肉毒堿脂酰轉移酶基因沉默對高山被孢霉脂質積累的影響

楊華，陳海琴，郝光飛，顧震南，陳衛，陳永泉

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

?

肉毒堿脂酰轉移酶基因沉默對高山被孢霉脂質積累的影響

楊華，陳海琴*，郝光飛，顧震南，陳衛，陳永泉

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

高山被孢霉是一種工業化生產多不飽和脂肪酸的產油真菌。通過分析高山被孢霉脂肪酸氧化途徑中相關基因的轉錄水平，發現肉毒堿脂酰轉移酶(carnitine acyl-transferase，CAT)基因與高山被孢霉脂肪酸氧化緊密相關，進一步利用RNA干擾技術實現在高山被孢霉中CAT基因的沉默，分析發現，在高山被孢霉重組菌中，CAT活性下調了33.3%，總脂肪酸積累量相比野生型菌株提高38.1%，表明通過抑制β氧化途徑可以提高高山被孢霉的脂質積累量，這為推動高山被孢霉在脂質生物合成工業化方面的應用奠定了理論基礎。

β氧化；高山被孢霉；RNA干擾；肉毒堿脂酰轉移酶

多不飽和脂肪酸(PUFAs)是指含有2個或2個以上雙鍵、碳原子數為16-26的直鏈脂肪酸。PUFAs是人體所必需的脂肪酸，具有調節血脂[1]，清理血栓[2]，調節免疫功能[3]，健腦補腦[4]等作用，對人類和動物的營養與健康具有十分重要的意義。由于傳統來源的PUFAs已經無法滿足日益增長的市場需求，所以能夠積累多不飽和脂肪酸的微生物日漸成為食品、醫藥和化工領域的研究熱點[5]。高山被孢霉(Mortierellaalpina)是一種工業化生產花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)的產油真菌，可以以甘油三酯形式積累多種多不飽和脂肪酸，已經通過正式安全性評估[6]，是脂質生物化學基礎研究的重要模式菌[7-9]。

以往對于產油微生物脂質積累的研究多集中于過表達脂肪酸合成途徑的相關基因(如乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸合成酶)來增加脂質產量，而脂肪酸氧化途徑也是維持脂肪酸貯存與消耗動態平衡的重要步驟[10]，從代謝工程的角度來看，通過阻斷脂肪酸氧化途徑，也可以提高脂質的產量。肉毒堿脂酰轉移酶(carnitine acyl-transferase，CAT)在脂肪酸氧化途徑中起著重要作用。脂酰輔酶A不能直接通過線粒體和過氧化物酶體膜，而CAT能夠催化脂酰輔酶A生成?；鈮A，?；鈮A能夠穿過線粒體或過氧化物酶體膜，從而實現脂肪酸在線粒體和過氧化物酶體內外的轉運，促進β氧化的進行。研究發現，增強CAT活性或提高CAT表達量均可促進脂肪酸的β氧化[11]，如在小鼠的飲食中加入L-肉毒堿可促進體內CAT的轉錄，改善因衰老引起的氧化效率降低現象[12]，亦可以明顯降低其細胞內甘油三酯含量[13]。在微生物研究方面，高弘等[14]通過對熱帶假絲酵母β氧化過程轉運途徑的代謝工程改造，敲除CAT基因后，酵母的產酸和烷烴轉化率得到了明顯的提高。因此，我們推測CAT在脂質代謝中發揮著重要作用，降低細胞內CAT活性將有助于抑制β氧化過程，提高產油真菌的脂質產量。本文采用了基因組信息比較全面[6]、遺傳操作系統相對成熟[7]的M.alpinaATCC 32222為原始菌株，通過分析高山被孢霉脂肪酸氧化途徑中相關基因的轉錄水平，選取在脂質代謝中發生明顯變化的肉毒堿脂酰轉移酶(CAT)基因為研究對象，通過根癌農桿菌介導的方法實現CAT基因的RNA干擾，提高重組菌株的脂質能力，這對于產油真菌高山被孢霉的基礎理論研究及產品開發均具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1菌株及載體

