石榴分子生物學研究進展

苑兆和

(南京林業大學南方現代林業協同創新中心/南京林業大學林學院，江蘇南京 210037)

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石榴分子生物學研究進展

苑兆和

(南京林業大學南方現代林業協同創新中心/南京林業大學林學院，江蘇南京 210037)

石榴栽培歷史悠久，是重要的經濟林木，是古老的藥用果樹。果實富含抗氧化功能物質，臨床醫用和保健價值高，被譽為超級水果。石榴遺傳資源豐富，為育種工作提供大量素材。筆者對石榴的品質發育，包括安石榴苷代謝、花青苷代謝和木質素代謝進行綜述，對遺傳多樣性研究進行評述，并對NGS時代石榴分子生物學研究進行展望。

石榴；安石榴苷；花青苷；木質素；遺傳多樣性

石榴(Punicagranatum)是千屈菜科(Lythraceae)石榴屬(PunicaL.)落葉果樹[1]，起源中亞，是古老的保健水果，被譽為超級水果[2,3]。栽培歷史悠久。石榴適應性強，在世界范圍內廣泛栽培，被劃為國家規劃特色經濟林樹種之一[4]。石榴果實富含花青苷、黃酮、安石榴苷等多酚類物質，特別是安石榴苷等鞣花單寧類物質臨床醫用和保健價值高，具有潛在的抗氧化、抗癌、抗菌等功能[5,6]。石榴果皮中，鞣花單寧類物質含量較高。Han等[7]通過高效液相色譜法(HPLC)測定，發現果皮中安石榴苷含量高達4.821mg/g，是果汁中含量的約15倍，籽粒中含量的30倍。隨著果實發育成熟，安石榴苷含量逐漸降低，說明其代謝途徑中降解能力高于合成能力。對于安石榴苷等鞣花單寧類物質分子代謝通路研究，目前進展緩慢，只克隆到合成前期少數幾個基因[8]。石榴果實色澤發育是研究最深入的方向，目前已克隆到完整的花青苷代謝通路基因[8-10]和轉錄調控基因[11]，并進行擬南芥轉化驗證，但尚缺乏對籽粒著色研究以及環境因素對MBW復合物調控果實著色影響的研究。籽粒軟硬度是重要的經濟性狀，與木質素代謝相關。張水明等[12]、曹丹琴等[13]分別克隆了石榴籽粒木質素合成途徑的關鍵基因和轉錄調控因子。石榴耐鹽堿能力強，是海濱綠化優良樹種。彭媛媛等[14]克隆并驗證了石榴耐鹽相關基因GPX。對各種性狀的研究是為品種改良和育種做鋪墊，而收集與評估種質資源是育種的前提。世界各國對石榴種質資源的研究最多，通過分子標記技術評估區域資源遺傳多樣性[15-19]。本課題組開展石榴全基因組測序項目，將為世界石榴分子遺傳學、分子代謝研究、發育生物學研究和生物信息學提供大數據支持，進一步推動石榴分子生物學研究。筆者對石榴品質發育，包括安石榴苷代謝、花青苷代謝和木質素代謝進行綜述，對遺傳多樣性研究進行評述，并對NGS(Next Gegeration Sequencing,二代測序或高通量測序)時代石榴分子生物學研究進行展望。

1　 石榴品質發育研究

1.1安石榴苷分子代謝通路研究

石榴是一種抗氧化能力極強的水果，果實抗氧化劑總濃度11.33mmol/100g，是藍莓(Vaccinumcorymbosum)的3.11倍，甜橙(Citrussinensis)的9.94倍，蘋果(Maluspumila)的39.07倍[20]。石榴抗氧化能力與總酚含量呈極顯著正相關(R2 = 0.90，P < 0.01)，其中鞣花單寧類物質含量最高[5]，如安石榴苷(Punicalagins)、石榴皮鞣素(Punicalins)、Gallagic acid具有顯著的抗氧化、預防心血管疾病、抗癌、抗菌、抗感染、抗糖尿病等諸多功效，臨床醫學價值高。在市場消費的水果中，石榴擁有最高濃度的安石榴苷[21]，它是已知分子量最大的酚類物質，可降解為鞣花酸，每個分子內有16個酚式羥基，是抗氧化性最強的酚類物質，也是石榴果實中最主要的酚類物質[2,6]。

