鉀離子影響下凝血酶適配子在氧化石墨烯表面吸附行為的研究

陳 章，陳國梁，李志賢

(1.湖南科技大學煤炭資源清潔利用與礦山環境保護湖南省重點實驗室，湖南湘潭 411201；2.湖南大學化學化工學院，湖南長沙 410082)

K+是生物細胞中含量豐富、作用重要的陽離子之一，因此，開發新型生物傳感器以實現生物細胞中K+的特異性、高靈敏檢測對于監測細胞生理功能非常重要[1 - 3]。研究發現，凝血酶適配子可以與K+結合形成鳥嘌呤四堿基體結構(又稱G-四聚體)[4 - 7]，利用凝血酶適配子的此類特性可以構建檢測K+的生物傳感器。

氧化石墨烯(GO)作為新型納米材料，因其獨特的物理、化學性質在生物傳感器領域具有重要應用前景[8 - 10]。利用核酸適配子可通過π-π相互作用、疏水作用等分子間相互作用力吸附到氧化石墨烯表面的特性，結合氧化石墨烯猝滅熒光基團熒光的性質，構建基于適配子和氧化石墨烯的生物傳感器被廣泛用于檢測核酸、蛋白、生物小分子等目標物[11 - 14]。然而，基于凝血酶適配子和氧化石墨烯構建的生物傳感器較少被用于檢測K+[15]。其中一個重要原因是K+與凝血酶適配子結合形成G-四聚體后，在K+屏蔽G-四聚體與氧化石墨烯表面的靜電斥力作用下，G-四聚體重新吸附到氧化石墨烯表面，從而降低K+檢測的靈敏度。因此，探討K+條件下，凝血酶適配子形成G-四聚體在氧化石墨烯表面的吸附行為，對于提高此類型生物傳感器的檢測靈敏度具有非常重要的意義，同時對于研究K+影響下富含鳥嘌呤的適配子在氧化石墨烯表面的吸附行為具有重要借鑒意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氧化石墨烯(GO)使用JEM3010型透射電子顯微鏡(TEM)(日本，電子公司)表征。熒光強度使用PE-LS55型熒光分光光度計(Perkin Elmer,Inc)記錄，激發波長為480 nm，激發和發射狹縫10 nm，掃描速度為1 500 nm/s。所有操作均在室溫條件下進行。

5′FAM-GGT TGG TGT GGT TGG 3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。石墨粉購自Sigma-Aldrich公司。Tris、KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2等試劑均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2 氧化石墨烯的制備

氧化石墨烯的制備方法參照Hummers法[16]，制備的氧化石墨烯使用超純水溶解，超聲2 h，最終氧化石墨烯的濃度為0.5 g/L。

1.3 不同濃度氧化石墨烯對適配子熒光強度的影響

5 mmol/L Tris緩沖溶液(pH=7.2，含100 nmol/L FAM標記的適配子)中加入不同濃度的氧化石墨烯，反應30 min，熒光檢測。

1.4 K+對適配子在氧化石墨烯表面吸附行為的影響

Tris緩沖溶液中加入氧化石墨烯，最終氧化石墨烯的濃度為35 μg/L，5 min后，加入不同濃度K+，每間隔2 min檢測一次熒光，持續30 min。Tris緩沖溶液中加入氧化石墨烯，最終氧化石墨烯的濃度為35 μg/L或者70 μg/L，5 min后加入不同濃度K+，反應30 min，熒光檢測。

1.5 不同離子對氧化石墨烯猝滅適配子熒光效率的影響

Tris緩沖溶液中加入氧化石墨烯，最終氧化石墨烯濃度為70 μg/L，5 min后加入不同濃度K+、Na+、Ca2+或者Mg2+，反應30 min，熒光檢測。

2 結果與討論

2.1 不同濃度的氧化石墨烯對適配子熒光強度的影響

研究采用Hummers法成功制備了氧化石墨烯，圖1為制備的氧化石墨烯的透射電子顯微鏡(TEM)表征圖。已有研究證實基于氧化石墨烯優良的單鏈核酸吸附能力和熒光猝滅能力所構建的生物傳感器，主要借助熒光分析手段對目標物進行檢測[17,18]，因此本研究借助熒光分析手段探討凝血酶適配子在氧化石墨烯表面的吸附行為。如圖2所示，氧化石墨烯濃度越大，FAM標記的適配子熒光強度越小，說明氧化石墨烯濃度越大對適配子熒光猝滅能力越強。同時研究發現較低濃度的氧化石墨烯對適配子熒光猝滅能力有限。為了排除高濃度氧化石墨烯對適配子熒光影響的因素，本實驗過程選用較低濃度的氧化石墨烯(例如35 μg/L或者70 μg/L)。

2.2 K+對適配子在氧化石墨烯表面吸附行為的影響

如圖3所示，0 mmol/L K+時，隨著反應時間的增加，熒光檢測信號變化不明顯；隨著K+的加入，熒光檢測信號增加，伴隨反應時間的延長，熒光檢測信號逐漸減小。實驗結果表明，當不存在K+時，適配子短時間內在氧化石墨烯表面達到吸附平衡；伴隨K+的加入，適配子形成G-四聚體結構從氧化石墨烯表面解吸，熒光檢測信號增強，隨著反應時間的延長，K+屏蔽G-四聚體與氧化石墨烯之間的靜電斥力，適配子重新吸附到氧化石墨烯表面，熒光檢測信號減小。研究結果說明適配子形成G-四聚體脫離氧化石墨烯表面后，重新吸附到氧化石墨烯表面需要一定反應時間。研究結果暗示較長反應時間將影響此類型生物傳感器檢測K+的靈敏度。