大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)DH5α用于保藏重組載體，保藏于本實驗室。購買于美國菌種保藏中心的高山被孢霉(M.alpinaATCC 32222)用于獲得目的基因。本實驗室構建的高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株CCFM 501用于受體細胞。根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)C58C1獲贈于日本京都縣立大學Yasuyuki Kubo教授，用作介導轉化。遺傳操作表達載體pBIG2-ura5s-Its來自本研究中心[7]。

1.2主要試劑

限制性內切酶Hind III、KpnI、XmaI、XhoI(NEB公司，美國)，T4DNA連接酶(Promega公司，美國)，KOD plus 高保真DNA聚合酶(TOYOBO公司，日本)，TaqDNA聚合酶(康為世紀，中國)，DNA分子量標準、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒(Fermentas公司，美國)，抗生素、飽和酚(上海生工，上海)，乙醇等化學試劑來自國藥，引物由上海桑尼公司合成。

1.3培養基

肉湯培養基，其組成為：20 g/L葡萄糖，5 g/L酵母提取物，1 g/L KH2PO4，0.25 g/L MgSO4·7H2O，10 g/L KNO3，pH 6.0。

MM培養基，其組成為：1.74 g/L K2HPO4，1.37 g/L KH2PO4，0.146 g/L NaCl，0.49 g/L MgSO4·7H2O，0.078 g/L CaCl2，0.002 5 g/L FeSO4·7H2O，0.53 g/L (NH4)2SO4，1.8 g/L葡萄糖，0.5%甘油，pH 6.8。

SC固體培養基組成為：20 g/L葡萄糖，5 g/L酵母氮源無氨基酸和硫酸銨，1.7 g/L (NH4)2SO4，60 mg/L異亮氨酸，60 mg/L亮氨酸，60 mg/L苯丙氨酸，50 mg/L蘇氨酸，40 mg/L賴氨酸，30 mg/L酪氨酸，20 mg/L腺嘌呤，20 mg/L精氨酸，20 mg/L組氨酸，10 mg/L甲硫氨酸，20 g/L瓊脂，pH 6.8。

需要時，向培養基中加入卡那霉素(Kanamycin，Kana)、氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)、利福平(Rifampicin，Rif)、尿嘧啶至終質量濃度為100 μg/mL，加入頭孢噻肟鈉(Cefotaxime Sodium，Cef)、壯觀霉素(Spectinomycin，Spe)至終質量濃度為50 μg/mL。

1.4RNAi載體構建

根據高山被孢霉M.alpinaATCC 32222的CAT1和CAT2基因序列信息，利用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物對，并添加酶切位點和保護堿基，具體引物序列見表1，下劃線部分為酶切位點。以高山被孢霉cDNA為模板，用上述引物、KOD plus高保真DNA聚合酶，通過PCR對基因片段進行擴增，得到目的片段。PCR擴增片段經純化后，與遺傳操作表達載體pBIG2-ura5s-Its酶切連接獲得RNAi載體。構建流程如下，連接產物電轉入大腸桿菌DH5α保藏，進而通過電擊法將質粒轉化入根癌農桿菌C58C1，所得陽性克隆擴大培養，-80 ℃下保存菌液，用于后續轉化實驗。

圖1　二元表達載體pBIG2-ura5s-CATs Silent的構建Fig.1　Construction of binary vector pBIG2-ura5s-CATs Silent

表1　引物序列

注：下劃線表示酶切位點

1.5根癌農桿菌介導高山被孢霉轉化

從-80 ℃冰箱中取出1.4中構建成功的重組根癌農桿菌，在100 μg/mL Kana和100 μg/mL Rif抗性的YEP液體培養基中活化，隨后與高山被孢霉尿嘧啶營養缺陷型菌株CCFM 501共培養，利用含有100 μg/mL Spe和100 μg/mL Cef抗性的SC平板篩選陽性克隆。重復篩選3次，將穩定遺傳的陽性菌株轉移至GY平板，培養至其產孢。用生理鹽水沖刷孢子，離心后保存在30%甘油中，-80 ℃冷藏。具體介導轉化操作步驟參考文獻有關根癌農桿菌轉化方法報道[15]。