安石榴苷是鞣花單寧代謝途徑的中間產物，鞣花單寧途徑上游與莽草酸途徑上游共用[22](圖1)。在植物質體中，磷酸烯醇式丙酮酸和赤蘚糖-4-磷酸在3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(3-deoxy-D-arabinoheptulosonic acid-7-phosphate synthase，DAHPS)催化下合成3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)?；谛蛄邢嗨菩?，DAHPS分為兩類：I類包含AroF、AroG、AroH、CM-DAHPS；II類包含芳香氨基酸(aromatic amino acids，AAAs)結合元件，植物中DAHPS屬此類型[22]。I類基因在植物進化過程中缺失[23]。在擬南芥、番茄、土豆和石榴中均分離到DAHPS基因。

3-脫氫奎尼酸合成酶(3-dehydroquinic acid synthase，DHQS)用Co2+和NAD+將DAHP合成3-脫氫奎尼酸，然后在3-脫氫奎尼酸脫氫酶(3-dehydroquinic acid dehydratase，DHQD)作用下生成3-脫氫莽草酸(3-dehydroshikimic acid，DHS)[23]。在鞣花單寧途徑[24,25]中，DHS 在莽草酸脫氫酶(shikimate dehydrogenase，SD)催化下生成沒食子酸。在細胞質中，沒食子酸在 UDP 葡糖基轉移酶(UDP-glucose:gallate glucosyltransferase，UGT)作用下生成β-葡萄糖沒食子鞣苷(β-glucogallin)[26,27]。β-葡萄糖沒食子鞣苷在 β-葡萄糖沒食子鞣苷O-沒食子?；D移酶(β-glucogallin O-galloyltransferase，GLUG)作用下，生成二沒食子酰葡萄糖(digalloylglucose)。二沒食子酰葡萄糖在沒食子?；D移酶(Galloyltransferase，GALT)作用下經多次酶促反應，生成五沒食子酰葡萄糖(pentagalloylglucose)。五沒食子酰葡萄糖在五沒食子酰葡萄糖氧化還原酶(Pentagalloylglucose oxygen oxidoreductase，POR)作用下合成鞣花單寧[2]。在石榴安石榴苷分子代謝機制研究中，目前主要集中在部分關鍵基因的克隆與分析，對UGT基因進行亞細胞定為分析[26]，通過轉錄組測序技術(RNA-seq)挖掘相關結構基因[8]。

圖1　石榴鞣花單寧合成途徑簡圖

1.2花青苷代謝分子機理研究

石榴果實色澤是重要的市場經濟性狀，表皮顏色主要由花青苷類型與含量決定[11, 28, 29]?；ㄇ嘬帐侵参镆号葜锌扇苄陨?，依賴pH變化而呈現紅色、紫色和藍色，是果肉[30]、果皮[31]、花[32]、葉[33]中的主要色素?；ㄇ嘬赵诠麑嵆墒祀A段大量積累，是果實成熟的重要指標[34]，表現為不同顏色，吸引昆蟲覓食[35]。另外花青苷可以抵御生物脅迫與非生物脅迫[36]。

花青苷是類黃酮生物合成途徑花青苷分支的重要產物之一[37,38]。如圖2所示，香豆酰輔酶A在查爾酮合成酶(chalcone synthases，CHS)的作用下合成查爾酮，然后在查爾酮異構酶(chalcone isomerase，CHI)的作用下合成柚皮素。在類黃酮3羥化酶(flavonoid 3-hydroxylase，F3H)、類黃酮3’羥化酶(flavonoid 3’-hydroxylase，F3’H)和類黃酮3’5’羥化酶(flavonoid 3’5’-hydroxylase，F3’5’H)的催化下合成二氫黃酮醇，在二氫黃酮醇4還原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)的作用下合成無色花青素，然后在花青素合成酶(anthocyanidin synthase，ANS)和無色花青素加雙氧酶(leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX)的作用下合成花青素。在尿苷二磷酸葡萄糖類黃酮糖苷轉移酶(UDPG-flavonoid glucosyl transferase，UFGT)的催化下合成花青苷，在氧位甲基轉移酶(O-methyltransferase，OMT)的催化下合成氧位甲基化的花青苷[39]。

圖2　花青苷代謝途徑 (圖片引自招雪晴博士學位論文[38] )

