塑化劑鄰苯二甲酸二丁酯與小牛胸腺DNA的溝槽結合

李 松，張國文

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌 330047)

塑化劑鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl Phthalate,DBP)是廣泛應用于工業生產，并存在于人們生活環境中的一種工業添加劑，為潛在有毒有害物質。研究表明，DBP作為一種雌激素類似物，主要對人體具有生殖和發育毒性[1]，另外還有一定的基因毒性和致癌性[2]。近年，塑化劑威脅人類健康的事件屢見不鮮，人們也越來越關注其安全性問題。DNA是重要的遺傳物質，在生命過程中發揮著重要作用，并掌控著遺傳信息的復制、轉錄和表達[3]，此外，DNA還是許多小分子在體內的作用靶點。小分子與DNA相互作用的研究能夠在分子水平提供其結合機制，以及小分子對DNA構象的影響等信息，有助于深入了解有害小分子對人體的毒理效應。

DBP在動物體內的毒性實驗已有一些研究[1,2]，但在體外與DNA相互作用還未見報道。本文以小牛胸腺DNA(ctDNA)為作用靶點，采用體外實驗，在模擬人體生理酸度(pH=7.4)條件下，應用多種光譜學方法、化學計量學，以及分子模擬技術研究DBP與ctDNA相互作用，以期為認識DBP與ctDNA的作用機制及DBP的毒性行為提供理論基礎。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器及試劑

F-7000型熒光光度計(日本，日立公司)；UV-2450型紫外-可見分光光度計(日本，島津公司)；MOS 450型圓二色光譜儀(法國，Bio-Logie公司)；Nicolet-5700型紅外光譜儀，配置ATR附件(美國，Nicolet公司)；烏氏粘度計(上海前鋒橡塑玻璃制品廠)；pHS -3C型酸度計(上海雷磁儀器廠)。

DBP標準品(純度≥99.5%，阿拉丁試劑公司)用95%乙醇配制成2.0×10-3mol·L-1的儲備溶液； ctDNA(Sigma公司)用0.1 mol·L-1NaCl溶液溶解，其濃度利用ε260=6 600 L·mol-1·cm-1[4]確定為2.45×10-3mol·L-1，測得A260/A280>1.80，表明ctDNA已充分脫去蛋白質；超螺旋pUC18質粒DNA(索萊寶試劑公司)；0.05 mol·L-1pH=7.4的Tris-HC1緩沖溶液。上述溶液均保存于4 ℃冰箱中備用，其他試劑均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1構建紫外吸收光譜數據矩陣實驗1：固定ctDNA溶液濃度為6.24×10-5mol·L-1，然后以每次2.0×10-6mol·L-1的濃度間隔加入31次DBP；實驗2：保持DBP溶液濃度為8.0×10-5mol·L-1不變，依次滴加濃度間隔為2.08×10-6mol·L-1的ctDNA 31次，至最終濃度為6.45×10-5mol·L-1。每次加樣后均混勻靜置4 min，待充分反應后進行紫外光譜測定，記錄波長215～350 nm數據，共136個數據點，得到了DctDNA(32×136) 和DDBP(32×136)兩個數據矩陣，組成[DctDNA,DDBP]矩陣。

1.2.2多元曲線分辨-交替最小二乘法(MCR-ALS) MCR-ALS是一種能夠分析數據矩陣、特征重疊光譜，并從復雜反應系統中記錄每一個參與組分的響應信號和濃度變化的有效方法[5]。該方法可以幫助我們從復雜反應系統中得到更多本質直觀的信息,如濃度變化、純光譜等。解析步驟如下：(1)構建擴展數據矩陣,通過奇異值分解(SVD)方法分析獲取體系中主要組分數目；(2)用漸進因子分析法(EFA)初步估計初始濃度，得到ALS迭代的初始濃度矩陣；(3)運用ALS進行迭代優化。

對于二維光譜數據矩陣，根據以下代數模型進行雙線性分解[6]:

D=C×ST+E

(1)

其中，D分別為光譜矩陣；C為濃度矩陣；ST為純光譜矩陣；E為誤差矩陣。

將1.2.1得到的光譜數據矩陣分解為：

(2)

1.2.3熒光光譜的測定分別在298、304和310 K三個溫度下向濃度為6.67×10-5mol·L-1的DBP溶液中連續滴加濃度間隔為6.24×10-6mol·L-1的ctDNA，在激發波長為254 nm，激發和發射狹縫均為2.5 nm下，掃描溶液在280～400 nm的熒光發射光譜。為消除紫外重吸收和內濾效應，所有熒光數據均采用文獻方法[7]對熒光數據進行校正。

