BrMC對腫瘤相關巨噬細胞條件培養基誘導內皮細胞管結構形成的影響

孫姝雯，崔迎紅，鄒 輝，鄭 郁，任凱群，宋振威，全梅芳，李 朵，曹建國

（湖南師范大學醫學院藥學系，長沙 410013）

BrMC對腫瘤相關巨噬細胞條件培養基誘導內皮細胞管結構形成的影響

孫姝雯，崔迎紅，鄒 輝，鄭 郁，任凱群，宋振威，全梅芳，李 朵，曹建國

（湖南師范大學醫學院藥學系，長沙 410013）

目的：研究8-溴-7-甲氧基白楊素（BrMC）對肝癌干樣細胞活化的THP-1源性腫瘤相關巨噬細胞條件培養基誘導人臍靜脈內皮HUVEC-12細胞系細胞管結構形成的作用。方法：存在或缺失BrMC處理的SMMC-7721細胞系肝癌干樣細胞條件培養基孵育THP-1源性巨噬細胞。細胞免疫熒光檢測CD68和CD163表達。ELISA檢測IL-10和IL-12濃度。內皮管結構形成試驗測定相應處理的腫瘤相關巨噬細胞條件培養基對HUVEC-12細胞管結構形成的影響。結果：腫瘤相關巨噬細胞CD163高水平表達，細胞因子分泌譜為IL-10high/IL-12low。BrMC降低肝癌干樣細胞活化的腫瘤相關巨噬細胞條件培養基VEGF濃度，抑制其誘導HUVEC-12細胞管結構形成作用。結論：BrMC逆轉肝癌干樣細胞活化的腫瘤相關巨噬細胞條件培養基誘導HUVEC-12細胞管結構形成，其機制涉及減少VEGF分泌。

肝癌干樣細胞；腫瘤相關巨噬細胞；8-溴-7-甲氧基白楊素；內皮管結構；VEGF

腫瘤新生血管形成為惡性腫瘤生長提供必需的營養物質和氧，是腫瘤侵襲和轉移的重要原因之一［1］。腫瘤干細胞招募并重編程單核細胞源性巨噬細胞是促進腫瘤血管生成的重要因素［2］。抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤生長和轉移所依賴的營養物質和氧來源以及轉移途徑已經成為當前治療腫瘤的重要策略之一［3］。我們最近的研究已經證實8-溴-7-甲氧基白楊素（8-bromo-7-methoxychrysin，BrMC）顯著抑制肝癌干細胞侵襲能力［4］。本文研究BrMC對肝癌干樣細胞活化的THP-1源性腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAMs）誘導人臍靜脈內皮HUVEC-12細胞系細胞管結構形成的調控作用。

1 資料與方法

1.1 細胞與試劑 人肝癌SMMC-7721細胞系、人單核細胞THP-1細胞系、人臍靜脈內皮HUVEC-12細胞系細胞均購自中國科學院細胞庫（中國上海市），由湖南師范大學醫藥學實驗中心保存，SMMC-7721維持于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，THP-1和HUVEC-12均用含10%胎牛血清的1640培養基培養，細胞置37℃、5% CO2的培養箱中培養。8-溴-7-甲氧基白楊素（BrMC）依據文獻［5］合成，經高效液相色譜測定純度大于95%。用二甲基亞砜稀釋為10mmol/L，臨用前稀釋至所需濃度。IL-10、 IL-12和VEGF的ELISA試劑盒均購自欣博盛公司（中國深圳市）。

1.2 肝癌干樣細胞條件培養基的收集

1.2.1 人肝細胞癌SMMC-7721細胞系干樣細胞培養與擴增 參照文獻［4］描述的方法，采用干細胞培養基超低粘附板懸浮培養法得到人肝細胞癌SMMC-7721細胞系球形成細胞。取第3代球形成細胞作為肝癌干樣細胞用于后續實驗。

1.2.2 BrMC處理的人肝癌SMMC-7721細胞系干樣細胞條件培養基的制備 取肝癌干樣細胞，5000個/ mL接種于3塊超低粘附6孔板，每孔2.0 mL。分別加入終濃度為0、5、10、20 μmol/L BrMC。收集細胞培養基，0.22μm孔徑的濾器過濾，即獲取BrMC處理的肝癌干樣細胞條件培養基（BrMC/ LCSLC-CM）。

