誘導大豆抗胞囊線蟲病和根腐病的生防細菌研究

閆繼辰 王媛媛 朱曉峰 劉曉宇 陳立杰 段玉璽

摘要[目的]篩選誘導大豆抗胞囊線蟲病和根腐病的生防細菌，挖掘高效的新型微生物代謝物種衣劑。[方法]從誘導抗性角度，以大豆胞囊線蟲和大豆根腐病菌為靶標，通過對2 400株細菌發酵液包衣大豆種子處理、大田和溫室盆栽試驗，篩選誘導大豆抗胞囊線蟲病和根腐病的生防細菌。[結果]獲得Sneb152、Sneb572、Sneb877、Sneb1076、Sneb1401和Sneb1499共6株對病原物具有誘抗活性的生防細菌，6株生防細菌均可誘導大豆抗胞囊線蟲病，抑制率超過74.98%，且能顯著促進大豆生長，增產效果明顯；菌株Sneb572和Sneb1076對大豆根腐病也有一定防效。[結論]優良誘抗生防菌株Sneb572和Sneb1076用于處理大豆種子前景廣闊。

關鍵詞 生防菌；大豆胞囊線蟲??；根腐??；促生長；誘導抗性

中圖分類號 S435.651 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2016）09-134-06

Abstract[Objective]To screen the biocontrol bacterium inducing soybean cyst nematode and soybean root rot diseases，and to find highefficient new microbial metabolites seed coatings.[Method]From the aspect of induced resistance，soybean cyst nematode and soybean root rot pathogen were used as the targets.A total of 2 400 coating soybean seeds were processed in bacteria fermentation liquid.[Result]After field and greenhouse screening，6 strains of biocontrol bacteria （Sneb152，Sneb572，Sneb877，Sneb1076， Sneb1499 and Sneb1401） were obtained，which had resistance activity to the pathogen.The 6 strains of biocontrol bacteria could all induce soybean cyst nematode with the inhibition rate being more than 74.98%.They could significantly promote the growth of soybean and had obvious yield increasing effect.Besides，strains Sneb572 and Sneb1076 also had certain control effects on soybean root rot.[Conclusion]Sneb572 and Sneb1076 have broad application prospects in soybean seed treatment.

Key words Biocontrol bacteria； Soybean cyst nematode； Root rot disease； Growth promotion； Induced resistance

連作大豆通常減產幅度在15%～30%[1]，減產的原因是多種因素綜合作用導致的，以土壤中的病原物威脅最大[2]。大豆根部病害首要的是大豆胞囊線蟲病，其次是幼苗根腐病菌等。大豆胞囊線蟲（Heterodera glycines）病是由大豆胞囊線蟲（SCN）侵染引起的，是危害世界大豆生產的重要病害之一，具有分布廣、傳播途徑多、休眠體存活時間長、危害嚴重等特點，是一種極難防治的土傳病害，給大豆生產造成嚴重損失。目前，該病在許多大豆主產國如美國、巴西、阿根廷和中國等都有發生[3]。該病一般造成大豆減產10%～20%，嚴重時減產70%～90%甚至絕產[4]。由于大豆胞囊線蟲病的危害，致使大豆根部受損，致根部次生菌侵染，加重根腐病的危害。大豆根腐病是嚴重影響大豆苗期生長的一種土傳病害[5]，由于其傳播速度快、分布廣泛、危害性大、毀滅性強、防治困難，已被列為大豆生產中毀滅性病害之一[6-7]，嚴重影響了大豆的質量和產量，其造成的產量損失一般在 10%～30%，嚴重時達50%～60%甚至絕產[8]。大豆根腐病是由多種土壤習居菌復合侵染引起的，主要為尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、禾谷鐮孢菌（F.graminearum）、燕麥鐮孢菌（F.avenaoeum）、茄腐鐮孢菌（F.solani）、半裸鐮孢菌（F.semitectum）、終極腐霉菌（Pythium ultimum）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）[9]。發病普遍的是由疫霉菌、鐮刀菌引起的根腐病，少部分是由腐霉菌侵染及立枯絲核菌引起，重茬使大豆根腐病加重，致其防治更加困難[5，10]。近 20 年來，我國各省也分別對大豆根腐病進行了報道[9-12]。