1.2.4瓊脂糖凝膠電泳實驗將超螺旋pUC18質粒(DNA 3 μL，400 μg/mL) 用不同濃度的DBP處理并用Tris-HCl緩沖液稀釋至10 μL。在37 ℃水浴中孵化24 h后加入上樣緩沖溶液(包含0.03%溴酚藍、0.03%二甲苯藍和30%甘油)。準備1.0% 瓊脂糖凝膠，用GoldView 溶液染色，放入含有1×Tris-乙酸-EDTA緩沖液中，將樣品加入加樣孔中，在80 V電壓條件下電泳30 min，之后取出凝膠進行紫外成像。

1.2.5分子模擬從 Protein Data Bank 庫獲取B型DNA的結構(PDB ID:453D)，對接運行前對DNA進行去水、加氫和Gasteiger 電荷修飾。配體DBP模型通過SYBYL×1.1軟件構建，并在MMFF94力場使用MMFF94電荷將其能量最小化優化[8]。采用Autodock 4.2軟件進行分子對接(總共100次對接實驗)，并用Lamarckian Genetic Algorithm(LGA)算法完成對接計算，以2.0 ?的均方根偏差容量對100次對接結果進行能量分析，獲得一系列的能量簇，取能量最低且次數最多的構象進行分析。

2 結果與討論

2.1 DBP與ctDNA相互作用的紫外吸收光譜

實驗1為固定ctDNA濃度連續加入DBP，發現ctDNA位于259 nm處的特征吸收峰強度隨著DBP的加入緩慢增大并有一定的藍移，而位于230 nm附近的吸收強度有較大的增強(圖1A)。由實驗2結果可見，DBP在230 nm和285 nm處有兩個特征吸收峰，隨著ctDNA濃度的增加，DBP在230 nm處吸光度先減小后略微增大(圖1B)，并且在259 nm處出現一個新峰。DBP與ctDNA光譜高度重疊，很難獲得兩者相互作用有價值的信息。

2.2 MCR-ALS解析紫外光譜數據矩陣

利用MCR-ALS法對光譜數據擴展矩陣進行分析，通過奇異值分解(SVD)確定反應體系中的組分數。所提取到的前4個特征值分別為112.53、61.41、59.24和7.58，可以預測到體系中存在3種主要組分，即DBP、ctDNA和DBP-ctDNA復合物。MCR-ALS算法解析[DctDNA,DDBP]數據矩陣得到了3種組分濃度變化趨勢圖，隨著DBP加入量的增加，DBP-ctDNA復合物的濃度逐漸增大，伴隨著ctDNA濃度逐漸減少(圖2A)。相反，當向DBP溶液中加入ctDNA，DBP濃度逐漸降低而DBP-ctDNA復合物的濃度逐漸增加(圖2B)，并且解析出的各組分純光譜曲線(實線)與實際測得光譜曲線(虛線)較好地吻合(圖2C)，表明預測反應體系中存在3種主要組分且其濃度變化趨勢是可靠的，組分間濃度變化直觀地顯示DBP與ctDNA發生相互作用形成了復合物。

2.3 ctDNA對DBP熒光光譜影響

當熒光激發波長為254 nm 時，DBP在316 nm處有一個較強的熒光發射峰(圖3A)。隨著ctDNA的加入，DBP在316 nm的熒光強度顯著降低，表明ctDNA猝滅DBP的熒光，兩者發生了相互作用。

為了明確其猝滅機制，采用Stern-Volmer方程對熒光數據進行分析[9]：

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(3)

式中，F0和F分別為加入ctDNA前后DBP溶液的熒光強度;KSV為猝滅常數;Kq為雙分子猝滅過程的速率常數;[Q]為猝滅劑的濃度;τ0為沒有猝滅劑存在下的熒光分子平均壽命，約為10-8s[10]。

以F0/F對[Q]作圖(圖3B)，得到3個不同溫度下的猝滅常數值，見表1。隨著溫度的升高KSV的值逐漸減小，且猝滅速率常數Kq達到1012數量級，遠大于最大擴散碰撞猝滅速率常數(2.0×1010L·mol-1·s-1)，表明ctDNA對DBP的熒光猝滅為單一靜態猝滅過程。

此外，由修正的Stern-Volmer方程分析熒光數據[11]：

(4)

以F0/(F0-F)對1/[Q]作圖，獲得結合常數值Ka(表1)，Ka隨著溫度升高而降低，表明溫度升高復合物穩定性下降，這與靜態猝滅機制相符。

2.4 熱力學參數及作用力類型的確定

為進一步了解DBP與ctDNA反應熱力學過程，其熱力學參數可由Van’t Hoff 方程[12]求得，焓變ΔHΘ和熵變ΔSΘ分別為-14.03 kJ·mol-1和28.62 J·mol-1·K-1，表明該反應為放熱，疏水作用和氫鍵是結合作用的主要驅動力，且是一個自發過程[3,13]。

表1 三個溫度下的猝滅常數、結合常數及熱力學參數

Rais the correlation coefficient for theKSVvalues.Rbis the correlation coefficient for theKavalues.

