基于HPLC的蘇丹紅檢測中光學誘導異構現象的探究

邵明華,江晨舟,張馳中,傅佳萍,王利娟

(上海安譜實驗科技股份有限公司,上海 201608)

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基于HPLC的蘇丹紅檢測中光學誘導異構現象的探究

邵明華,江晨舟*,張馳中,傅佳萍,王利娟

(上海安譜實驗科技股份有限公司,上海 201608)

采用島津LC-20AB液相色譜儀,SPD-M20A二極管陣列檢測器,CNW Athena C18-WP(4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱,柱溫為30 ℃,以乙腈-水(體積比為88∶12)為流動相,進行等度洗脫,流速為1.0 mL/min,在500 nm處對蘇丹紅Ⅰ-Ⅳ進行分析,并深入研究了其光學誘導異構現象。研究結果表明:蘇丹紅Ⅰ-Ⅳ在0.10～20.00 mg/L的濃度范圍內均有良好的線性關系,相關系數為1.0000;蘇丹紅Ⅰ和Ⅱ不能發生光學誘導異構,蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ能夠發生光學誘導異構;蘇丹紅光學誘導異構是一個可逆的變化,在沒有光照的情況下可以發生逆轉;蘇丹紅標準溶液比固體的蘇丹紅標準品更易發生光學誘導異構;在0～60 ℃的溫度范圍內,溫度的變化對蘇丹紅光學誘導異構的影響不大;光照對蘇丹紅的光學誘導異構有顯著影響,影響程度為棕色進樣瓶>日光照射=7 W節能燈照射;濃度對蘇丹紅的光學誘導異構也有顯著影響,濃度越高,異構趨于穩定的時間越長,在0.50～20.00 mg/L的濃度范圍內,蘇丹紅Ⅲ異構平衡時的異構率為5.324%～5.787%,蘇丹紅Ⅳ異構平衡時的異構率為5.121%～5.507%。該研究對蘇丹紅檢測方法的研究和應用具有重要的參考價值。

HPLC,蘇丹紅,光學誘導異構

蘇丹紅是一類人工合成的脂溶性偶氮染料,包括蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4種類型,其結構式如圖1所示。蘇丹紅主要作為工業染料被用于紡織品、橡膠、塑料、油漆等的著色[1]。由于蘇丹紅處理過的食品顏色鮮艷且不易褪色,一些不法食品企業會把它添加到食品中,這種行為已被我國及歐盟等國家嚴令禁止。研究表明,蘇丹紅可以通過多種途徑接觸人體,并透過生物膜進入血液,再隨血液循環分散到全身各組織細胞,進入體內的蘇丹紅代謝產物主要為胺類及萘酚類物,具有潛在的致癌性、遺傳毒性及致敏性[2-3],因此檢測相關產品中蘇丹紅的含量,預防其對人體可能造成的傷害具有重要的意義。目前,蘇丹紅的檢測方法有分光光度法[4]、薄層色譜法[5-6]、電化學法[7]、酶聯免疫法[8]、液相色譜法[9-14]、氣相色譜-質譜聯用法[15-16]、液相色譜-質譜聯用法[17-18]及毛細管電泳法[19]等,這些方法的靈敏度、選擇性和分析通量存在差異,但國際上對蘇丹紅的檢測方法主要還是高效液相色譜法(HPLC)。近幾年對蘇丹紅的檢測有一些新的發現,出現了一些關于檢測到蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ分別有兩個色譜峰的“多峰”現象的報道[20],并將出峰時間較早的峰稱為“快峰”,出峰時間較晚的峰稱為“慢峰”,認為“快峰” 是蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ的異構體[20]。多峰現象可以用異構體的原理來解釋,根據蘇丹紅的結構特征,其異構體的產生理論上包括三種形式:光學誘導異構、質子異變異構和旋轉異構,本文主要對蘇丹紅的光學誘導異構現象進行了探究,這對于蘇丹紅檢測方法的研究和應用具有重要的參考價值。

圖1　蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的結構式Fig.1　Structure formula of Sudan Ⅰ～Ⅳ

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ標準品、HPLC級乙腈、丙酮、水上海安譜實驗科技股份有限公司。

