整合過表達嘌呤代謝途徑關鍵酶基因提高釀酒酵母菌株環磷酸腺苷產量

王凱，姬曉兵，徐歡歡，仇申珅，鄒少蘭

(天津大學 化工學院，天津，300072)

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整合過表達嘌呤代謝途徑關鍵酶基因提高釀酒酵母菌株環磷酸腺苷產量

王凱，姬曉兵，徐歡歡，仇申珅，鄒少蘭*

(天津大學 化工學院，天津，300072)

調控嘌呤代謝途徑關鍵酶基因表達水平，會影響經AMP→ADP→ATP 而生成的cAMP(cyclic adenosine mnophosphate,cAMP)產量。將釀酒酵母編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶基因PRS1和PRS3、磷酸核糖焦磷酸氨基轉移酶基因ADE4、腺苷酸激酶基因ADK1，分別置于磷酸甘油酸激酶基因PGK1的啟動子PGK1p和終止子PGK1t控制下，利用整合載體YIplac211，在菌株GA125中進行整合表達，通過搖瓶實驗考察所得菌株的環磷酸腺苷產量。結果表明，在加腺嘌呤條件下，120 h時的cAMP產量分別為(5 380.5±1.91)、(5 189.4±1.72)、(5 131.8±2.05)和(5 199.9±1.62)μmol/L，較菌株GA125分別提高9.8%、5.9%、4.8%和6.2%；此外，ADK1過表達導致一定的生長抑制，所有菌株的腺嘌呤消耗量在(0.399±0.01)～(0.447±0.02)g/L，葡萄糖利用和乙醇產生上彼此沒有呈現明顯差異。

釀酒酵母；嘌呤代謝途徑；整合；環磷酸腺苷；腺嘌呤

環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)是細胞內參與調節物質代謝和生物學功能的重要物質，它廣泛參與機體內的各種生理活動，是生物體內重要的第二信使。 cAMP 不僅對于心腦血管疾病、惡性腫瘤、失眠健忘、再障性貧血等多種疾病均能達到好的治療效果[1]，在畜牧養殖業上也有重要的應用價值[2]。

在 cAMP 生產的主要3種方式——化學合成法、酶合成法和微生物發酵法中，發酵法具有可實現持續生產、工藝簡單、能利用廉價的碳源、毒副作用小等多種優勢[3]。而釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)不僅具有工業化應用技術成熟、抗逆性強、為食品安全性GRAS 微生物的優點，同時作為最早實現全基因組測序的微生物菌種，又是分子生物學和遺傳學研究的最重要模式生物之一[4]。因此，通過遺傳工程手段的改造實現以釀酒酵母為菌種的cAMP 發酵法生產，具有其特殊的優勢。

釀酒酵母胞內嘌呤核苷酸的合成有從頭合成途徑(De Novo Synthesis)和補救途徑(Salvage Pathway)(圖1)[3]。研究證明，當胞內ADP、ATP濃度過高時，ADP、ATP通過反饋抑制從頭合成途徑第1個酶——磷酸核糖焦磷酸氨基轉移酶(5-phosphoribosyl 1-pyrophosphate amidotransferase,PRPP amidotransferase)即Ade4p(對應基因為ADE4)的活性，而使從頭合成途徑基因的轉錄水平下降，表達受到抑制。當培養基中有相當量的腺嘌呤存在時，腺嘌呤進入胞內，通過補救途徑形成AMP，AMP進一步轉化為ADP和ATP，進而導致整個從頭合成途徑合成受到抑制[5-6]。催化AMP、ADP和ATP相互轉化的腺苷酸激酶(adenylate kinase)由ADK1基因編碼，是一種進化上高度保守的磷酸轉移酶，可維持ATP、ADP和AMP間的平衡，在調節能量代謝和維持細胞內核苷酸的穩定方面有重要作用[7-8]。另一方面，作為機體中重要的代謝中間產物，PRPP參與包括嘌呤核苷酸從頭合成途徑和補救途徑在內的細胞內多條代謝途徑，其濃度受到嚴格控制;就嘌呤代謝途徑而言，控制PRPP濃度的一個途徑是通過終產物AMP、GMP反饋抑制磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPP synthetase)的活性。PRPP合成酶復合物亞基1～5分別由基因PRS1-PRS5編碼，5個基因都能表達，但單個基因的表達產物都沒有PRPP合成酶活性[9]。研究證明[10-11]，缺失PRS2或PRS4基因對細胞生長代謝影響較小，而缺失PRS1或PRS3基因對細胞代謝影響顯著；在缺失PRS1或PRS3的情況下，PRS5為細胞活性所必需。