1.6鑒定轉基因菌株

利用基因組提取試劑盒提取重組高山被孢霉的基因組DNA。 取1 μL DNA為模板進行PCR鑒定，根據遺傳操作表達載體pBIG2-ura5s-Its的啟動子和終止子序列設計引物對HisproF1/TrpCR1(表1)[7]來驗證表達單元是否成功整合到基因組上。PCR 條件為:95 ℃ 5 min預變性，95 ℃變性30 s、 55 ℃退火30 s、 72 ℃延伸1 min，30個循環； 72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7基因轉錄水平分析

使用Trizol法提取總RNA[6]。提取得到RNA溶液后，根據Prime ScriptTM1st Stand Sythesis試劑盒產品說明書進行反轉錄制備cDNA。使用ABI-Prism 7900 sequence detection system (Applied Biosystems, CA) 按照SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA) 的說明進行RT-qPCR反應。反應體系為：10 μL SYBR Green PCR Master Mix，兩種引物各0.5 μL，8 μL無酶水，1 μL模板。PCR循環設置為 50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環。以高山被孢霉自身的18S rRNA為內參，根據2-ΔΔCt法來分析基因表達的相對變化。

1.8肉毒堿脂酰轉移酶活性的測定

取0.2 g高山被孢霉菌體，加入液氮充分研磨至粉末，加入2 mL酶提取緩沖液(磷酸二氫鉀/氫氧化鉀緩沖液(pH 7.5)的質量濃度為100 mol/L，苯甲脒鹽酸的濃度為1 mol/L，二硫蘇糖醇的濃度為1 mol/L，甘油的質量分數為20%)，吸取液體到1.5 mL離心管中，轉速為10 000 r/min，4 ℃，離心5 min，上清液即粗蛋白提取液，轉移到另一個1.5 mL離心管中。

CAT酶活測定的原理主要是利用DTNB試劑與CoA反應生成黃色物質，通過測定412 nm處可見光吸光度變化速率就可以計算出酶活性，具體方法參考文獻[16-17]。酶活以1 mg蛋白單位時間內CoA的生成量表示。

1.9高山被孢霉菌體中脂肪酸組成及含量測定

稱取一定質量真空冷凍干燥后的菌體，研磨充分至粉碎，并加入濃度為4 mol/L的HCl，在80 ℃/-80 ℃下反復凍融破壁。采用三氯甲烷和甲醇萃取總脂，氮吹后加入鹽酸甲醇溶液進行甲酯化，隨后用正己烷萃取，得到的脂肪酸甲酯使用氣相檢測。具體實驗操作見文獻[6]。

2　結果與討論

2.1β氧化途徑相關基因的轉錄調控

將高山被孢霉在5 L發酵罐中培養，選取氮源耗盡前后的時間點(A：8 h，B：18 h，E：19.5 h，K：21 h，L：32 h 和 M：68 h)進行取樣，以E點時的樣品作為對照組[6]，分析β氧化途徑相關基因轉錄水平，以確定其表達情況。如圖2，當高山被孢霉處于脂質積累階段時(K-L)，參與脂肪酸β氧化的脂酰輔酶A脫氫酶(EC 1.3.99)、烯酰輔酶A水合酶(EC 4.2.1.17)和3-羥脂酰輔酶A脫氫酶(EC 1.1.1.35)等的轉錄水平一直處于一個相對穩定的狀態，而肉毒堿脂酰轉移酶(EC 2.3.1.7)基因表現出下調的趨勢，這可能是為了減少脂肪酸轉運到線粒體進行氧化[14]，從而保證了合成的甘油三酯能被很好地積累起來。而其中肉毒堿脂酰轉移酶2(CAT2)的轉錄水平出現了較小幅度的上調，這可能是由于脂質積累促進了脂質代謝的活躍程度。因此我們推測在高山被孢霉細胞內，肉毒堿脂酰轉移酶與脂肪酸氧化緊密相關，故選定其作為研究對象。