1.3 THP-1源性腫瘤相關巨噬細胞的制備 取計數后的人單核細胞THP-1細胞系細胞，調節細胞密度2×105/ mL，接種于6孔板中，每孔加入2 mL含10% FBS的RPMI1640培養基。加入PMA（終濃度為100 ng/ mL），培養48h，細胞呈單層貼壁生長，即獲取THP-1源性巨噬細胞，PBS洗滌3次，換為新鮮無血清培養基，加入IFN-γ（50ng/ mL）+ LPS（1μg/ mL）繼續培養24 h，即可獲得M1型THP-1巨噬細胞。更換為肝癌干樣細胞培養基（LCSLC-CM）處理24 h，得到THP-1源性腫瘤相關巨噬細胞。

1.4 細胞免疫熒光 取M1型THP-1巨噬細胞和腫瘤相關巨噬細胞，PBS洗滌3次，加入4% 多聚甲醛固定10 min。PBS洗滌3次，0.1% Triton X-100-PBS透化10 min。PBS洗滌3次，2% BSA于37℃孵育30 min。PBS洗滌3次，加入CD68（1：200稀釋，santa cruz biotechnology）和CD163（1：200稀釋，santa cruz biotechnology），4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，熒光標記二抗37℃下孵育60 min。PBS洗滌3次，hochest33258染核，熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.5 ELISA檢測 IL-10、IL-12和VEGF的ELISA檢測根據供應商的說明書進行，依據標準品工作曲線獲得培養基樣品中IL-10、 IL-12和VEGF濃度（單位為pg/ mL）。

1.6 內皮管結構形成試驗 LCSLC-CM或BrMC/ LCSLC-CM孵育M1型THP-1源巨噬細胞24 h，收集BrMC/腫瘤相關巨噬細胞培養基，同時取M1型THP-1源巨噬細胞培養基作為對照，0.22μm孔徑的濾器過濾用于內皮管結構形成實驗。首先將24孔細胞培養板（平底）和200 μL tip頭置冰箱預冷過夜。4℃下融化matrigel基質膠。24孔板冰上加入基質膠，每孔200 μL，放置5分鐘，待其鋪平培養板底后放入培養箱30 min，待基質膠凝固后取出。取人臍靜脈內皮HUVEC-12細胞系細胞，調整細胞密度為1×105/ mL，離心后棄上清，用M1型THP-1巨噬細胞條件培養基或肝癌相關巨噬細胞條件培養基重懸后接種于matrigel基質膠鋪底的24孔細胞培養板中，37℃，5%CO2飽和濕度培養12 h，4% 多聚甲醛固定并拍攝照片，計數完整的管結構數。管結構形成效率按照以下公式計算：管結構形成率（%）=各相應處理組管結構均數/完全培養基處理組管結構均數×100%。以上實驗重復2次。

1.7 統計學分析 各組實驗數據錄入Spss 15.0 for windows evaluation 軟件建立數據庫，數據用均數±標準差（Mean±SD）表示。采用One Way ANOVA方差分析；首先進行方差齊性檢驗，在方差齊性時，多組均數比較采用LSD法；在方差不齊時，多組均數間比較采用Tukey's檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤相關巨噬細胞的表征 細胞免疫熒光結果顯示，M1型THP-1巨噬細胞和腫瘤相關巨噬細胞均表達巨噬細胞標志物CD68，然而，相比于M1型THP-1巨噬細胞，腫瘤相關巨噬細胞高表達M2型巨噬細胞標志物CD163（圖1A）。此外，ELISA檢測顯示，腫瘤相關巨噬細胞高分泌IL-10而低分泌IL-12，而M1型THP-1巨噬細胞培養基呈IL-10low/IL-12high（圖1B），進一步證實腫瘤相關巨噬細胞具有M2表型。

A，M1型巨噬細胞與腫瘤相關巨噬細胞表面標志物的免疫熒光顯微圖像（×20），兩者同時表達CD68，但腫瘤相關巨噬細胞高表達CD163。B，M1型巨噬細胞與腫瘤相關巨噬細胞（TAM）培養基IL-10和IL-12的含量，腫瘤相關巨噬細胞（TAM）顯示IL-10high/IL-12low。

2.2 BrMC對肝癌干樣細胞活化的腫瘤相關巨噬細胞條件培養基誘導人臍靜脈內皮HUVEC-12細胞管結構形成的影響 內皮管結構形成實驗結果證明：BrMC呈濃度依賴拮抗肝癌干樣細胞活化的腫瘤相關巨噬細胞條件培養基誘導人臍靜脈內皮HUVEC-12細胞系細胞管結構形成作用（圖2）。