由上述可知，PRPP合成酶、PRPP氨基轉移酶Ade4p和腺苷酸激酶Adk1p都會影響到cAMP前體物ADP、ATP的合成，提高此3個關鍵酶基因的表達水平，預測可以提高cAMP的產量。姬曉兵等使用磷酸甘油酸激酶基因PGK的啟動子PGK1p及終止子PGK1t，通過多拷貝游離型質粒YEplac195分別過表達PRS1、PRS3、ADE4和ADK1基因，結果PRS1、PRS3、ADE4過表達菌株的cAMP產量分別提高了9.03%、4.17%和6.06%，而ADK1過表達菌株則降低了3.85%[3]。為了提高基因表達的穩定性，同時觀察拷貝數的影響，判斷ADK1過表達菌株產量下降是否與ADK1過高的拷貝數和表達水平有關本研究改為通過整合載體YIplac211[12]分別單拷貝整合4個基因到染色體上，然后進行生長及cAMP發酵評價。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、質粒和引物

本實驗所用質粒、菌株和引物見表1。

圖1　釀酒酵母嘌呤核苷酸合成的部分途徑Fig.1　Part of purine nucleotide synthesis pathway in S. cerevisiae

表1　實驗所用質粒、菌株和引物

1.1.2培養基和培養條件

Luria-Bertani(LB)培養基(g/L)：酵母抽提物 5，胰化蛋白胨 10，NaCl 10，pH 7.0，固體培養基則還需添加瓊脂粉 15，用于轉化子篩選時添加氨芐青霉素至終濃度100 mg/L，用于大腸桿菌的培養。固體培養條件：37 ℃ 培養箱倒置；液體培養條件：37 ℃、220 r/min。

YPD培養基(g/L)：酵母抽提物10，蛋白胨20，葡萄糖20，自然pH值，固體培養基則還需添加瓊脂粉15，用于釀酒酵母的培養。固體培養條件：30 ℃培養箱倒置；液體培養條件：30 ℃、220 r/min。

CMG-URA培養基(g/L)：YNB 6.7，葡萄糖20，氨基酸堿基混合物0.83，固體培養基還需添加瓊脂粉15，并調節pH至6.5；液體培養基調節pH至5.6。平板用于釀酒酵母轉化子篩選，30 ℃靜止培養。氨基酸堿基混合物的組成如下(mg/L)：腺嘌呤50，亮氨酸100，精氨酸20，賴氨酸30，天冬氨酸100，甲硫氨酸20，谷氨酸100，苯丙氨酸50，組氨酸100，絲氨酸150，異亮氨酸30，蘇氨酸150，色氨酸l00，酪氨酸30，纈氨酸150。

發酵培養基(g/L)：酵母抽提物20，蛋白胨40，葡萄糖125，腺嘌呤1.25，自然pH值.用于釀酒酵母整合菌株的生長與發酵評價，30 ℃、220 r/min培養。

1.1.3主要試劑和設備

限制性內切酶購自美國Fermentas公司，PCR用酶購自北京全式金生物有限公司，T4連接酶購自美國Thermo Scientific公司；PCR產物和DNA片段切膠回收試劑盒購自北京博邁德生物技術有限公司；引物合成與基因測序由北京奧科鼎盛科技有限公司完成.氨芐抗生素與生化試劑購自上海生工生物工程股份有限公司，所用化學試劑為分析純。

紫外可見分光光度計，美國UNICO公司；梯度PCR擴增儀，德國BIOMETRA公司；凝膠成像分析系統，美國Bio-rad公司Gel Doc XR；恒溫培養箱，德國Memmert公司；Waters Alliance 2695高效液相色譜儀，美國Waters公司。