種衣劑是20世紀60年代發展起來的一類農藥，多采用殺菌劑或高毒殺線劑，用其包衣種子不但可防治病蟲害、增加產量，而且可增加植物抗逆性、節約成本[13]。種衣劑在大豆上已得到廣泛應用[12，14-15]，對大豆根腐病和胞囊線蟲有一定的防治效果，但部分種衣劑效果不理想。某些高毒的殺蟲劑由于環境問題被逐漸禁用，從而促使人們必須找到替代高毒農藥的新產品。生物種衣劑是一種新的選擇，筆者選用真菌發酵液包衣處理大豆種子，挖掘高效的新型微生物代謝物種衣劑，探索了利用微生物代謝物和誘導抗性防控大豆根腐病的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。2 400株細菌由沈陽農業大學北方線蟲研究所提供。

1.1.2 根腐病原菌。尖孢鐮刀菌、茄腐鐮刀菌均由沈陽農業大學北方線蟲研究所提供。

1.1.3 供試品種，大豆品種：遼豆15，由遼寧省農業科學院大豆研究所提供。

1.1.4 種衣劑。商品種衣劑商品名為BFA，為中財盛世（北京）生物科技發展有限公司內蒙古莫旗分公司產品。其主要成分為生物體制劑“BFA”結合先進菌種。標準代號：Q/CHS03-2001。

1.2 方法

1.2.1 誘導大豆抗根部病害的生防細菌初篩試驗。

1.2.1.1 材料準備。2 400株細菌在蛋白胨牛肉膏（NA）液體培養基中發酵5 d。篩選出的生防菌發酵液采用1∶70的種子量進行種子包衣處理，以不包衣為空白對照（CK），干燥后裝袋并編號備用。

1.2.1.2 田間布置。

在遼寧省康平縣進行試驗，每個處理行長為5.00 m，行距為0.65 m，處理間隔為1.00 m。以不包衣為空白對照（CK）。試驗田為連作大豆田，土壤為大豆胞囊線蟲病和大豆根腐病田間自然發病土。

1.2.1.3 田間調查。

在大豆播種后35 d（大豆苗期），每個處理隨機取5株苗。取樣時先去掉表土（0～5 cm），將植株連根挖出，保持根系完整，先計數根上胞囊數量，然后放入取樣袋中封存，寫好標簽帶回實驗室。測定項目：胞囊抑制率、大豆根腐病病情指數、根腐病防效。根腐病病級分級按0～5的6級分類法進行（表1）。

病情指數=（病情指數×該級指數）/（調查株數×最高病級）×100

根腐病防效=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100%

胞囊抑制率=（對照胞囊數-處理胞囊數）/對照胞囊數×100%

1.2.2 誘導大豆抗根部病害的生防細菌復篩試驗。

1.2.2.1 材料準備。

初步篩得的細菌在NA液體培養基中發酵5 d。篩選出的生防菌發酵液采用1∶70的種子量進行種子包衣處理，BFA按照使用說明包衣大豆作為對照，干燥后裝袋并編號備用。

1.2.2.2 田間布置。在遼寧省康平縣進行5次重復試驗，每個處理行長為5.00 m，行距為0.65 m，處理間隔為1.00 m。以不包衣為空白對照（CK），以商品種衣劑BFA為平行對照。試驗田為連作大豆田，土壤為大豆胞囊線蟲病和大豆根腐病田間自然發病土。

1.2.2.3 田間調查取樣。

在大豆播種后35 d（大豆苗期），每個處理隨機取5株苗。取樣時先去掉表土（0～5 cm），將植株連根挖出，保持根系完整，先計數根上胞囊數量，然后放入取樣袋中封存，寫好標簽帶回實驗室。測定項目：胞囊抑制率、大豆根腐病病情指數、根腐病防效、根長、苗高、根部鮮重、地上部鮮重和出苗率。同時于大豆成熟期，各處理隨機選取5株大豆，測定其單株大豆株高、單株莢數、單株粒數和百粒重。

