人類乳頭狀病毒基因分型對HPV E6/E7 mRNA表達的影響

周　卉，張普宏，3，馮　鋼，張德軒，陳苗紅，雍　煒，帥朝霞，許　巖，吳　競，3

(1.皖南醫學院第二附屬醫院　檢驗科，安徽　蕪湖　241002；2.皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院　檢驗科，安徽　蕪湖　241001 3.皖南醫學院　檢驗診斷學教研室，安徽　蕪湖　241002)

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·基礎醫學·

人類乳頭狀病毒基因分型對HPV E6/E7 mRNA表達的影響

周卉1，張普宏1，3，馮鋼2，3，張德軒1，陳苗紅1，雍煒1，帥朝霞1，許巖1，吳競1，3

(1.皖南醫學院第二附屬醫院檢驗科，安徽蕪湖241002；2.皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院檢驗科，安徽蕪湖241001 3.皖南醫學院檢驗診斷學教研室，安徽蕪湖241002)

目的：探討HPV基因分型對HPV E6/E7 mRNA表達的影響。方法：回顧分析227例接受HPV E6/E7 mRNA 檢測的HPV病毒感染患者，高危型HPV病毒感染者204例，低危型HPV病毒感染者23例。PCR導流雜交方法檢測HPV基因分型，支鏈DNA法檢測HPV E6/E7 mRNA載量。結果：高危型HPV感染患者宮頸上皮細胞內HPV E6/E7 mRNA表達載量[201.15(0.00,671.98)]較低危型HPV感染患者[0.00(0.00,16.00)]增高(P<0.05)。多因素回歸分析發現HPV52(β=6936.219)、HPV18(β=4551.115)、HPV45(β=5178.912)三個高危亞型可影響宮頸上皮細胞內HPV E6/E7 mRNA載量(P<0.05)。結論：高危型HPV52、HPV18、HPV45病毒感染可影響宮頸上皮細胞內HPV E6/E7 mRNA的表達，進而促進宮頸惡性病變的發生和發展。

宮頸癌；人類乳頭狀病毒；E6/E7 mRNA；支鏈DNA

宮頸癌是一種嚴重危害女性健康和生命的惡性腫瘤，病死率位居女性惡性腫瘤的第二位，是由宮頸上皮內瘤變緩慢發展而來，一般需要5～10年。流行病學證實人類乳頭狀病毒感染是宮頸癌發生發展的首要因素，約99.8%宮頸癌患者可以檢測到HPV病毒的感染。HPV病毒有100多種亞型，最常見的有16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等高危型及6、11、42、43、44、53、66、8304等低危型[1]。高危型HPV病毒可通過基因整合等方式引起宮頸上皮細胞惡變，從而引起宮頸癌。E6/E7基因是HPV病毒的致癌基因，E6可通過泛素途徑降解抑癌基因P53，E7 通過抑制視網膜母細胞瘤蛋白(pRB)使細胞周期失控，抑制凋亡，從而誘發癌變[2]。因此定量檢測 HPV E6/E7 mRNA可了解宮頸上皮細胞內HPV病毒基因表達情況，本研究主要探討HPV基因分型對HPV E6/E7 mRNA表達的影響。

1　資料與方法

1.1研究對象2014年10月～2016年2月期間于皖南醫學院第一附屬醫院、第二附屬醫院婦產科因婦科炎癥，月經不調，陰道異常出血等原因就診，自愿接受HPV病毒基因分型檢測患者10 156例，其中接受HPV E6/E7 mRNA 檢測的HPV病毒感染患者共227例，204例感染高危型HPV病毒(HR-HPV)，23例感染低危型HPV病毒(LR-HPV)。排除標準：宮頸物理治療及手術史，妊娠，1周內陰道用藥，嚴重內科疾病，其他部位腫瘤。本研究獲得醫院倫理委員會批準，患者知情同意。

1.2實驗方法

1.2.1標本采集采用ThinPrep宮頸采樣器置于宮頸口與鱗柱上皮交界處，逆時針方向旋轉3圈，采集宮頸上皮細胞置于標本瓶中4℃保存。

1.2.2導流雜交法檢測HPV基因分型HPV DNA檢測采用PCR導流雜交方法,該方法可以檢測最常見的13種HR-HPV病毒(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型)及8種LR-HPV(HPV6、11、42、43、44、53、66、8304型)病毒。提取病毒DNA，經PCR擴增后導流雜交。21種(HPV)分型檢測試劑盒購于廣東凱普生物科技股份有限公司(中國，廣東)，嚴格按照說明書操作。