1.2實驗方法

1.2.1分子生物學基本操作

大腸桿菌質粒DNA提取用堿裂解法[13]。釀酒酵母感受態細胞制備和轉化用醋酸鋰法[14]。其他有關操作如PCR、菌落PCR鑒定、酶切反應、瓊脂糖凝膠電泳、連接、染色體提取等均參照文獻[13,15]。

1.2.2四個整合質粒的構建

大量提取制備表1中的4個穿梭質粒，分別PstI和EcoRI雙酶酶切后與同樣雙酶酶切的整合質粒YIplac211大片段連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布添加了氨芐青霉素(終濃度100 mg/L)的LB平板，挑取平板生長菌落，接種添加了氨芐青霉素(終濃度100 mg/L)的LB液體培養基進行培養，提取質粒進行酶切鑒定，得到4個目的質粒YIplac211-PGK1p-PRS1-PGK1t、YIplac211-PGK1p-PRS3-PGK1t、YIplac211-PGK1p-ADE4-PGK1t和YIplac211-PGK1p-ADK1-PGK1t。

1.2.3整合菌株的構建

將上述4個整合質粒和對照質粒YIplac211分別首先用StuI單切線性化，然后用醋酸鋰法[13]轉化菌株GA125感受態細胞，用CMG-URA平板進行篩選，挑取平板生長菌落接種YPD液體培養基進行培養，提取染色體進行PCR鑒定，使用表2中的引物對P1、P4。這里，利用整合載體上的URA3基因被StuI酶切分開的兩個片段分別作為左、右同源臂整合到GA125菌株染色體的URA3位點。

1.2.4整合菌株的生長與發酵評價

種子液培養：挑取固體培養基平板上生長的菌落，接入裝有 5 mL YPD 培養液的試管中，30 ℃ 下 220 r/min 過夜培養，然后轉接進行二次擴大培養，所得菌液為種子液。

發酵培養：新鮮種子液接種到裝有25 mL發酵培養基的100 mL容量瓶中，控制初始OD600值在1左右，30 ℃、220 r/min下發酵，間隔12 h或24 h取樣進行分析。

發酵液的分析：(1)OD600測定：將發酵樣品適當稀釋后測定 OD600值，檢測生長情況；(2)HPLC 分析 cAMP 和腺嘌呤濃度：將發酵樣品在 13 000 r/min、1 min 條件下離心，取上清進行適當稀釋，用孔徑 0.22 μm 的濾膜過濾，濾液用于色譜檢測：檢測波長 258 nm，Thermo Syncronis C18色譜柱，流動相組分為5.78 g/L KH2PO4，2.72 g/L 四丁基溴化銨(用磷酸調節 pH 至 4.3)與乙腈之體積比為85∶15，流速 1 mL/min，柱溫 35 ℃。

所有發酵實驗均進行了3次重復。

2　結果

2.1整合質粒的構建

本課題前期工作中，利用RT-qPCR方法比較了1.2.4所示發酵條件下菌株GA125細胞PGK1基因相對于PRS1、PRS3、ADE4和ADK1基因的轉錄水平，證明了PGK1基因啟動子啟動強度高于4個基因。故這里仍然選擇使用PGK1基因的調控元件(PGK1p和PGK1t)來進行4個基因的表達。YIplac211和構建的4個整合質粒示意圖見圖2。

圖2　YIplac211和YIplac211-PGK1p-ORF-PGK1t質粒示意圖Fig.2　Schematic illustration of plasmids YIplac211 and YIplac211-PGK1p-ORF-PGK1t

4個整合質粒的PstI+EcoRI雙酶酶切和StuI單酶酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖3。

Lanes 1, 6:ladder; lanes 2-5:PstI + EcoRI, (3762+2252), (3762+ 1960), (3762+2530) and (3762+1666) bp for gene PRS1, PRS3, ADE4 and ADK1-containing integrating vectors, respectively; lanes 7-10:Stu I, 6014, 5722, 6292 and 5428 bp for gene PRS1, PRS3, ADE4 and ADK1-containing integrating vectors, respectively圖3　整合質粒酶切產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.3　Agarose gel electrophoresis of enzymatically digested products of integrating vectors

