ELISA與FACS定量方法檢測血清AQP4抗體診斷NMO的Meta分析

楊彬彬　孫艷霞　劉磊　孫林　代飛飛　王佳偉

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ELISA與FACS定量方法檢測血清AQP4抗體診斷NMO的Meta分析

楊彬彬孫艷霞劉磊孫林代飛飛王佳偉

目的系統評價酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、流式細胞術(FACS)檢測血清水通道蛋白4抗體(AQP4-IgG)對診斷視神經脊髓炎(NMO)的準確性。方法檢索國內外公開發表的相關文獻。根據題目、摘要、全文逐步篩選，采用質量評價工具(QUADAS)分析文獻質量。采用Meta-Disc1.4與STATA 12.0軟件進行Meta分析。根據Meta分析結果綜合評價ELISA和FACS方法診斷NMO的準確性。結果經過嚴格的納入及排除標準，最終納入17篇文獻。ELISA和FACS方法合并敏感度分別為0.63(95%CI：0.58～0.68)和0.55(95%CI：0.48～0.61)，合并特異度分別為0.98(95%CI：0.97～0.98)和0.99(95%CI：0.98～0.99)。擬合受試者工作特征曲線(SROC)，得到SROC曲線下面積(AUC)分別為0.9521和0.9542。結論通過ELISA和FACS方法檢測AQP-4-IgG對于診斷NMO特異度高，兩者都具有較高的診斷效能和準確率。但受納入研究質量和數量限制，兩種方法診斷效能的一致性尚需開展更多高質量研究予以驗證。

視神經脊髓炎；水通道蛋白4；酶聯免疫吸附試驗；流式細胞術；Meta分析

視神經脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是主要累及視神經和脊髓的中樞神經系統炎性脫髓鞘病，其臨床表現與多發性硬化(multiple sclerosis，MS)有相似之處，兩者的鑒別診斷存在一定困難。近年來，學者們在NMO患者血清中發現一種作用于水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP-4)的自身抗體(NMO-IgG/AQP4-IgG)，對診斷NMO具有較高的敏感性和特異性，并在NMO和MS的鑒別診斷中具有重要意義。2006年，Wingerchuk等[1]將NMO-IgG檢測結果納入NMO 3個支持診斷標準。

AQP4-IgG的檢測技術也成為研究的焦點。Ruiz-Gaviria等[2]研究發現，細胞熒光免疫染色技術(cell-based fluorescent immunostaining assay，CBA)和酶聯免疫吸附技術(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)都具有極高的特異度，CBA的靈敏度高于ELISA，兩者均可以作為臨床檢測AQP4-IgG的可靠技術。近年來越來越多的證據表明[3-5]，AQP4-IgG含量與NMO的嚴重程度及疾病活動有關。定量技術更利于長期監測血清AQP4-IgG的濃度，指導治療和評估預后。ELISA是常用的定量檢測技術，目前有商品化的AQP4-IgG ELISA試劑盒；流式細胞技術(fluorescence activated cell sorter，FACS)是在CBA技術基礎上建立的定量檢測技術[6]，兩種方法都具有適用于大規模與量化檢測抗體的優勢，尤其是對于活動期病情監控與復發患者的治療具有重要的意義，并且相較CBA法而言，對AQP4-IgG的結果判讀更加客觀化。一系列臨床研究就檢測NMO患者AQP4-IgG的ELISA和FACS這兩種方法的診斷效能進行了評估，但結論尚不一致[7]。本研究采用Meta分析方法，對已發表的有關研究ELISA和/或FACS技術檢測NMO患者血清AQP4-IgG的文獻進行分析，旨在系統評價ELISA和FACS法檢測血清AQP4-IgG對診斷NMO的準確性。

1　資料和方法

1.1文獻檢索檢索PubMed(www.ncbi.nlm.

nih.gov/pubmed)、Cochrane圖書館(www.coch

ranelibrary.com)、中國知網(CNKI，www.cnki.

net)和萬方數據庫(www.wanfangdata.com.cn)。英文檢索詞：“neuromyelitis optica”和“aquaporin 4”；中文檢索詞：“視神經脊髓炎”和“水通道蛋白4”；檢索時間范圍：2004-01-01—2016-03-31；研究對象：人類。為避免漏查文獻，對所納入文獻和相關綜述中提供的參考文獻進行二次檢索。納入標準：(1)研究類型：采用ELISA或者FACS技術檢測NMO患者血清AQP4-IgG的診斷性研究；(2)NMO患者的診斷參照Wingerchuk等1999年制訂[8]或2006年修訂[1]的NMO診斷標準；(3)能夠獲取完整文獻；(4)能直接或間接計算真陽性、假陽性、真陰性、假陰性值。排除標準：(1)其他方法檢測NMO患者血清AQP4-IgG的文獻；(2)未說明診斷NMO患者的標準；(3)缺少對照組；(4)研究對象年齡<18歲；(5)原始文獻實驗設計不嚴謹，如重復性研究、統計方法錯誤、樣本資料不全，不能直接或間接獲得四格表資料；(6)為綜述、 會議論文、 信件、 評論及個案報道類文獻。