1.2.3支鏈DNA法檢測HPV E6/E7 mRNA載量支鏈DNA法是一種類似夾心法的核酸雜交檢驗方法,整個過程不需要提取mRNA和反轉錄PCR，可以直接檢測HPV mRNA。主要步驟：①裂解細胞。裂解宮頸上皮脫落細胞，釋放HPV病毒顆粒中的mRNA。 ②雜交捕獲mRNA。采用“三明治”核酸雜交法，捕獲探針和固定探針結合到HPV的基因組5-非翻譯區和E6和E7區域，將HPV mRNA固定于96孔平板底部。③信號放大。放大探針結合到預放大探針上形成支鏈DNA復合物，復合物末端有支鏈DNA探針標記的堿性磷酸酶，可產生化學發光檢測信號。④化學發光。堿性磷酸酶與底物結合，用Quanti VirusTM冷光檢測儀檢測標本的光子數，經過軟件轉換為拷貝數，拷貝數>0 為陽性。Quanti VirusTM宮頸穩態檢測試劑盒購于科蒂亞生物技術有限公司(中國，新鄉)，嚴格按照說明書操作。

1.3統計學方法計量資料以[M(P25,P75)]表示，兩組間年齡、HPV E6/E7 mRNA的比較用Mann-Whitney U檢驗。多因素回歸分析HPV基因型對HPV E6/E7 mRNA表達的影響，檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1HPV感染患者流行病學情況10 156例接受HPV病毒基因分型檢測患者中僅有1248例患者感染高危型HPV病毒(占12.3%)。204例感染HR-HPV患者中有114例患者HPV E6/E7 mRNA陽性(占55.9%)，90例為陰性(占44.1%)。23例感染低危型HPV病毒(LR-HPV)患者中有6例患者HPV E6/E7 mRNA陽性(占26.1%)，17例患者陰性(占73.9%)。120例HPV E6/E7 mRNA陽性患者中有114例HR-HPV患者(占95%)，而感染低危型HPV病毒患者僅6例(占5%)。

2.2高低危型HPV E6/E7 mRNA載量比較高危型HPV感染患者與低危型HPV感染患者年齡無統計學差異；HPV E6/E7 mRNA載量差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1高低危型HPV E6/E7 mRNA載量比較[M(P25,P75)]

高危型(n=204)低危型(n=23)ZP年齡/歲41(33,46)44(39,50)-1.798>0.05E6/E7mR-NA201.15(0.00,671.98)0.00(0.00,16.00)-2.869<0.05

2.3HPV基因分型對HPV E6/E7 mRNA載量的影響多因素回歸分析發現HPV52、HPV18、HPV45三個高危亞型可影響HPV E6/E7 mRNA載量(P<0.05),見表2。

表2HPV基因分型對HPV E6/E7 mRNA載量的影響

βSEtPβ95%置信區間HPV526936.2191571.2704.414<0.053841.234～10031.203HPV184551.1151231.5303.695<0.052125.327～6976.902HPV455178.9121438.9993.599<0.052344.466～8013.358