2.2整合菌株的構建

如圖2所示，經StuI酶切線性化后，利用整合載體上的URA3基因被Stu I酶切分開的兩個片段分別作為左、右同源臂整合到GA125菌株染色體的URA3位點.對CMG-URA平板篩選得到的菌株進一步進行PCR鑒定，以染色體DNA為模板、P1/P2為引物對的PCR鑒定結果見圖4。

Lane 1:ladder; lanes 2-5:2252, 1960, 2530 and 1666 bp for gene PRS1, PRS3, ADE4 and ADK1-integrating strains, respectively圖4　整合菌株PCR鑒定產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.4　Agarose gel electrophoresis of PCR products for recombinant strains

2.3整合菌株的生長與發酵評價

對經過上述篩選、鑒定得到的整合菌株進行了搖瓶發酵實驗，結果見圖5。

由生長曲線可以看出：不同整合菌株的生長在24 h后彼此呈現出較為明顯的差異，120 h時的OD600值分別為(81.8±0.16)(GA125-IP1)、(71.8±0.20)(GA125-IP3)、(80.0±0.14)(GA125-IE)、(62.3±0.12)(GA125-IK)和(70.0±0.11)(GA125-I)，暗示了不同基因單拷貝整合過表達造成的生長效應不同。其中GA125-IK自48 h起OD600值低于對照菌株，表現出了一定程度的生長抑制。

由cAMP發酵曲線可以看出：4個基因的過表達均提高了cAMP的產量，120 h時的濃度分別為(5380.5±1.91)(GA125-IP1)μmol/L、(5189.4±1.72) (GA125-IP3)μmol/L、(5131.8±2.05) (GA125-IE)μmol/L、(5199.9±1.62)(GA125-IK)μmol/L和(4898.6±1.87) (GA125-I)μmol/L，增幅分別達9.8 %、5.9 %、4.8 %和6.2 %。

由腺嘌呤消耗(累計)量曲線可以看出：GA125-IP1和對照菌株GA125-I前期(72 h)消耗量低于其余三個整合菌株，72 h后GA125-I則稍稍高于所有整合菌株；菌株GA125-IP3、GA125-IE和GA125-IK之間則自始至終彼此出入不大。所有菌株的腺嘌呤最大消耗量在(0.399±0.01)～(0.447±0.02)g/L。

葡萄糖濃度曲線顯示出所有菌株利用葡萄糖的速度差異不大，僅菌株GA125-IP3在后期利用速度上稍稍高于其他菌株；120 h時的殘糖含量為(0.23±0.03)～(0.39±0.02)g/100 mL。而與葡萄糖利用能力相應，乙醇濃度曲線顯示出所有菌株利用葡萄糖產乙醇的速度上彼此也出入不大，乙醇濃度在(48～72) h進入平臺期，最大乙醇濃度在(2.69±0.04)～(3.00±0.02) g/100 mL。

綜合分析上述各個指標之間的關系，發現其與4個基因類型間的關聯并不明顯。在4個基因單拷貝整合過表達都能提高cAMP產量的基礎上，生長-cAMP產量-腺嘌呤利用能力-葡萄糖利用能力-產醇濃度之間的關聯性，沒有呈現出因基因種類變化而變化的明顯的、一致的某種規律。

圖5　整合菌株生長、cAMP發酵、腺嘌呤消耗、葡萄糖和乙醇濃度曲線Fig.5　The growth, cAMP fermentation, adenine consumption, glucose and ethanol curves of five integrating strains

3　討論

釀酒酵母中cAMP的合成涉及相當復雜的代謝途徑和調控機制。本研究結果初步證明了提高嘌呤代謝途徑關鍵酶基因PRS1、PRS3、ADE4和ADK1的表達水平，確能提高cAMP產量。而每個基因提高cAMP產量的程度，及其過表達菌株的生長、腺嘌呤和葡萄糖利用能力、產乙醇特性等等，推測是下述因素綜合作用的結果：(1) 基因功能在釀酒酵母整個代謝途徑中的作用；(2) 出發菌株中基因的表達水平；(3) 在出發菌株中過表達基因的方式(由此決定了其過表達的水平和受到的調控機制)；(4) 過表達菌株的培養和發酵條件。