在石榴著色基因組學和轉錄組學研究方面，發現轉錄調控因子MBW(MYB-BHLH-WD40)復合物是影響果皮著色的主要因子。Ono等[8]首次通過RNA-seq技術在轉錄組水平構建了石榴花青苷代謝通路。目前已在石榴果皮中克隆到花青苷途徑全部結構基因[10,40]和轉錄調控因子MBW復合物。[11,29]Khaksar等[11]在黑皮石榴中發現PgMYB轉錄水平與果實色澤度呈正相關，猜測該基因可以提高花青苷積累量。紅皮石榴花青素衍生物含量與PgWD40 表達量呈正相關，PgWD40轉錄水平與PgDFR和PgLDOX表達水平呈正相關，而且這三種基因與PgMYB和PgbHLH表達水平也呈正相關[29]。Rouholamin等[9]通過實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)驗證MBW基因表達水平，發現PgBHLH在白皮和綠皮石榴中表達量最高，在紅皮和黑皮石榴中最低；PgMYB在綠皮石榴中累積表達最大，在紅皮中最??；PgDFR基因在黑皮石榴中表達量最高，在白皮石榴中表達最低。Ben-Simhon等[41]在白皮石榴中發現PgLDOX基因編碼區插入片段導致白皮中無花青苷積累。此外，Harel-Beja等[17]構建了石榴高密度遺傳圖譜，通過數量性狀位點(QTL)技術關聯分析果實性狀，共得到5個籽粒著色相關位點(aril color 1-1、aril color 1-2、aril color 2-1、aril color 3-1和aril color 5-1)。

在蛋白組學方面，目前發現細胞色素b6-f復合體(sport 0013)、葉綠素 a/b 結合蛋白(sport 5108)和果糖激酶2-like(sport 0503)可能與果皮顏色變化相關；半胱氨酸合酶1(sport 1402)可能對提高石榴的抗氧化脅迫能力起到了重要作用[42]。

1.3木質素分子合成途徑研究

石榴籽粒軟硬程度是重要的果實品質，軟籽石榴價值高，需求量大。籽粒軟硬度涉及木質素代謝過程。木質素是儲存在特殊細胞細胞壁中的多酚聚合物。植物進化中木質素的出現，與泥盆紀時期(Devonian)維管植物的出現一致。木質素的合成與物種類型、發育時期和細胞類型相關。在不同細胞類型分化中或應對特殊環境變化時，細胞壁出現木質化。木質素在正確時間儲存在不同類型細胞中，是植物適應環境和行使功能所必需。種子發育過程中，珠被會分化成由特殊細胞組成的不同細胞層，用于保護種皮或外種皮。種皮細胞發育成木質化次生細胞，以強化外種皮表面。

木質素單體前體是由苯丙氨酸在質體中合成[43](圖3)。肉桂酸在肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate 4-hydroxylase，C4H)催化下合成對香豆酸，然后在4-香豆酰輔酶A連接酶(4-coumarate:CoA ligase，4CL)催化下合成4-香豆酰輔酶A。對羥化肉桂?；o酶A：奎尼酸/莽草酸對羥化肉桂?；o酶A轉移酶(p-hydroxycinnamoyl-CoA:quinate/shikimate p-hydroxycinnamoyltransferase，HCT)催化4-香豆酰輔酶A合成對羥化肉桂?；崴?莽草酸?？Х弱？崴?莽草酸在對香豆酸3-羥化酶(p-coumarate 3-hydroxylase，C3H)催化下由對羥化肉桂?；崴?莽草酸合成，然后在HCT催化下合成咖啡酰輔酶A?？Х弱］o酶A在咖啡酰輔酶A 氧位甲基化轉移酶(caffeoyl-CoA O-methyltransferase，CCoAOMT)催化下合成阿魏酰輔酶A，在肉桂酸輔酶A還原酶(cinnamoyl-CoA reductase，CCR)催化下合成咖啡酰乙醛?？Х弱Ｒ胰┰谌夤鹚岽蓟摎涿?(cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)催化下合成咖啡酰乙醇，然后在咖啡酸氧位甲基化轉移酶(caffeic acid O-methyltransferase，COMT)催化下合成松柏醇。松柏醇先后在阿胃酸5-羥化酶(ferulate 5-hydroxylase，F5H)和COMT催化下合成芥子醇。松柏醇在尿苷二磷酸-葡萄糖基轉移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)催化下合成木質素G單元，芥子醇在UGT催化下合成木質素S單元。

圖3　木質素合成途徑 (引自Jaime Barros et al.[43])

COMT是木質素途徑下游酶，實時熒光定量 PCR 分析表明，PgCOMT在‘紅玉石籽’、‘粉皮’、‘會理軟籽’、‘蒙自甜’和‘突尼斯軟籽’石榴種皮中的相對表達量與石榴籽粒硬度較為一致；隨著石榴種皮的發育其表達量先下降后上升[12]。曹丹琴等[13]克隆了石榴種皮木質素合成相關轉錄因子基因PgMYB，并進行表達分析。