2.5 ctDNA解鏈溫度及粘度測定

DNA的熔點(Tm)，即為DNA加熱發生解鏈失去一半螺旋結構時的溫度，也稱解鏈溫度。當小分子嵌插于DNA堿基對當中，DNA結構變得更加穩定，Tm則會明顯升高，而通過溝槽與靜電作用方式與DNA結合，Tm則不會有明顯變化[14]。圖4A顯示ctDNA與DBP-ctDNA復合物的Tm值沒有明顯的差異，表明DBP通過溝槽模式與ctDNA結合。

經典嵌插劑嵌入DNA堿基對會引起堿基對間距增大，導致雙螺旋松弛，長度變大，使得粘度明顯增大，而溝槽結合劑對DNA粘度無明顯影響[15]。圖4B顯示了DBP與小溝結合劑Hoechst33258一樣對于ctDNA粘度均無明顯影響，這是DBP與ctDNA通過溝槽模式結合的有力證據。

2.6 單、雙鏈ctDNA對DBP熒光猝滅

為探究DBP與ctDNA結合模式，采用雙鏈ctDNA(dsctDNA)與單鏈ctDNA(ssctDNA)分別對DBP進行熒光猝滅實驗。若小分子與ctDNA通過嵌插模式結合，dsctDNA更利于DBP的結合，其對DBP熒光猝滅的程度要強于要ssctDNA，而溝槽結合則相反[16]。圖5顯示，ssctDNA對DBP熒光的猝滅效應明顯強于dsctDNA，進一步表明DBP與ctDNA的溝槽結合方式。

2.7 結合位點

為測定DBP在ctDNA上的結合位點，實驗對加入DBP前后的ctDNA分別進行了紅外光譜掃描。B型DNA在紅外光譜中1 717 cm-1、1 660 cm-1、1 610 cm-1和1 490 cm-1處的特征峰，分別對應鳥于嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)的伸縮振動。而1 222 cm-1和1 088 cm-1的特征峰則為磷酸骨架的非對稱伸縮振動和對稱伸縮振動引起的[17]。隨著DBP比例的增大，T堿基和A堿基的峰位有明顯的移動，分別從1 667 cm-1移動到了1 659 cm-1，1 610 cm-1移動到1 600 cm-1，而其他各個特征峰均沒有出現移動(圖6)，表明DBP可能主要結合于ctDNA的A-T堿基富集區[18]。

2.8 ctDNA構象變化

B型構象的ctDNA 有兩個分別由右手螺旋結構和堿基堆積引起的特征峰，即245 nm處的負峰和280 nm處的正峰。隨著DBP濃度的增大，ctDNA負峰增強、正峰減弱(圖7)，表明B型ctDNA結構變得更為松散[19]。

2.9 DNA損傷檢測

采用瓊脂糖凝膠電泳實驗通過檢測DBP對pUC18質粒DNA可能的損傷。當環狀超螺旋DNA進行電泳時，可能出現3種形式，即Form Ⅰ(環狀)、Form Ⅱ(開環狀)和Form Ⅲ(線狀)，它們在凝膠中的遷移速率為Form Ⅰ>Form Ⅲ>Form Ⅱ[20]。電泳圖中并沒有出現除Form I外的其他條帶(圖8)，表明該濃度范圍內DBP沒有造成DNA明顯損傷。

2.10 DBP與ctDNA的分子對接

通過Autodock軟件對整個DNA模型范圍完成100次模擬對接后，形成了由15個構象能量簇構成的能量圖(圖9(A))。從能量角度考慮，選取能量圖中能量最低，次數最多的DBP與ctDNA結合狀態進行分析。圖9(B)顯示DBP與DNA的小溝富集區A-T堿基結合，且與DA5和DA6堿基形成了兩個氫鍵，分子模擬結果與紅外光譜實驗相一致，進一步確證了DBP與ctDNA溝槽結合模式。

3 結論

在模擬生理酸度(pH=7.4)條件下，聯合應用MCR-ALS法結合多種光譜學以及分子模擬技術，研究了DBP與ctDNA的相互作用。結果表明，DBP能與ctDNA發生相互作用形成DBP-ctDNA復合物。ctDNA通過單一的靜態方式猝滅DBP的內源熒光，疏水作用和氫鍵是兩者作用的主要驅動力。DBP與ctDNA通過溝槽方式結合，且DBP主要作用于A-T堿基富集區，這種作用誘導B型ctDNA結構變得更為松散，但未對質粒DNA產生明顯損傷。研究結果為理解DBP與DNA的相互作用機制和DBP毒理效應提供了有益的信息。