攜帶重組腺病毒 BMP-2 的巨噬細胞對 C3H10 細胞成骨分化的影響

周少懷，杜謝琴，金 靜，卞 峰，方紅育

（武漢市第三醫院，武漢 430060）

攜帶重組腺病毒 BMP-2 的巨噬細胞對 C3H10 細胞成骨分化的影響

周少懷，杜謝琴，金 靜，卞 峰，方紅育

（武漢市第三醫院，武漢 430060）

目的：探討攜帶BMP-2（Bone Morphogenetic protine-2）腺病毒的巨噬細胞對小鼠 C3H10 細胞的增殖和成骨分化的作用。方法：感染重組腺病毒 BMP-2的巨噬細胞與小鼠C3H10 細胞共培養。MTT 方法檢測共培養體系中 C3H10 細胞的增殖能力；共培養 7 d 對C3H10細胞進行 ALP 染色和活性檢測；細胞培養至 21 d，進行標茜素紅染色檢測礦化結節；定量PCR實驗驗證過表達腺病毒載體 BMP-2 有效性并且檢測Runx2的表達；Western blot檢測細胞中磷酸化 Smad1/5/8蛋白表達。結果：與對照組相比，巨細胞過表達BMP-2與 C3H10細胞共培養后，可以促進C3H10細胞增殖；ALP 染色程度和活性上升；礦化結節增多；定量 PCR結果顯示 Ruxn2 RNA表達增加，Western blot 結果顯示 Ruxn2 蛋白表達上升。結論：過表達 BMP-2 的巨噬細胞可以促進小鼠 C3H10 細胞的增殖，并且可能通過 BMPs 經典途徑促進 C3H10 細胞的成骨分化。

成骨分化；巨噬細胞；BMP-2

骨折發生后，骨結構和血供破壞，單核細胞侵入受損組織分化為巨噬細胞［1］，巨噬細胞分泌像轉化生長因子、腫瘤壞死因子、成纖維生長因子等因子，這些因子募集骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），促進其增殖、分化，并且合成胞外基質蛋白促進骨折愈合［2］。另外巨噬細胞可以通過影響鈣化的血管細胞促進血管鈣化［3］。越來越多的證據顯示，巨噬細胞可以分泌骨形態發生蛋白-2（BMP-2）參與到體內的多重病理生理過程［4］。最近一些研究開始關注到骨折中巨噬細胞的多重作用［5］。研究發現巨噬細胞既可以調節破骨細胞活性，又能促進成骨分化。

BMP-2 是轉化生長因子超家族成員之一［6］，是一種多功能生長因子，對胚胎骨形成及出生后骨生長有重要作用［7-9］。BMP-2 因為具有很強的成骨分化能力，所以已經被批準用于臨床治療骨折、骨質疏松等疾病引起的大面積骨缺損的修復［10］。BMP-2 主要通過激活Smads 信號傳導和調節成骨基因轉錄而發揮作用［11］。

本實驗旨在探討在巨噬細胞中過表達 BMP-2 然后與 C3H10 細胞共培養，檢測共培養體系中 C3H10 細胞的增殖和分化能力。

1 資料與方法

1.1 材料 小鼠 C3H10 細胞購于美國菌種保藏中心，小鼠巨噬細從 C57 小鼠腹腔分離。重組腺病毒Ad-RFP 和Ad-BMP-2 由本實驗室構建保存。 DMEM高糖培養基和胎牛血清（Hylcone公司）；Transwell 小室（Millipore公司）。 PCR逆轉錄試劑、定量PCR試劑（TakaRa公司）；PCR引物和TRZIOL（Invitrogen公司）；堿性磷酸酶（ALP）活性檢測試劑盒（Sigma 公司）；抗 Runx2（Runt related transcription factor 2）抗體（Abcam公司）及內參β-actin抗體（中杉金橋）；Western blot 發光試劑盒（北京英格恩公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠巨噬細胞分離及病毒感染 C57 小鼠脫臼處死后，腹部消毒。用注射器抽取5 mL含雙抗的DMEM高糖培養基注入腹腔，用綿球輕揉腹部1-2 min，解剖小鼠，用吸管吸取細胞懸液，移入離心管中離心，并重復洗滌 3 次，鋪板。在37 °C、5 % CO2的飽和濕度培養箱中培養 6 h，去除非粘附細胞。消化細胞后以 2×106/ mL密度接種細胞，待細胞貼壁后，加入合適濃度重組腺病毒，10 h 后，消化細胞，接種于 Tranwell 小室。