A-8 h; B-18 h; E-19 h; K-21 h; L-32 h; M-68 h圖2　M. alpina中脂酰輔酶A脫氫酶、肉毒堿脂酰轉移酶、烯酰輔酶A水合酶和3-羥脂酰輔酶A脫氫酶的轉錄水平變化Fig.2　Transcription levels of acyl-CoA dehydrogenase dehydrogenase, carnitine acetyltransferase, enoyl-CoA hydratase and 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase in M. alpina

2.2高山被孢霉CAT的基因沉默

2.2.1重組菌株的構建及鑒定

以高山被孢霉cDNA為模板進行PCR擴增獲得目的基因片段(圖3)，M為marker，1為CATsSF片段，2為CATsSR片段，與理論大小214 bp一致，并且測序驗證正確。酶切連接獲得CAT沉默載體pBIG2-ura5s-CATsSilent，并通過根癌農桿菌介導轉化的方法將載體的T-DNA區域整合到高山被孢霉基因組中。其中T-DNA區域包含兩個表達元件，作為篩選標記的ura5表達元件和沉默CAT基因的表達元件。從篩選得到的能夠穩定遺傳的陽性克隆中隨機挑選3株轉化子進行PCR驗證。結果如圖4，M為marker，N為高山被孢霉野生型對照菌株，1、2、3分別為轉化的重組菌株。轉化菌株只能得到一條818 bp的條帶，為尿嘧啶基因表達元件，另一個表達元件由于形成發卡結構而無法通過PCR擴增得到片段，同時，對照組無條帶，說明表達元件都已成功插入到高山被孢霉基因組，形成穩定遺傳的重組菌株。

圖3　純化后的CATsSF和CATsSR基因片段Fig.3　Purification of CATsSF and CATsSR gene fragments

圖4　M. alpina重組菌的PCR鑒定Fig.4　Verification of M. alpina transformants by PCR

2.2.2轉化菌株中CAT基因表達量分析

分別取重組菌株和野生型菌株迅速置于液氮中，提取總RNA，分析CAT1和CAT2轉錄水平表明(圖5)，所有沉默重組菌株中肉毒堿脂酰轉移酶基因的表達量均明顯低于野生型，CAT1和CAT2編碼基因的轉錄水平均下降了40%左右，表明在重組菌株中實現了對CAT基因的沉默。

圖5　M. alpina重組菌株中肉毒堿脂酰轉移酶基因的轉錄水平Fig.5　The transcriptional level of CAT in M. alpina transformants

2.2.3轉化菌株中CAT酶活分析

將選定的3株轉化子以及野生型高山被孢霉在100 mL肉湯培養基中28 ℃，轉速為200 r/min培養7 d后，收集菌體，破碎菌體后進行CAT酶活測定。結果如圖6所示，重組菌株CAT酶活水平相比對照菌下調33.3%左右，這表明通過RNAi可影響肉毒堿脂酰轉移酶的活性，本研究通過在高山被孢霉基因組中引入CAT基因的正向和反向特異性序列，使其轉錄后形成dsRNA來干擾高山被孢霉中CAT基因的轉錄量，進而影響CAT酶活。

