302s chimeric mice were obtained including four male chimeras with a higher than 50% chimeric ratio. Eleven miR-302s heterozygous gene recombinat mice were generated after outbred and inbred. ConclusionThe miR-302s conditional gene targeting mice were successfully obtained. This animal model provided the foundation for further study of miR-302s in vivo.

miR-302s； Conditional gene targeting mice； Embryonic stem （ES） cell；Homologous recombination

R-33 Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0087-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.002

2015-10-22

國家自然科學基金項目（30900847）, 中央高校苗圃項目 （20620140707）, 南京市衛生杰出青年人才項目（JQ2014004）

余飛（1982-）, 女, 碩士, 助理研究員, 主要研究方向： 實驗動物學。E-mail： yufei0802@yeah.net

丁利軍（1981-）, 男, 博士, 副研究員, 主要研究方向：生殖醫學。E-mail： xmljding@163.com