1.2方法

1.2.1文獻評價方法：由2名研究者采用Cochrane協作網推薦的用于診斷性Meta分析的QUADAS(quality assessment of diagnostic accuracy studies)量表[9]獨立評價文獻質量。根據14個條目對納入的每個研究逐條按 “是”、“否” 和 “不清楚”進行評價：“是”為滿足此條標準，“否”為不滿足或未提及，部分滿足或從文獻中無法得到足夠信息的計為“不清楚”。并交叉核對，如遇分歧，則咨詢第三方協助判斷。

1.2.2數據收集：數據由2名研究者采用設定的表格獨立收集。每篇文獻的收集信息包括第一作者、出版年份、期刊名稱、研究對象、參考標準、樣本量、檢測方法以及每種檢測方法得到的真陽性、假陽性、真陰性和假陰性例數。必要時通過郵件或電話聯系原作者提供數據。

1.3Meta分析和統計學處理采用Meta Disc 1.4和STATA 12.0 軟件進行分析。采用Spearman相關分析檢查由閾值效應引起的異質性，采用Q檢驗和Inconsistency(I2)評價非閾值效應引起的異質性，若異質性檢驗結果為P>0.10，可認為各研究具有同質性，若P≤0.10，則認為各研究結果間存在異質性；同時，結合I2對異質性進行定量分析，若I2=0，表明沒有觀察到異質性，I2分別為25%、50%、75%表示異質性的低、中、高，若I2>50%則表明存在比較明顯的異質性。若各研究間無統計學異質性，采用固定效應模型進行 Meta分析；反之，則采用隨機效應模型進行 Meta分析。按照相應的效應模型，分別對ELISA和FACS兩種檢測方法計算合并的敏感度(SEN)、特異度(SPE)、陽性似然比(positive likelihood ratio,+LR)、陰性似然比(negative likelihood ratio,-LR)、診斷比值比(diagnostic odds ratio，DOR)及其相應的95%CI。繪制敏感度和特異度的森林圖以及匯總受試者工作特征曲線(summary receiver operating characteristic curve，SROC)，計算曲線下面積 AUC和Q*指數。分別對ELISA和FACS研究的漏斗圖進行線性回歸，并計算P值檢測發表偏倚，并進行敏感性分析。

2　結果

2.1文獻檢索結果共獲得相關文獻1140篇，經逐層篩選后，最終納入17個研究[3,5-6,10-23]。文獻篩選流程及結果見圖1。

2.2納入研究的基本特征與質量評價納入研究的詳細信息和質量評價見表1。納入的17篇文獻中，有關ELISA檢測方法的文獻12篇，NMO患者共390例，對照共1350例；涉及FACS檢測方法的文獻7篇，NMO患者共232例，對照共805例。除文獻[14]參照的是1999年Wingerchuk等制訂的標準外，其余文獻均參照2006年Wingerchuk等修訂的診斷標準。

圖1　文獻篩選流程及結果

納入文獻對照組構成總例數AQP4-IgG陽性例數總例數NMO組AQP4-IgG陽性例數檢測方法質量評價aApiwattanakul等[10]MS50105ELISA13Fazio等[6]MS、HC8733310FACS11Hayakawa等[3]MS、OND、HC21252115ELISA 10Kim等[5]MS、OND、HC20546446ELISA10Waters等[11]MS、OID、HC8603518ELISA、FACS10DeVidi等[12]MS、CIS、HC3604818FACS9Ketelslegers等[13]MS、OND24623620FACS9Isobe等[14]MS、OIND、 OND、HC20962915FACS、ELISA11Kalluri等[15]MS、OND10201811FACS9Jarius等[16]MS、OND、HC15326650ELISA10Kim等[17]MS、OND70395ELISA11Wu等[18]MS、HC15643426ELISA12陳淑媛等[19]MS、HC603106ELISA10李敏等[20]MS、HC10826734ELISA10連淑芬等[21]MS1301613ELISA12葉靜等[22]MS、HC7312915ELISA10楊春生等[23]MS、OND3903328FACS10