圖6　M. alpina重組菌株中肉毒堿脂酰轉移酶活性Fig.6　CAT activities in M. alpina transformants

2.3重組高山被孢霉轉化子脂肪酸的分析

將選定的3株CATs沉默菌株與野生型高山被孢霉在100 mL肉湯培養基中28 ℃，轉速為200 r/min培養10 d后收集菌體，對脂肪酸含量進行分析。如表2所示，相比于野生型高山被孢霉，重組菌株脂肪酸組成并沒有變化，這表明在高山被孢霉細胞內，脂肪酸氧化代謝的發生對于脂肪酸碳鏈長度沒有偏好性。從表2可以看出沉默菌株生物量與對照菌相比沒有顯著差異，表明CAT酶的轉錄干擾對生物量影響極小。高山被孢霉在脂質積累期內脂肪酸氧化產生的能量主要用于多余熱量的產生[14]，因此CAT活性的降低不影響菌體的正常生長。但脂肪酸總量較野生型有所變化，在MA-CATs-S3沉默菌株中，脂肪酸的含量達到了細胞干重的38.4%，而對照菌株中的脂肪酸含量僅占細胞干重的27.8%左右，這表明CAT基因轉錄水平和酶活性的下降使脂肪酸的含量提高了約38.1%，是調控高山被孢霉脂肪酸氧化過程的重要酶，這也很好地驗證了2.1中的轉錄分析結果。綜合以上結果可以看出，在產油真菌高山被孢霉中，CAT的活性對維持細胞內脂肪酸氧化代謝的活躍程度十分重要，抑制其活性能夠抑制脂肪酸氧化過程，從而顯著提高細胞的脂質積累。同時也應該注意到，除了直接參與β氧化過程的酶之外，還存在著其他可以間接影響氧化代謝途徑的酶。過氧化物酶體生物合成因子(pex10)在最近被發現可能與脂肪酸合成密切相關，pex10的失活影響了解脂酵母細胞內的脂肪酸氧化過程，從而提高了脂質產量[18]。然而，這些基因在高山被孢霉進入脂質積累期后并沒有發生明顯的變化，其作用仍需進一步探討。

表2　高山被孢霉菌株脂肪酸組成

注：*表示與對照相比差異顯著。

3　結論

本文通過對高山被孢霉脂質積累期參與β氧化的相關基因表達水平分析，預測出影響脂肪酸氧化的關鍵酶，并成功構建了高山被孢霉CAT基因沉默重組菌株，實現了肉毒堿脂酰轉移酶活性的降低，從而達到抑制脂肪酸氧化的目的，最終使高山被孢霉總脂肪酸含量提高約38.1%。這為提高高山被孢霉脂質產量提供了新的思路，也為研究其脂質合成代謝途徑提供了理論基礎。

[1]杭曉敏, 唐涌濂, 柳向龍. 多不飽和脂肪酸的研究進展[J]. 生物工程進展, 2001, 21(4):18-21.

[2]黃建忠,施巧琴,周曉蘭,等. 提高深黃被孢霉菌絲細胞油脂合成總量及其不飽和脂肪酸酯含量的研究[J].食品與發酵工業, 1998, 24(2):27-31.

[3]STOLL B A. N-3 fatty acids and lipid peroxidation in breast cancer inhibition [J]. British Journal of Nutrition, 2002, 87(3):193-198.

[4]吳時敏. 胎兒、嬰幼兒的功能性多不飽和脂肪酸需要概況 [J]. 中國乳品工業, 2001, 29(3):21-23.

[5]BEOPOULOS A, CHARDOT T, NICAUD J M.Yarrowialipolytica:A model and a tool to understand the mechanisms implicated in lipid accumulation[J]. Biochimie, 2009, 91(6):692-696.

[6]WANG Lei, CHEN Wei, FENG Yun, et al. Genome characterization of the oleaginous fungusMortierellaalpina[J]. Plos One, 2011, 6(12):1-16.

[7]HAO Guang-fei, CHEN Hai-qin, WANG Lei, et al. Role of malic enzyme during fatty acid synthesis in the oleaginous fungusMortierellaalpina[J]. Applied And Environmental Microbiology, 2014, 80(9):2 672-2 678.