LC-20AB液相色譜儀配有SPD-M20A二極管陣列檢測器日本島津公司;XS105DU天平瑞士梅特勒公司。

1.2實驗方法

1.2.1高效液相色譜條件色譜柱:CNW Athena C18-WP(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相:乙腈-水(體積比為88∶12),流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量10.0 μL;檢測波長500 nm。

1.2.2標準曲線的繪制分別稱取蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ標準品各10 mg(精確到0.0001 g),用適量的丙酮溶解后用乙腈稀釋成濃度為0.10、0.50、1.00、5.00、20.00 mg/L的標準溶液。各取10.0 μL標準溶液進行HPLC檢測,根據保留時間,以峰面積對蘇丹紅的濃度作圖,繪制標準曲線。

1.2.3蘇丹紅光學誘導異構實驗設計取蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的標準品,采用即用即配的方式制備三組濃度為5.00 mg/L的混標(制備過程中用錫箔紙包裹以避光),再按照以下方式處理:第一組避光6 h后按照設定的色譜條件進行HPLC檢測;第二組光照6 h后進行HPLC檢測;第三組先光照6 h,然后用鋁箔紙包裹避光24 h,再進行HPLC檢測。另外,分別配制濃度為5.00 mg/L的蘇丹紅III標準溶液和蘇丹紅Ⅳ標準溶液,光照6 h后進行HPLC檢測,并對兩種溶液HPLC檢測中出現的快峰和慢峰進行全波段掃描,繪制光譜圖。

1.2.4蘇丹紅譜圖中雜質峰的確認配制濃度為1.00、5.00、20.00 mg/L的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的混標,于光照下分別暴露0、6、12、24、36、48、60 h后進行HPLC檢測。

1.2.5蘇丹紅標準品處理方式對光學誘導異構的影響對蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的標準品,采用三種方式處理:第一組即用即配,制備濃度為20.00 mg/L的混標,即時進行HPLC檢測;第二組與第一組一樣,先配制20.00 mg/L的混標,然后將之盛放在2 mL的透明進樣瓶中光照12 h,再進行HPLC檢測;第三組先將蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的標準品分別光照12 h,然后稱樣配成20.00 mg/L的混標,再進行HPLC檢測。

1.2.6溫度對蘇丹紅光學誘導異構的影響將5.00 mg/L的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的混標在0、25、40、50、60 ℃下光照24 h后進行HPLC檢測。

1.2.7進樣瓶對蘇丹紅光學誘導異構的影響將20.00 mg/L的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的混標分別盛放于2 mL的棕色進樣瓶和透明進樣瓶中,光照20 h后進行HPLC檢測。

1.2.8光照方式對蘇丹紅光學誘導異構的影響選擇日光照射和7 W節能燈照射兩種光照方式對1.00 mg/L的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的混標光照12 h,再進行HPLC檢測。

1.2.9濃度對蘇丹紅光學誘導異構的影響配制0.10、0.50、1.00、5.00、20.00 mg/L的蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ的混標,分別光照0、3、6、12、24、36、48、60 h后進行HPLC檢測,并根據異構情況計算光學異構率,光學異構率(%)=光學異構后快峰峰面積/異構前的原主峰峰面積×100。

2　結果與分析

2.1標準曲線的建立

HPLC檢測結果表明:在設定的色譜條件下,蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ都有較好的出峰和響應,基線較平,出現基線波動的位置,其波峰的峰高都低于3倍基線噪音,故不予定性和定量考慮。根據色譜檢測結果,以峰面積y對蘇丹紅的濃度x做標準曲線,經過回歸分析,4種蘇丹紅標準品在0.10～20.00 mg/L的濃度范圍內均有良好的線性關系,其線性相關系數均為1.0000。四種蘇丹紅的回歸方程和相關系數如表1所示。

表1　蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的回歸方程和線性相關系數

圖2　不同處理方式下5.00 mg/L的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的混標HPLC色譜圖Fig.2　HPLC chromatogram of 5.00 mg/L Sudan Ⅰ～Ⅳ mixed standard solution under different treatments 注:(a)避光6 h;(b)光照6 h;(c)光照6 h再避光24 h。