出苗率=出苗總數/播種種子總數×100%

1.2.3 生防細菌誘導大豆抗根部病害的室內驗證試驗。

1.2.3.1 發酵液包衣對大豆種子萌發的影響試驗。

將試驗所需的培養皿進行高壓蒸汽滅菌，備用。每份取100粒大豆種子，使用直徑為90 cm的培養皿，在其底部墊上大小合適的滅菌圓形濾紙，用無菌水濕潤后，均勻放入經種衣劑包衣處理的種子，每皿放入20粒種子，每個處理5次重復。同時設空白對照。蓋上培養皿蓋，置于溫度為（28±1）℃、相對濕度為85%的恒濕培養箱中培養。7 d后記錄發芽率并測量芽長和根長，計算種子活力指數[16]。

發芽率=第7天發芽的種子數/供試種子數×100%

種子活力指數（VI）=（芽長+根長）×發芽率

1.2.3.2 生防細菌促進大豆生長試驗。

采用室內盆栽處理，取無大豆胞囊線蟲的土和細沙，165 ℃干熱滅菌2 h，通風冷卻2 d后，將土、沙按體積比2∶1的比例混合均勻，裝入16 cm×16 cm黑色塑料缽中。用生防菌發酵液包衣大豆，待種子陰干后播種。每缽播種3粒包衣好的大豆種子，以無菌水為對照，5次重復。30 d后，將植株取出，保持根系完整。用流水將根部泥土洗凈，并用濾紙吸干，測量單株大豆的株高、主根長、地上部分鮮重和地下部分鮮重。

1.2.3.3 生防細菌誘導大豆抗胞囊線蟲試驗。采用室內盆栽處理，取無大豆胞囊線蟲的土和細沙，165 ℃干熱滅菌2 h，通風冷卻2 d后，將沙、土按體積比2∶1的比例混合均勻，裝入16 cm×16 cm黑色塑料缽中。用生防菌發酵液包衣大豆，待種子陰干后播種。每缽播種3粒包衣好的大豆種子，以無菌水為對照，5次重復。待豆苗長至2片子葉時，每缽留苗1顆，接種2 000條大豆胞囊線蟲2齡幼蟲（J2）。30 d后，將植株取出，保持根系完整。用流水將根部泥土洗凈，用濾紙吸干并計根內線蟲數和線蟲抑制率。同時將根系用流水清沖洗，濾紙吸干根表水分，稱量根鮮重。采用次氯酸鈉-酸性品紅染色法進行根內線蟲的染色，在體式顯微鏡下觀察記錄根內各蟲態線蟲數量。

線蟲抑制率=（對照線蟲數-處理線蟲數）/對照線蟲數×100%

1.2.3.4 生防細菌誘導大豆抗大豆根腐病試驗。

用高粱米對鐮孢菌分離菌株進行擴繁。將100 g高粱米置于500 mL三角瓶中，用水浸泡過夜后棄水，高壓滅菌 1 h。選取PDA培養基上活化2～3 d的供試尖孢鐮刀菌和茄腐鐮菌菌絲尖端部分，用直徑為8 mm的打孔器采集菌片，接種至上述高粱米表面，28 ℃培養7～10 d。待鐮孢菌菌絲長滿高粱米培養物后，將其粉碎成粉末狀備用。盆栽致病性測定試驗在 28 ℃恒溫溫室內進行，先將盆栽土于121 ℃濕熱滅菌90 min，再按照2%質量比混合鐮孢菌于高粱米粉末并置于已滅菌的0.5 L盆栽盆中，每盆播入5粒大豆。30 d時記錄根腐病發病級別，計算病情指數[17]。

1.2.3.5 系統性誘導抗性試驗。

參照裂根法[18]驗證生防菌誘導大豆產生對大豆胞囊線蟲病和大豆根腐病的系統抗性。大豆在室內生長到2葉期，將大豆根系按照垂直方向從中間分成兩部分，并且分別標注誘導部分和應答部分，然后將兩部分根分開放入新的營養缽中。在誘導部分接種5 mL生防菌發酵液或滅活生防菌發酵液，應答部分不接種?？瞻讓φ罩?，誘導部分接種無菌水。為了防止生防菌在兩部分根中發生污染，每一個營養缽底部都用單獨的托盤隔離放置。接種生防菌28 d后，在每株大豆的應答部分接種2 000條J2和大豆根腐病原菌1×105個/mL的孢子懸浮液。3 d后，取出應答部分根系，然后對根系進行染色，計數根系內侵染的J2數量和線蟲抑制率；5 d后，取出應答部分根系，測定病情指數和防治效果。