注：FACS：流式細胞技術，表2～3、圖3～4同；NMO：視神經脊髓炎；MS：多發性硬化；HC：健康對照；OND：其他神經系統疾??；OID：其他自身免疫性疾??；CIS：臨床孤立綜合征；OIND：其他炎性神經系統疾??；a表示滿足QUADAS(quality assessment of diagnostic accuracy studies)量表獨立評價文獻質量的條目數量(總共14個條目)

2.3異質性檢驗

2.3.1閾值效應：ROC曲線平面圖未呈“肩臂狀”分布，提示不存在閾值效應。進一步計算靈敏度對數與(1-特異度)對數的Spearman相關系數，rELISA=-0.063，P=0.846；rFACS=-0.714，P=0.071，亦表明均不存在閾值效應。

2.3.2非閾值效應：ELISA法中參數敏感度、陰性似然比以及FACS法中各參數均存在非閾值效應引起的異質性，故Meta分析模型選用隨機效應模型。ELISA方法中特異度、陽性似然比、診斷比值比的異質性檢驗P>0.1且I2<25%，故選用固定效應模型。結果見表2。

2.4Meta分析結果ELISA和FACS的合并效應量以及擬合SROC曲線得到AUC及 Q*值見表3，合并敏感度、特異度森林圖、SROC 曲線見圖 2～4。

2.5發表偏倚應用Deeks漏斗圖法檢測發表偏倚，結果顯示ELISA及FACS法斜率系數差異均無統計學意義(均P>0.05)，表明均不存在發表偏倚。

2.6敏感性分析分別將ELISA和FACS方法中納入研究文獻逐一剔除，重新進行 Meta 分析，結果顯示，合并效應量未見明顯改變，表明合并量穩定性較好。

3　討論

NMO以其致殘率高、易復發、預后差等特點嚴重威脅人類的健康。NMO-IgG/AQP4-IgG對NMO的早期診斷、治療及判斷預后具有至關重要的作用。Hayakawa等[3]研究發現AQP4-IgG濃度高的NMO患者癥狀亦較重，AQP4-IgG濃度隨擴展殘疾狀態量表(expanded disability statusscale,EDSS)評分增高有升高趨勢，免疫調節治療后和疾病緩解期濃度降低。Kim等[5]也發現NMO患者血清AQP4-IgG含量在急性復發期顯著高于緩解期，復發前期含量已經開始升高，AQP4-IgG含量與疾病活動呈正相關。AQP4-IgG含量可以監測疾病活動情況，同時結合影像學資料以及治療情況的研究，可以分析出AQP4-IgG作為NMO生物指標的判斷界值。然而，AQP4-IgG是否是預測NMO病情發展、轉歸的一個可靠標記物，仍然有待進一步證實。由于定量技術更利于長期客觀地監測AQP4-IgG濃度，探討與疾病嚴重程度的關系，而且ELISA和FACS可實現機械自動化，在費用相對低廉的前提下實現大樣本量檢測，因而對于臨床推廣該抗體檢測應用有著重要的意義。

表2　ELISA和FACS兩種方法各參數異質性檢驗結果

表3　ELISA和FACS方法參數合并統計結果

注：AUC：工作特征曲線下面積

圖2　ELISA敏感度(A)及特異度(B)森林圖

圖3　FACS敏感度(A)及特異度(B)森林圖

圖4　ELISA(A)及FACS(B)的SROC曲線

基于上述原因，本研究對采用上述兩種技術定量檢測AQP4-IgG的研究文獻進行了Meta分析，結果顯示，ELISA和FACS檢測AQP4-IgG合并特異度分別為0.98(95%CI：0.97～0.98)和0.99(95%CI：0.98～0.99)，表明兩種檢測方法的特異度高，均可較好地避免誤診的發生。ELISA和FACS方法SROC的AUC分別為0.9521和0.9542，其對應的Q*指數分別為0.8934和0.8963。SROC曲線的AUC值是衡量某一診斷方法準確性的指標，AUC越接近1診斷效果越好，AUC>0.9時有較高的準確性。Q*值反映了ROC曲線與左上角的接近程度，可以對診斷性試驗的綜合能力進行判斷，Q*值越大表示診斷性試驗的準確率越高。綜上結果表明，ELISA法和FACS法檢測AQP4-IgG對于NMO的診斷都具有較高的診斷效能和準確率。同時，作者研究小組亦注意到ELISA和FACS合并敏感度分別為0.63(95%CI：0.58～0.68) 和0.55(95%CI：0.48～0.61)，表明ELISA法的靈敏度較FACS法更高。分析其可能原因為：首先，由于兩者納入樣本量不同所致，FACS納入樣本量低于ELISA法；其次，對于AQP4-IgG檢測，兩種方法的發展程度不同所致，ELISA方法較為成熟,而FACS方法尚處于研究階段。