研究發現隨著K+濃度的增加，熒光強度逐漸減小。雖然高濃度K+有利于G-四聚體形成，但是高濃度的K+更有利于屏蔽G-四聚體與氧化石墨烯之間的靜電斥力，G-四聚體與氧化石墨烯結合更緊密，熒光強度反而更小。見圖4。

研究說明，不存在K+時，以單鏈形式存在的適配子通過π-π相互作用、疏水作用等分子間作用力結合到氧化石墨烯表面；伴隨K+的加入，適配子形成剛性結構的G-四聚體，帶負電的核酸鏈與氧化石墨烯表面的負電荷形成靜電斥力，適配子從氧化石墨烯表面解吸附，熒光得到恢復；隨著K+濃度的增加，高濃度的K+屏蔽部分G-四鏈體與氧化石墨烯表面的靜電排斥力，G-四聚體重新吸附到氧化石墨烯表面，熒光強度減小，其示意圖見圖5。

如圖6所示，研究證實相同濃度氧化石墨烯條件下，隨著K+濃度從5 mmol/L增加到20 mmol/L，熒光猝滅效率逐漸增強；相同濃度K+條件下，70 μg/L 氧化石墨烯帶來更高熒光猝滅效率。研究結果說明雖然高濃度K+有利于適配子形成G-四聚體，但是其屏蔽G-四聚體與氧化石墨烯之間的靜電斥力效果更顯著，熒光猝滅效率反而更高。比較5 mmol/L K+條件下，35 μg/L 和70 μg/L 氧化石墨烯熒光猝滅效率發現，35 μg/L 氧化石墨烯未引起熒光猝滅，70 μg/L 氧化石墨烯具有顯著熒光猝滅效應，研究結果揭示在低濃度K+和氧化石墨烯條件下，凝血酶適配子形成G-四聚體脫離氧化石墨烯表面的趨勢強于其重新吸附到氧化石墨烯表面的趨勢。研究表明為避免脫離氧化石墨烯表面的G-四聚體重新吸附到氧化石墨烯表面，提高K+檢測靈敏度，需充分考慮實驗過程中氧化石墨烯濃度和K+檢測范圍。

2.3 不同離子影響氧化石墨烯吸附適配子研究

如圖7所示，Na+影響下，熒光強度仍有降低，但弱于K+對氧化石墨烯熒光猝滅能力的影響。K+幫助凝血酶適配子形成剛性G-四聚體結構，G-四聚體暴露在外的堿基上的正電荷與氧化石墨烯表面的負電荷的作用加上堿基的芳香環與氧化石墨烯間的疏水作用，同時結合K+屏蔽G-四聚體與氧化石墨烯之間的靜電斥力作用，G-四聚體將重新吸附到氧化石墨烯表面，適配子熒光強度降低。Na+雖然與凝血酶適配子有一定結合能力，但結合能力弱于K+[19]，此時凝血酶適配子主要以自由卷曲的單鏈形式存在。Na+增強氧化石墨烯猝滅核酸熒光能力，主要是因為帶正電的Na+屏蔽氧化石墨烯和單鏈核酸之間的靜電斥力，成為單鏈核酸和氧化石墨烯之間橋梁，幫助以單鏈形式存在的適配子更加緊密的吸附到氧化石墨烯表面[20]。

此外，我們比較了50 mmol/L K+、Na+、Ca2+、Mg2+條件下，氧化石墨烯猝滅適配子的熒光效率。如圖8，50 mmol/L Ca2+、Mg2+條件下氧化石墨烯猝滅熒光能力最強，其主要原因是相同濃度的二價離子攜帶更多正電荷，屏蔽氧化石墨烯和單鏈核酸之間的靜電斥力能力更有效，以單鏈形式存在的適配子結合氧化石墨烯更緊密。研究結果說明，構建以凝血酶適配子和氧化石墨烯為基礎的K+檢測生物傳感器，不能忽視檢測體系中離子種類和離子濃度對檢測特異性和檢測靈敏度的影響。

3 結論

本研究證實K+條件下，凝血酶核酸適配子與K+結合形成G-四聚體，G-四聚體脫離氧化石墨烯表面，使適配子熒光得到恢復。隨著K+濃度的增加，K+屏蔽G-四聚體與氧化石墨烯之間的靜電斥力，導致G-四聚體重新吸附到氧化石墨烯表面，熒光被猝滅；K+和氧化石墨烯濃度越高，G-四聚體重新吸附到氧化石墨烯表面趨勢越強。研究結果說明，提高以凝血酶適配子和氧化石墨烯為基礎的K+檢測生物傳感器的檢測靈敏度和特異性，需要充分考慮檢測體系中氧化石墨烯濃度，K+檢測范圍和檢測體系中其它共存離子種類和濃度的影響，同時還應合理設定反應時間。本研究希望通過探討K+影響下，凝血酶適配子在氧化石墨烯表面吸附-解吸-再吸附作用特點，為優化設計基于核酸和氧化石墨烯的生物傳感器提供研究參考，為研究K+影響下富含鳥嘌呤的適配子在氧化石墨烯表面的吸附行為提供借鑒。