1.3 數據處理 應用Excel和SPSS軟件對數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 誘導大豆抗根部病害的生防細菌初篩試驗結果

通過初次大田試驗，從2 400株細菌中篩選出6株細菌，分別為Sneb152、Sneb572、Sneb877、Sneb1076、Sneb1401和Sneb1499（圖1），該6株生防菌均能顯著提高大豆抗胞囊線蟲?。ㄒ种坡食^74.98%）和大豆根腐?。ǚ佬С^22.22%）。

2.2 誘導大豆抗根部病害的生防細菌復篩試驗結果

2.2.1 大田促進生長試驗結果。

通過三地大田復篩試驗，苗期的調查結果（表1）顯示，BFA促進植株增高的效果不及對照，與對照相比，生防細菌Sneb1401促進植株增高的效果最好，Sneb1076和Sneb572次之；BFA促進植株增高的效果與對照相當，與對照相比，生防細菌Sneb1401促進植株根系增長的效果最好，Sneb572、Sneb877和Sneb152次之；BFA促進地上部分鮮重增加的效果與對照相當，與對照相比，生防細菌Sneb877促進植株增高的效果最好，Sneb1076和Sneb1499次之；BFA促進根系鮮重增加的效果不及對照，與對照相比，生防細菌Sneb152促進根系鮮重增加的效果最好，Sneb1499、Sneb572和Sneb1401次之；BFA促進出苗的效果優于對照，與BFA相比，生防細菌Sneb877促進出苗的效果最好，Sneb1076、Sneb1499和Sneb572次之。綜上，與對照和BFA相比，生防細菌Sneb1401促進植株增高、植株根系增長、地上部分鮮重增加、根系鮮重增加和出苗效果最顯著，而Sneb877、Sneb1076、Sneb572、Sneb1499和Sneb152次之。

2.2.2 生防細菌誘導大豆抗胞囊線蟲和根腐病的大田試驗結果。

由表2可知，BFA在抑制胞囊作用方面的效果顯著優于對照，與BFA相比，生防細菌Sneb572在抑制胞囊作用方面的效果最好，Sneb1076和Sneb877次之；BFA在抑制根腐病作用方面的效果不及對照，與BFA相比，生防細菌Sneb1401在抑制根腐病作用方面的效果最好，Sneb572、Sneb877和Sneb1076次之。綜上，與對照和BFA相比，生防菌普遍具有顯著促進植株出苗作用，生防細菌Sneb572在抗胞囊線蟲病和根腐病原菌的作用方面具有最顯著效果。生防細菌Sneb1076、Sneb877和Sneb1401在抗胞囊線蟲病和根腐病原菌的作用方面同樣具有顯著效果。

2.2.3 生防細菌對大豆產量構成的影響。

通過對大田成熟期大豆的調查，結果（表3）表明，BFA促進植株增高的效果顯著優于對照，與BFA相比，生防細菌Sneb152促進植株增高的效果最好，Sneb1401和Sneb1499次之；BFA促進單株豆莢數增長的效果顯著優于對照在遼寧省康平縣的試驗田，與BFA相比，生防細菌Sneb1076促進單株豆莢數增長的效果最好，Sneb877和Sneb152次之；BFA促進單株豆粒數增長的效果顯著優于對照在遼寧省康平縣的試驗田，與BFA相比，生防細菌Sneb877促進單株豆粒數增長的效果最好，Sneb1076次之；BFA促進百粒豆粒鮮重增加的效果與對照相當，與BFA相比，生防細菌Sneb1401促進單株豆粒數增長的效果最好，Sneb1076、Sneb1499、Sneb152和Sneb572次之。綜上，與對照和BFA相比，在大豆成熟期生防細菌普遍促進植株增長效果顯著，而生防細菌僅有Sneb152、Sneb1401和Sneb1499具有促進植株增長的作用。生防細菌Sneb1076在促進植株單株夾數和單株粒數增長、百粒重鮮重增加方面效果最顯著，Sneb877、Sneb152、Sneb1401、Sneb1499和Sneb572次之。