1.2.2 共培養體系的建立 小鼠 C3H10 細胞培養于含有100 U/ mL 青霉素、100 μg / mL鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM高糖培養基。C3H10 細胞按2.0×105個/孔的密度接種于6 孔板，待細胞融合度達60% 時，將接種了巨噬細胞的 Transwell 小室置于 6 孔板上，開始共培養。24 孔板的共培養體系以此類推。

1.2.3 實驗分組 實驗組分為空白組（Blank）、對照組（Ad-RFP）、過表達BMP-2（Ad-BMP-2）組。 病毒感染效率在 50% 左右適宜。

1.2.4 MTT 檢測細胞增殖能力 將共培養后 1-5 d 的 C3H10 細胞加入 500 μL MTT（5 mg/ mL），放入孵箱繼續培養 4 h，小心吸棄孔內培養基，每孔加入 4 mL DMSO 溶液，避光震蕩 10 min。將溶液轉移到 96 孔板（200 μL/孔），于 490 nm 處檢測吸光度 OD 值。

1.2.5 ALP 活性和染色測定 24孔板接種 30% 密度的 C3H10 細胞進行共培養。分別培養至第第 7 d，按照ALP 測定試劑盒說明書進行檢測。

1.2.6 茜素紅染色 按 1.2.5 所述接種細胞，進行共培養，下層培養基換為成骨誘導培養基（50 μM 維生素 C，10 mm β-磷酸甘油和100 nm地塞米松）。21 d 后取出細胞，吸棄培養基，PBS 洗滌 3 次，0.1 % 戊二醛固定10 min，ddH2O洗滌 3 次；吸棄去ddH2O，加入 0.4% 茜素紅S，在顯微鏡下觀察，待出現紅色物質堆積時，棄去孔內染液，ddH2O 終止反應和洗滌，顯微鏡下拍照保存。

1.2.7 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）實驗 各組細胞使用TRIZOL提取RNA，然后逆轉錄成cDNA。定量PCR 反應體系如下：cDNA 2 μL，上下游引物各0.4 μL，SYBR Premix Ex Taq 10 μL，ddH2O 6.4 μL，Total 20 μL。

1.2.8 Western blot 實驗 共培養 5 d 后的 C3H10 細胞裂解后使用 10% SDS-PAGE 膠進行凝膠電泳。電泳完成后，將目標蛋白轉膜至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉 1 h，用1：1000 稀釋 p-Smad1/2/8 和 β-actin抗體4℃ 封閉過夜。TBST 洗膜 3 次，每次 3 min，1：5000的二抗 37℃ 孵育 1 h。TBST 再次洗膜 3 次，發光顯影。

1.2.9 統計學 統計學處理數據用均數±標準差表示，統計學數據均用SPSS16.0軟件包處理，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 驗證病毒有效性 巨噬細胞感染腺病毒 36 h 后，提取細胞總 RNA。qRT-PCR 結果顯示，與 Ad-RFP 組相比，Ad-BMP-2 組 BMP-2 的 RNA 升高了約 10 倍左右（P＜0.01）（圖 1）。說明過表達 BMP-2 腺病毒可以用于后續實驗。

圖 1 BMP-2 mRNA 在各組細胞間的表達。**P＜0.01。

2.2 過表達 BMP-2 的巨噬細胞促進 C3H10 細胞增殖

MTT 結果顯示，C3H10 細胞與感染了過表達 BMP-2腺病毒的巨噬細胞共培養后，從第 3 d 起，C3H10 細胞增殖明顯比對照組增快，一直持續到第 5 d 到達一個平臺期（P＜0.05）（圖 2）。

圖 2 過表達 BMP-2 的巨噬細胞促進 C3H10 細胞增殖。*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 過表達BMP-2 的巨噬細胞促進 C3H10 細胞ALP 活性 C3H10 細胞與巨噬細胞共培養 7 d 后，利用 ALP 染色和活性檢測 C3H10 細胞的一個成骨分化指標。結果顯示，Ad-BMP-2 組的 ALP 活性比對照組明顯升高（P＜0.01）（圖 3 a）?；瘜W染色結果也顯示，Ad-BMP-2 組 ALP 染色加深（圖 3 b）。說明過表達 BMP-2的巨噬細胞能夠增強 C3H10 細胞的 ALP 活性。