本課題前期工作中，利用RT-qPCR方法比較了1.2.4所示發酵條件下菌株GA125細胞中若干基因的相對轉錄水平，發現PRS和ADE4中的基因最高轉錄水平也只有組成型表達基因PGK1轉錄水平的2.4%，而轉錄水平相對較高的ADK1，為PGK1轉錄水平的12.1 %。這個結果證明了PGK1啟動子在本課題培養條件下仍然為強啟動子，故本研究中使用PGK1的啟動子和終止子來表達4個基因，預測能使這些基因以高于出發菌株野生型基因的水平組成型表達，cAMP產量的提高證明了這一點。

另一方面，對比本研究中單拷貝整合方式過表達和多拷貝游離型質粒形式過表達[3]的結果，反映出針對不同功能和不同基礎表達水平的基因，合適的劑量至關重要。如上所述，ADK1基礎表達水平相對遠高于PRS1、PRS3和ADE4基因，故多拷貝游離型質粒載體可能導致其表達水平不適當地過高而產生某種不平衡，最終cAMP產量不升反降(較對照菌株下降3.85 %)，而生長不受影響[3]。而PRS1、PRS3和ADE4基因單拷貝整合過表達的增產效應與多拷貝游離型質粒形式過表達的增產效應差異不大的結果則進一步暗示了PGK1強啟動子下的單個拷貝數整合過表達可能已實現其增產潛力，或者存在其他的調控因素限制了高拷貝數表達下的增產效果。其中值得注意的一個問題是：多拷貝游離型質粒形式過表達菌株的生長、發酵評價體系沒有提供維持質粒穩定存在的必需的選擇壓力，隨著發酵的進行，可能存在的質粒丟失問題會影響到cAMP發酵動力學和最終產量。因此，要嚴格考察4個基因最大的增產潛力、進一步提高cAMP產生水平，在保證基因表達穩定性的前提下繼續優化基因劑量即提高整合拷貝數的同時，還需要利用包括蛋白水平、代謝物水平在內的檢測手段而加強對其它可能制約因素的分析和調控。

目前，釀酒酵母中生產cAMP的報道基本上都是基于cAMP 信號傳導途徑的基礎研究[5-6,16]，本實驗室通過釀酒酵母發酵生產cAMP的報道尚屬首次。本研究將有助于推動高值醫藥產品的綠色清潔生產，具有重要的應用意義。

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Over-expressing key enzyme genes in the purine synthesis pathway by integrating into genome improves cyclic adenosine monophosphate production bySaccharomycescerevisiae

WANG Kai,JI Xiao-bing,XU Huan-huan,QIU Shen-shen,ZOU Shao-lan*

(College of Chemical Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China)

Regulation of the expressing level of key enzyme genes in the purine synthesis pathway would influence cyclic adenosine monophosphate (cAMP) production by changing the metabolic flux to AMP, ADP and ATP. In this study, PRPP synthetase-encoding genePRS1 andPRS3, PRPP amidotransferase-encoding gene ADE4 and adenylate kinase-encodingADK1 were separately integrated into the genome of the cAMP-producing strain GA125 under the control of promoterPGK1pand terminatorPGK1tfrom phosphoglyceric kinase-encoding genePGK1. The integrating vector YIplac211 was used and cAMP production by the resultant strains was investigated by fermentation in shake flasks. It showed that when adenine was added into fermentation media, the cAMP titers at 120 h were (5 380.5±1.91) μmol/L, (5 189.4±1.72) μmol/L, (5 131.8±2.05) μmol/L and (5 199.9±1.62) μmol/L, respectively, and increased by 9.8%, 5.9%, 4.8% and 6.2%, respectively. On the other hand, over-expression ofADK1 gene led to a slight inhibition of growth. The adenine consumption of all strains was (0.399±0.01)～(0.447±0.02) g/L and it seemed that the glucose utilization and ethanol production didn’t vary with genes being over-expressed.

Saccharomycescerevisiae; purine synthesis pathway; integration; cyclic adenosine monophosphate; adenine

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608005

碩士(鄒少蘭副研究員為通訊作者，E-mail：slzhou@tju.edu.cn)。

2015-12-17，改稿日期：2016-04-21