圖1 腫瘤相關巨噬細胞表現M2型巨噬細胞特性

圖2 BrMC抑制肝癌干樣細胞活化的腫瘤相關巨噬細胞條件培養基誘導HUVEC-12細胞系細胞管結構形成

2.3 BrMC對肝癌干樣細胞活化的腫瘤相關巨噬細胞VEGF分泌的影響 ELISA檢測細胞培養基中VEGF的含量，結果顯示，相比與M1型THP-1源巨噬細胞，腫瘤相關巨噬細胞培養基中VEGF增加（圖3A），BrMC能有效地降低肝癌干樣細胞活化的腫瘤相關巨噬細胞培養基VEGF含量，呈濃度依賴性（圖3B）。

圖3.BrMC抑制肝癌干樣細胞活化的腫瘤相關巨噬細胞VEGF分泌A，M1型巨噬細胞與腫瘤相關巨噬細胞培養基VEGF含量的比較。

3 討論

組織浸潤單核細胞源性巨噬細胞在不同的環境因素誘導下，可極化為不同亞型，包括經典活化（M1）型和替代活化（M2）型。腫瘤微環境中存在的巨噬細胞已經定義為腫瘤相關巨噬細胞（TAMs），趨向于M2亞型特征。研究表明，TAMs在腫瘤進展中發揮至關重要的作用，促進腫瘤細胞增殖、血管生成、轉移、侵襲、上調腫瘤干細胞相關基因［6］。M1型巨噬細胞表達高水平致炎因子（IL-1、TNF-α、IL-6、IL-12 和 IL-23），而M2型巨噬細胞通常表達抗炎細胞因子如IL-10和高表達清道夫、甘露糖和半乳糖受體為特征［7］。腫瘤微環境中招募的單核細胞源性巨噬細胞是腫瘤間質中的重要免疫調節細胞，在腫瘤微環境中參與和促成非可控性炎癥［8］。本文的實驗結果表明，SMMC-7721細胞系球形成細胞（肝癌干樣細胞）活化的THP-1源性巨噬細胞（腫瘤相關巨噬細胞）高水平表達CD163蛋白，高分泌IL-10而低分泌IL-12；這些結果說明，肝癌干樣細胞活化的腫瘤相關巨噬細胞呈M2表型。

腫瘤干細胞是構成腫瘤異質細胞中小部分細胞亞群，其與正常干細胞具有相似的特點如自我更新和多向分化潛能，因而，具有在免疫缺陷小鼠體內重構異質性腫瘤的能力等［9］，其干細胞特性是腫瘤轉移和復發等不良預后的最危險因素。此外，腫瘤新生血管形成亦是腫瘤侵襲和轉移的重要原因之一。已有研究發現：在腫瘤血管內皮細胞與正常內皮細胞之間存在高達1000個以上的差異表達基因，包括成纖維細胞生長因子受體，基質金屬蛋白酶（MMPs），NF-κB靶基因等［1，10］。在本文中，我們研究發現：SMMC-7721細胞系球形成細胞（肝癌干樣細胞）活化的THP-1源性巨噬細胞（腫瘤相關巨噬細胞）VEGF分泌增加。

大量的研究證實，植物源性黃酮類化合物可能通過抑制內皮細胞增殖［11］或調控血管生成相關因子如VEGF［12］合成和分泌抑制腫瘤血管生成。我們之前的研究證實：BrMC相對選擇性抑制肝癌干細胞的增殖、自我更新、上皮-間充質轉化和侵襲［4，13］。在本文的研究中，我們證實新型白楊素類似物8-溴-7-甲氧基白楊素通過抑制SMMC-7721細胞系球形成細胞（肝癌干樣細胞）活化的THP-1源性巨噬細胞（腫瘤相關巨噬細胞）VEGF分泌抑制內皮管結構形成。這些研究結果首次凸顯了BrMC通過靶向作用于肝癌干樣細胞與巨噬細胞交互作用，調控腫瘤微環境產生抗肝細胞癌作用的藥效學特性。

［1］ Bhati R， Patterson C， Livasy C A， et al. Molecular characterization of human breast tumor vascular cells ［J］. Am J Pathol， 2008， 172（5）：1381-1390.