3　討論

HPV 基因分型檢測在宮頸癌篩查中發揮著巨大的作用，但90%患者 HPV 感染后可通過自身免疫清除，大多數檢測陽性患者僅是一過性、暫時性感染，且 HPV 感染到發生癌前病變和癌變需要5～10年，這是一個漫長的過程，只有極小部分患者才會發生宮頸癌變。因此，HPV 基因分型對預測宮頸上皮內瘤變及宮頸癌變無實質性意義，HPV 基因分型檢測對宮頸病變的預測過早，更無法判斷HPV病毒的活動程度，對宮頸病變進展也不能進行有效的評估[3]。王昕等[4]對本地區1107例宮頸病變患者檢測HPV 基因分型發現，僅有15.63%患者伴發高危HPV病毒感染，本研究的結果與其相似，發現僅有12.3%宮頸病變患者伴有高危HPV病毒感染，且高危型HPV病毒感染患者僅有55.9%患者伴發HPV E6/E7mRNA陽性；而44.1%患者僅僅為一過性感染，未發現HPV致癌基因的表達。而在低危型HPV病毒感染患者中僅有26.1%的患者伴有HPV E6/E7mRNA陽性，73.9%的患者僅僅是一過性的感染，暫不需要臨床干預。HPV E6、 E7 基因位于早期編碼區，是病毒的致癌基因，其表達產物E6、 E7 蛋白是宮頸上皮內瘤變和宮頸癌變的關鍵。E6蛋白可以降解p53蛋白，使細胞周期紊亂，進而導致惡性增殖，還可抑制細胞凋亡，使惡變的細胞持續增殖[5]。E7 蛋白可與pRB特異性結合，促進細胞分裂增殖，E7 蛋白還使細胞生長負向調節因子p27、p16失活，導致細胞周期紊亂，引起細胞增殖惡變。E6、 E7 蛋白還可與干擾素調節因子結合，影響免疫功能，導致病毒免疫逃逸。持續性的高危型HPV感染是宮頸癌變的主要病因，低危型HPV病毒感染主要引起尖銳濕疣等生殖道疾病[6-7]。本研究發現高危型HPV感染患者HPV E6/E7mRNA載量較低危型HPV病毒感染患者明顯增高，驗證了高危型HPV感染才是導致宮頸癌變的主要致病因素。Argyri E等提出HPV E6/E7mRNA可反映E6/E7基因表達情況，更能預測病情的進展[8]。本研究發現95%的HPV E6/E7mRNA陽性患者為高危型的HPV病毒感染患者，多因素回歸分析也提示高危型HPV52、HPV18和HPV45病毒可影響HPV E6/E7mRNA載量，而未發現低危型HPV病毒是HPV E6/E7mRNA表達的影響因素，提示HPV E6/E7mRNA的檢測可一定程度上反映HPV感染分型情況，有助于疾病的診斷和治療。宮頸組織中 E6/E7 mRNA 陽性，表明有HPV 感染且病毒致癌基因處于活動期，宮頸上皮細胞發生惡變的風險性較高，故對于高危型HPV 感染且 E6/E7 mRNA陽性的婦女應該給予治療。支鏈DNA 技術是一種核酸探針信號放大檢測技術，較傳統Real-Time PCR而言，敏感度和特異度更強，安全性好，且不需要PCR擴增，操作更方便，近年來用于HPV檢測，較傳統細胞學檢測、HPV 基因分型檢測特異度和陽性率更高[9]?？傊?，本研究通過多因素回歸分析HPV基因分型對HPV E6/E7 mRNA表達的影響，發現高危型HPV52、HPV18和HPV45病毒感染可影響HPV E6/E7 mRNA的表達，提示高危型HPV病毒感染進而促進宮頸惡性病變的發生和發展。本研究存在一些不足之處，如尚未完善組織病理學的檢查，對于HPV E6/E7 mRNA載量檢測在宮頸病變診斷及治療中的運用等仍需要進一步的研究。

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Human papillomavirus genotyping and HPV E6/E7 mRNA expression

ZHOU Hui,ZHANG Puhong,FENG Gang,ZHANG Dexuan,CHEN Miaohong,YONG Wei,SHUAI Zhaoxia,XU Yan,WU Jing

Clinical Laboratory,The Second Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Objective： To investigate the association of human papillomavirus (HPV) genotyping with HPV E6/E7 mRNA expression.Methods:Retrospective analysis was performed in 227 HPV infection cases received HPV E6 / E7 mRNA detection,including 204 cases of high-risk HPV types and 23 low-risk HPV types.HPV genotype was detected by PCR diversion hybridization,and HPV E6 / E7 mRNA loading were determined by branched DNA assay.Results:The HPV E6 / E7 mRNA loading in cervical epithelial cells was significantly increased in patients infected with high-risk HPV types[201.15(0.00,671.98)]compared to those infected with low-risk HPV types [0.00(0.00,16.00),P<0.05].Multiple regression analysis indicated that the HPV E6 / E7 mRNA loading was affected by HPV52(β=6936.219),HPV18(β=4551.115) and HPV45(β=5178.912) (P<0.05).Conclusion:Infection with the high-risk types of HPV52,HPV18 and HPV45 may lead to HPV E6 / E7 mRNA loading in cervical epithelial cells,and further result in the development of cervical malignancies.

cervical malignancies;human papilloma virus;E6/E7 mRNA;branched DNA

1002-0217(2016)05-0426-03

安徽省教育廳自然科學基金項目(KJ2016A737)

2016-03-04

周卉(1973-)，女，主管檢驗師，(電話)13956172028，(電子信箱)1340954280@qq.com；

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A

10.3969/j.issn.1002-0217.2016.05.005

吳競，男，主管檢驗師，(電子信箱)wjwjwj1973@126.com，通信作者.