2.3 生防細菌誘導大豆抗根部病害的室內試驗驗證結果

2.3.1 促進大豆種子萌發的試驗結果。通過室內生防菌發酵液包衣大豆種子發芽試驗，結果（圖2）表明，與對照相比，Sneb572、Sneb1076、Sneb1401和Sneb1499都具有顯著促進大豆種子發芽率和種子活力指數的作用。綜上，與對照相比，生防細菌Sneb1401促進大豆種子發芽率和種子活力效果最顯著，Sneb1499和Sneb572次之。

2.3.2 生防細菌促進大豆生長的試驗結果。

通過室內盆栽試驗，結果（表4）表明，與對照相比，4株生防菌均具有顯著促進株高和根長增加的作用；在地上部分重方面和根重方面，與對照相比，Sneb1076和Sneb1499生防菌株都能顯著促進植株鮮重增加。綜上，與對照相比，生防細菌Sneb1499在促進植株增高、根系增長、地上部分鮮重增加和根系鮮重增加方面效果最顯著，Sneb1401、Sneb1076和Sneb572次之。

2.3.3 生防細菌誘導大豆抗胞囊線蟲的試驗結果。通過室內抗胞囊線蟲病試驗，結果（圖3）表明，與對照相比，在抗胞囊線蟲病方面4株生防細菌可顯著促進大豆抗大豆胞囊線蟲。Sneb1499促進大豆防效最高達43.71%。綜上，與對照和菌劑相比，生防細菌Sneb1499抑制胞囊線蟲作用效果最顯著，Sneb1401和Sneb1076次之。

2.3.4 生防細菌誘導大豆抗大豆根腐病的試驗結果。

通過室內抗根腐病試驗，結果（圖4）表明，與對照相比，在抗根腐病原菌尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌方面，4株生防菌都顯著促進大豆抗病，其中

Sneb572和Sneb1076對茄腐鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的防效高達70.00%。綜上，與對照相比，生防菌皆對茄腐鐮刀菌和尖孢鐮刀菌有顯著抗性。

2.3.5 系統性誘導抗性試驗結果。

通過室內系統性誘導抗性試驗，結果（表5）表明，應答根系與空白根系相比，生防細菌對線蟲抑制率超過50.90%，其中Sneb572對線蟲的抑制率高達84.88%；生防細菌對茄腐鐮刀菌的防效超過58.34%。綜上，與對照相比，生防細菌Sneb572誘導大豆抗胞囊線蟲以及對茄腐鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的防治效果最顯著，Sneb1076、Sneb1401和Sneb1499次之。

3 結論與討論

該研究從2 400株細菌中篩選出6株生防細菌Sneb152、Sneb572、Sneb877、Sneb1076、Sneb1401和Sneb1499，采用這6株菌處理大豆種子，均能顯著提高大豆抗胞囊線蟲病和大豆根腐病的抗性；經過第2年復篩試驗，結果表明，與對照和BFA種衣劑相比，Sneb152、Sneb572、Sneb877、Sneb1076、Sneb1401和Sneb1499不僅能顯著提高大豆抗胞囊線蟲病和大豆根腐病的抗性，還具有促進根系增長、提高生物學產量的作用，并且在不同地區重復中均保持穩定效果；室內功能驗證結果表明，Sneb572、Sneb1076、Sneb1401和Sneb1499均具有顯著誘導大豆抗茄腐鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和大豆胞囊線蟲效果，可促進大豆發芽和增長，并且通過裂根試驗證明篩選出的生防菌對大豆胞囊線蟲和大豆根腐病具有系統性誘導抗性。綜合上述結果，獲得的Sneb572和Sneb1076生防菌株發酵液具有顯著地系統誘導大豆抗胞囊線蟲病和大豆根腐病、顯著地促進大豆生長和增產等作用，這與黃姍姍等[19]的研究結果相似，該2株優良誘抗生防菌株對大豆種子處理具有良好的應用前景，對其鑒定、復配和發酵條件及機制還有待于進一步研究。

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