［2］ Riabov V， Gudima A， Wang N， et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis ［J］. Front Physiol，2014， 5： 75.

［3］ 呂祥， 馮彥軍， 夏英，等. 淫羊藿素抑制人臍靜脈內皮細胞血管生成及其機制 ［J］. 世界中醫藥， 2014， 01： 71-75.

［4］ Quan MF， Xiao LH， Liu ZH， et al. 8-bromo-7-methoxychrysin inhibits properties of liver cancer stem cells via downregulation of beta-catenin ［J］. World J Gastroenterol， 2013， 19（43）： 7680-7695.

［5］ Zheng X， Meng W D， Xu Y Y， et al. Synthesis and anticancer effect of chrysin derivatives ［J］. Bioorg Med Chem lett， 2003， 13（5）： 881-884.

［6］ Biswas SK， Allavena P， Mantovani A. Tumor-associated macrophages：functional diversity， clinical significance， and open questions ［J］. Se mina Immunopathol， 2013， 35（5）： 585-600.

［7］ Allavena P， Sica A， Solinas G， et al. The inflammatory micro-environment in tumor progression： the role of tumor-associated macrophages ［J］. Criti Rev Oncolo Hematol， 2008， 66（1）： 1-9.

［8］ Yang T， Zhang X， Wang M， et al. Activation of mesenchymal stem cells by macrophages prompts human gastric cancer growth through NF-kappaB pathway ［J］. PloS one， 2014， 9（5）： e97569.

［9］ Su YC， Li SC， Wu YC， et al. Resveratrol downregulates interleukin-6-stimulated sonic hedgehog signaling in human acute myeloid leukemia ［J］. Evid Based Complement Alternat Med， 2013， 2013： 547430.

［10］ Ferrara N. VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors ［J］. Nat Revi Cancer， 2002， 2（10）： 795-803.

［11］ Grimm D， Bauer J， Schoenberger J. Blockade of neoangiogenesis， a new and promising technique to control the growth of malignant tumors and their metastases ［J］. Curr Vasc Pharmacol， 2009， 7（3）： 347-357.

［12］ Yang X， Wu XZ. Main Anti-tumor Angiogenesis Agents Isolated From Chinese Herbal Medicines ［J］. Mini Revi Medi Chem， 2015， 15（12）：1011-1023.

［13］ Ren KQ， Cao XZ， Liu ZH， et al. 8-bromo-5-hydroxy-7-methoxychrysin targeting for inhibition of the properties of liver cancer stem cells by modulation of Twist signaling ［J］. Int J Oncol， 2013， 43（5）： 1719-1729.

Effects of 8-bromo-7-methoxychrysin on angiogenesis of endothelial cells induced by tumorassociated macrophages

Sun Shu-wen， Cui Ying-hong， Zou Hui， Zheng Yu， Ren Kai-qun， Song Zhen-wei，Quan Mei-fang， Li Duo， Cao Jian-guo
（Department of Pharmaceutical Science， Medical College， Hunan Normal University， Changsha 410013， China ）

Objective To investigate whether 8-bromo-7-methoxychrysin （BrMC） has an effect on angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells induced by tumor-associated macrophages conditioned medium activated by liver cancer stemlike cell. Methods THP-1-drived macrophages incubated with SMMC-7721 liver cancer stem-like conditioned medium treated with or without BrMC. CD68 and CD163 protein expression was deter mined by cell immunofluorescence. IL-10 and IL-12 concentration was detected by ELISA assay. The effect of tumor-associated macrophage conditioned medium on HUVEC-12 endothelial cell tube formation was investigated. Results High level expression of CD163 in tumor-associated macrophages and its cytokine spectrum showed IL-10high/IL-12low. BrMC reduces VEGF in tumor-associated macrophage medium activated by liver cancer stem-like cells， and inhibit HUVEC-12 endothelial cell tube formation. Conclusion BrMC reverses HUVEC-12 endothelial cell tube formation reduced by tumor-associated macrophage-conditioned medium activated by liver cancer stemlike conditioned medium， which is involved in decrease VEGF secretion.

liver cancer stem-like cells； tumor-associated macrophages；8-bromo-7-methoxychrysin； endothelial cell tube formation； VEGF

R735.35

A

1673-016X（2016）02-0001-04

2016-01-10

國家自然科學基金面上項目（No 81172375）；國家自然科學青年基金項目（No 30760248）

曹建國，E-mail：caojianguo2005@126.com