[8]HAO Dan-hui, CHEN Hai-qin, HAO Guang-fei, et al. Production of conjugated linoleic acid by heterologous expression of linoleic acid isomerase in oleaginous fungusMortierellaalpina[J]. Biotechnology Letters, 2015, 37(10):1 983-1 992.

[9]HAO Guang-fei, CHEN Hai-qin, GU Zhen-nan, et al. Metabolic engineering ofMortierellaalpinafor arachidonic acid production with glycerol as carbon source [J]. Microbial Cell Factories, 2015, 14(1):1-10.

[10]周華龍,陳家麗,張新. 不飽和脂肪酸的氧化機理研究[J]. 皮化材料, 2002, 24(4):23-28.

[11]BRUCE C R, HOY A J, TURNER N, et al. Overexpression of carnitine palmitoyltransferase-1 in skeletal muscle is sufficient to enhance fatty acid oxidation and improve high-fat diet-induced insulin resistance [J]. Diabetes, 2009, 58(3):550-558.

[12]SAHEKI T, LI M X, KOBAYASHI K. Antagonizing effect of AP-1 on glucocorticoid induction of urea cycle enzymes:a study of hyperammonemia in carnitine-deficient, juvenile visceral steatosis mice [J]. Molecular Genetics And Metabolism, 2000, 71(4):545-551.

[13]TORAL M, ROMERO M, JIMENEZ R, et al. Carnitine palmitoyltransferase-1 up-regulation by PPAR-beta/delta prevents lipid-induced endothelial dysfunction [J]. Clinical Science, 2015, 129(9):823-837.

[14]高弘,黃英明,劉銘,等. CAT基因敲除對熱帶假絲酵母產DCA13代謝網絡的影響[J]. 化工學報, 2006, 57(9):2157-2160.

[15]ANDO A, SUMIDA Y, NEGORO H, et al. Establishment of agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of an oleaginous fungus, Mortierella alpina 1S-4, and its application for eicosapentaenoic acid producer breeding [J]. Applied And Environmental Microbiology, 2009, 75(17):5 529-5 535.

[16]FRITZ I B, SCHULTZ S K, SRERE P A. Properties of partially purified carnitine acetyltransferase [J]. Journal of Biological Chemistry, 1963, 238(7):2 509-2 517.

[17]FRITZ I B, SCHULTZ S K. Carnitine acetyltransferase II. Inhibition by carnitine analogues and by sulfhydryl reagents [J]. Journal of Biological Chemistry, 1965, 240(5):2 188-2 192.

[18]XUE Zhi-xiong, SHARPE P L, HONG S P, et al. Production of omega-3 eicosapentaenoic acid by metabolic engineering ofYarrowialipolytica[J]. Nature Biotechnology, 2013, 31(8):734-742.

Effect of carnitine acyl-transferase suppression on fatty acid accumulation inMortierellaalpina

YANG Hua, CHEN Hai-qin, HAO Guang-fei, GU Zhen-nan,CHEN Wei, CHEN Yong-quan

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Mortierellaalpinais a type of fungus used for the industrial production of polyunsaturated fatty acids. Transcription levels of most of the β-oxidation-related genes were analyzed, and carnitine acyl-transferase was speculated to be the key enzyme involved in the oxidation. To suppress the oxidation of fatty acids, RNA interference technology was used to achieve gene silence of the key enzyme inMortierellaalpina. Enzyme activity analysis showed that the specific activity decreased by 33.3%. Lipid analysis revealed that there was a 38.1% increase in the fatty acid content compared to the wild-type, which indicated that suppression of β-oxidation could significantly increase fatty acid accumulation inMortierellaalpina. These results provided theoretical support for implications for industrial production of fatty acids inMortierellaalpina.

β-oxidation;Mortierellaalpine; RNA interference (RNAi); carnitine acyl-transferase

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608003

碩士(陳海琴教授為通訊作者，E-mail：haiqinchen@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學基金(21276108)。

2016-03-01，改回日期：2016-03-30