本研究存在一定的局限性。首先，異質性是Meta分析固有的局限性。由異質性檢驗結果可見，ELISA與FACS法數據均存在異質性，尤其是FACS法異質性較高，其可能原因為：(1)該Meta分析中納入的大多數研究對象是亞洲人群，這可能會導致人口選擇偏倚。(2)目前已知AQP4存在 2 種亞型，即M1和M23[24]，FACS方法中納入的文章由于采用人AQP4 cDNA質粒M1或M23進行轉染，轉染到人胚腎細胞(HEK293細胞)[6,11-14,23]或者人神經膠質瘤細胞系(LN18)[15]，這些技術的不同也會產生異質性。(3)ELISA方法中由于使用了不同公司生產的試劑可能會導致檢測偏倚。(4)由于患者可能處于不同病程期，檢測時間點不同，以及可能存在藥物治療等影響因素而產生異質性。(5)采用的診斷標準不同，其中包括1999年和新修訂的2006年Wingerchuk診斷標準，可能導致多重參照偏倚。受制于納入研究的文獻數量不足，本文未對引起異質性的原因進行進一步亞組分析。此外，排除診斷方法造成的假陰性，仍有少部分的NMO患者血清中檢測不到AQP4-IgG[25]。這部分AQP4-IgG陰性的患者可能與AQP4-IgG陽性患者存在不同的發病機制，或者由其他抗體，如髓鞘少突膠質細胞糖蛋白抗體(MOG-IgG)介導[26]。

此外，本文Meta分析亦存在下列局限性：(1)納入文獻質量多為中等，整體質量不高，這在一定程度上影響了研究結論的可靠性。(2)僅納入了中、英文文獻，不排除語言偏倚的可能。(3)發表偏倚不容忽視，本研究通過漏斗圖法未檢測到發表偏倚。

綜上所述，ELISA和FACS作為檢測AQP4-IgG的兩種定量方法，其特異度高，均具有較高的診斷效能和準確率，對NMO的診斷、鑒別診斷、指導治療及預后評估有重要價值。但受納入研究質量和數量限制，兩種方法診斷效能的一致性尚需開展更多高質量研究予以驗證。

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(本文編輯：時秋寬)

Quantitative detection of aquaporin-4 antibody in serum by ELISA and FACS in the diagnosis of neuromyelitis optica: A meta-analysis

YANGBinbin,SUNYanxia,LIULei,SUNLin,DAIFeifei,WANGJiawei*.

*Medical Research Center, Tongren Hospital, Capital Medical University; Department of Neurology, Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing 100730,China

Correspondingauthor：WANGJiawei,Email:wangjwcq@163.com

ObjectiveTo systematically review the diagnostic accuracy for neuromyelitis optica (NMO) depending on detection of aquaporin-4(AQP-4) antibody in serum by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) and flow cytometry(FACS). MethodsA search of major digital database and hand search of

were conducted. All published studies relating to the detection of AQP-4 antibody in serum by ELISA and FACS for patients with NMO were retrieved. Two reviewers independently and stepwisely screened the literature according to the titles, abstracts and the full texts, extracted data, and methodological quality of included studies was assessed by QUADAS. Meta-analysis was then conducted using Meta-Disc 1.4 and STATA 12.0 software. The overall sensitivity and specificity of ELISA and FACS were pooled separately and compared with overall accuracy measure: summary receiver operating characteristic curve (SROC). ResultsAfter applying the inclusion and exclusion criteria, 17 studies were included in this systematic review and meta-analysis. The results of meta-analysis showed: the pooled sensitivity of ELISA was 0.63(95%CI:0.58-0.68) and FACS 0.55(95%CI:0.48-0.61), the pooled specificity of ELISA was 0.98(95%CI:0.97-0.98) and FACS 0.99 (95%CI:0.98-0.99). The AUCs for ELISA and FACS were similar (0.9521 and 0.9542, respectively). ConclusionsAQP4 detection in serum with ELISA or FACS is a useful tool for the diagnosis of patients with NMO, due to high specificity and excellent AUC results. However, due to limited quality and quantity of the included studies, more well-conducted studies are needed to verify the consistency of diagnostic efficacy between two methods.

neuromyelitis optica; aquaporin 4; ELISA; FACS; meta-analysis

3969/j.issn.1006-2963.2016.05.009

100730 首都醫科大學附屬北京同仁醫院中心實驗室(楊彬彬、孫艷霞、王佳偉)，神經內科(劉磊、孫林、代飛飛、王佳偉)

王佳偉，Email：wangjwcq@163.com

R744.5+2

A

1006-2963(2016)05-0344-07

2016-05-18)