2　遺傳多樣性研究

2.1分子標記開發與應用

目前在石榴遺傳多樣性研究中使用的分子標記有：AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphisms，擴增片段長度多態性)[44-49]、SNP(Single-Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態性)[17,50]、SSR(Simple Sequence Repeats，簡單重復序列)[51]、ISSR(Inter Simple Sequence Repeat，簡單重復序列間隔)[18]、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增 DNA 多態性)[52]、隨機擴增微衛星多態性(Random Amplified Microsatellite Polymorphism，RAMP)[53]、SRAP(Sequence Related Amplified Polymorphism，序列相關擴增多態性)[54]和DNA條形碼技術[15]。RAMP適合對遺傳背景模糊的物種進行遺傳分析。在第二代標記技術中，AFLP相較于其他標記可以掃描全基因組，多態性高、可重復性好，但操作復雜。SNP是第三代分子標記技術，基于PCR擴增和序列測序，探測范圍廣，多態性更高，操作簡單。各種標記技術，在石榴種質資源遺傳多樣性、遺傳圖譜等方面應用廣泛(表1)。

2.2石榴遺傳資源特點

石榴起源中亞，適應性強，分布廣。世界石榴遺傳多樣性豐富，總體分為兩大類群。Ophir等[50]使用SNP標記對采自以色列、印度、伊朗、中國、美國、土耳其、西班牙、地中海地區等106個石榴栽培品種進行遺傳多樣性分析，發現中國、印度和伊朗地區的石榴品種和不可食用觀賞石榴Nana聚為G1，其它地區石榴聚為G2。G2組分為2個亞組：G2.1包含Wonderful相關品種，G2.2又分為2個次亞組(G2.2.1和G2.2.2)。起源地中海流域、中亞和卡利福尼亞地區的石榴聚為G2.2.1。G2.2.2可能是雜交群體，如‘早紅甜’石榴具有深紅色皮和籽、甜度高和軟籽粒優良性狀。石榴兩大組分類也與地區分布相關(圖4)。此外，Al-Sadi等的研究也支持地理起源證據。阿曼位于石榴兩大中心起源地也門和伊朗之間，是重要的石榴產區。Al-Sadi等[44]運用AFLP標記技術對5個阿曼地區的石榴品種、5個伊朗品種、1個也門品種、1個印度品種、1個黎巴嫩品種和1個西班牙品種進行遺傳多樣性分析，發現這些品種可能擁有共同起源，在過去國際貿易中引種傳播。

圖4　世界石榴遺傳群體分布圖(引自Ophir等[50])

雖然對世界石榴栽培品種遺傳多樣性研究較多，但對野生群體的研究較少。Singh等[51]使用SSR標記對印度地區51個野生石榴品種和37個栽培品種進行遺傳多樣性分析，發現栽培群體與喜馬拉雅山麓處自然生長的群體親緣關系更近。該研究補充了世界石榴野生群體與栽培群體間親緣關系的空白，為石榴育種提供了寶貴的資料。

中國是石榴栽培最多的國家之一，苑兆和研究團隊[2]依據石榴產區地理、氣候及生態條件，將石榴栽培區劃分為山東栽培區、河南栽培區、安徽栽培區、陜西栽培區、四川栽培區、新疆栽培區、云南栽培區和河北栽培區。Yuan等[55]利用熒光標記 AFLP對中國山東、安徽、陜西、河南、云南和新疆 6 個栽培石榴群體的 85 個品種類型進行遺傳多樣性研究，發現群體間的遺傳分化系數為0.2018，群體間的遺傳多樣性依次為河南群體>新疆群體>陜西群體>安徽群體>山東群體>云南群體。

此外，石榴高密度遺傳圖譜的建立將為分子輔助育種提供平臺。Harel-Beja等[17]通過SNP標記技術構建了首張高密度石榴遺傳圖譜，并通過QTL技術關聯分析果實大小、風味、色澤和籽粒軟硬度等果實品質性狀。Singh等[51]鑒定了4個與果實重量、酸度、白葉枯病性狀的關聯標記。

3　展望

NGS時代，基因組和轉錄組測序技術應用越來越多，石榴分子生物學研究將會達到新的高度。苑兆和研究團隊完成了石榴全基因組測序項目，為深入研究石榴功能基因提供大數據支持，將有力推動世界石榴分子生物學研究。

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2016-06-30

國家自然科學基金項目(31272143)；南京林業大學高層次人才科研啟動基金(GXL2014070)；江蘇省普通高校研究生科研創新計劃項目(KYLX16_0857)；南京林業大學優秀博士學位論文創新基金項目; 江蘇省高校優勢學科建設工程項目(PAPD)。

苑兆和(1963-)，男，山東招遠人，教授，博士生導師，研究方向為經濟林培育與分子生物學研究。E-mail: zhyuan88@hotmail.com

S665.4

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1002-2910(2016)05-0001-08