圖 3 過表達 BMP-2 的巨噬細胞促進 C3H10 細胞的 ALP 活性.**P＜0.01。

2.4 過表達 BMP-2 的巨噬細胞促進 C3H10 細胞礦化

C3H10 細胞共培養至 21 d 進行茜素紅染色。結果表明，相比對照組，Ad-BMP-2 組礦化結節顯著升高（圖4）。說明在巨噬細胞中過表達 BMP-2 后與 C3H10 細胞共培養，可以促進 C3H10 細胞的鈣鹽沉積。

2.5 過表達 BMP-2 的巨噬細胞促進 C3H10 細胞成骨分化基因表達 共培養的 C3H10 細胞分別提取總 RNA和總蛋白。qRT-PCR 結果顯示，Ad-BMP-2 組 Runx2 mRNA 表達明顯上升（圖 5 a）。Western blot 也顯示 Ad-BMP-2 組 Runx2 蛋白表達升高（圖 5 b）（P＜0.05）。

圖 4 過表達 BMP-2 的巨噬細胞促進 C3H10 細胞的鈣鹽沉積

圖5 過表達 BMP-2 的巨噬細胞促進 C3H10 細胞 Runx2 mRNA 和蛋白表達。*P＜0.05。

3 討論

研究骨損傷和損傷后骨重建對于骨組織工程來說是非常重要的［12］。它可以幫助研究者設計更為合理的組織工程微環境；也可以幫助臨床醫生預測患者預后，制定更好的治療策略。

骨損傷后，單核細胞被招募到受損組織分化為巨噬細胞，從而分泌多種因子，參與到骨重建過程當中［13］。BMP-2 就是這些因子中的一個［14］。而 BMP-2是當今研究最為透徹，也是成骨能力最強的 BMPs 家族成員。BMP-2 具有強大的成骨作用，所以它已經被開發用于臨床治療骨缺損骨不愈合［15］。但是具體機制卻不是很清楚。

骨重建過程中離不開骨損傷周圍的微環境［16］，所以本研究把微環境中重要的巨噬細胞、成骨細胞以及重要的成骨因子 BMP-2 一起納入研究，使其更加接近體內真正的微環境。在巨噬細胞中過表達 BMP-2 后，與 C3H10 細胞共培養。實驗結果顯示，C3H10 細胞的增殖能力上升；成骨相關指標（ALP、礦化結節）都明顯高于對照組。此外，作為轉化生長因子家族中成骨分化中重要的轉錄因子 Runx2（Runt related transcription factor 2）基因水平和蛋白水平在巨噬細胞中的 BMP-2刺激下表達也明顯升高。因此推測，共培養體系中C3H10 細胞增殖能力和成骨分化能力的提高可能是通過激活 Runx2，再啟動相關基因活化導致，其具體機制還有待探討。

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Macrophage carrying BMP-2 promote C3H10 cell osteogenic differentiation

Zhou Shao-huai，Du Xie-qin，Jin Jing，Bian Feng，Fang Hong-yu.
（Department of Orthopedics，Wuhan Third Hospital，Wuhan 430060，China）

Objective To investigate effects of macrophage carrying BMP-2 on C3H10 cell osteogenic differentiation. Methods macrophage cell which was infected recombinant adenovirus BMP-2 co-culture with C3H10 cells. MTT was used to detect the proliferation capacity of C3H10 cell. C3H10 cell was performed ALP histochemical stain and activity detection at 5 and 7 days. mineralized nodules were exa mined by alizarin red staining， after 21 days. Real-time quantitative PCR was used to confirm the recombinant adenovirus BMP-2 availability and analyze Runx2 expression level. p-smad1/5/8 was analyzed by Western blot. Results Compared with control group， overexpression of BMP-2 in macrophage cell in co-culture system， the proliferation of C3H10 cells was promoted， ALP activity was significantly stimulated，and matrix mineralization increased。Real-time quantitative PCR results showed that the mRNA level of Runx2 was increased， and Western blot results show that the Rxun2 was increased in BMP-2 overexpression group. Conclusion Proliferation and osteogenic differentiation of C3H10 cell was promoted in co-culture system of over-expressing BMP-2 in macrophage cell， and the mechanism is potential achieved via stimulating typical BMP signal pathway.

Osteogenic differentiation； Macrophage； BMP-2

R329.2

A

1673-016X（2016）02-0031-04

2015-08-20

武漢市衛生計生委醫學科研項目（武衛（2011）98 NO WX11C16）

方紅育，E-mail：389672635@qq.com