2.2蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ光學誘導異構實驗驗證

由圖2a結合單標定性結果可知,在設定的色譜條件下,避光處理6 h的蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ出峰效果較好,出峰時間分別為5.498、9.074、13.211、23.481 min,分離度達到要求,能夠進行定性和定量檢測。對比光照處理圖2b和避光處理圖2a的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ混標的圖譜發現,光照6 h后色譜圖中多了兩個色譜峰,參考M?lder K[20]的叫法,將其稱為“快峰”。單標定性結果表明:出峰時間為5.273 min的峰為蘇丹紅Ⅲ的快峰,出峰時間為7.843 min的峰為蘇丹紅Ⅳ的快峰。相應的,將出峰時間為13.211 min的峰稱為蘇丹紅Ⅲ的慢峰,出峰時間為23.481 min的峰稱為蘇丹紅Ⅳ的慢峰。蘇丹紅Ⅰ和Ⅱ的出峰情況沒有變化,可能沒有發生光學誘導異構,或異構量太少低于儀器的檢測限。對比圖2c和圖2b發現,將光照處理6 h后的蘇丹紅再避光24 h后,色譜圖中的兩個快峰又都全部消失了。這就初步得出了蘇丹紅光學誘導異構現象的存在。為了進一步檢驗快峰、慢峰各自的性質,對蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ的快峰、慢峰分別進行了全波段光譜掃描,結果如圖3、圖4所示。根據光譜圖分析可知蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ各自的快峰和慢峰在190～800 nm全波段中的光強度吸收特征保持一致,在基于HPLC水平下可以初步判斷兩者結構與官能團相似。綜合以上的實驗結果,并結合光學誘導異構的反應機理,可以判定蘇丹紅的多峰現象是因為發生了光學誘導異構,出現的快峰是異構時慢峰的產物,在現有的分析條件下認為蘇丹紅Ⅰ和Ⅱ不能發生光學誘導異構,只有蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ能夠發生光學誘導異構,蘇丹紅的光學誘導異構是一個可逆的變化,在沒有光照的情況下可以發生逆轉。

圖3　蘇丹紅Ⅲ快峰(a)和慢峰(b)的光譜圖Fig.3　Spectrogram of fast peak(a)and slow peak(b)of Sudan Ⅲ

圖4　蘇丹紅Ⅳ快峰(a)和慢峰(b)的光譜圖Fig.4　Spectrogram of fast peak(a)and slow peak(b)of Sudan Ⅳ

2.3蘇丹紅譜圖中雜質峰的確定

進行HPLC分析時發現在不同的實驗條件下,6.968 min總會形成一個色譜峰,為了確定其對蘇丹紅的光學誘導異構是否有影響,對1.00、5.00、20.00 mg/L的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的混標進行了不同時間的光照處理后進行色譜分析,結果發現:當蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的混標的濃度為1.00 mg/L時,光照處理不同的時間后,此峰的面積大都在0.006 mAu·min左右(圖5);當蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的混標的濃度為5.00 mg/L時,光照處理不同的時間后,此峰的面積大都在0.03 mAu·min左右(圖5);當蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的混標的濃度增加到20.00 mg/L時,光照處理不同的時間后,此峰的面積大都在0.12 mAu·min左右(圖5)。由此可以看出,該峰的面積與光照時間沒有關系,而只與蘇丹紅的濃度呈正相關。M?lder K也有類似的發現,并認為此峰是一個未確定的雜質峰[20],因此該峰對蘇丹紅光學誘導異構的研究影響不大。

2.4蘇丹紅標準品處理方式對光學誘導異構的影響

由圖6a可知,20.00 mg/L即用即配的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的混標沒有發生光學誘導異構;而配好后在透明進樣瓶中光照12 h的混標發生了光學誘導異構(圖6b),蘇丹紅Ⅲ的異構率為3.016%,蘇丹紅Ⅳ的異構率為2.902%;將固體蘇丹紅標準品先光照12 h,再配制的20.00 mg/L的混標也發生了光學誘導異構(圖6c),不過蘇丹紅III的異構率僅有0.543%,蘇丹紅Ⅳ的異構率僅有0.521%。這表明蘇丹紅標準溶液比固體的蘇丹紅標準品更容易發生光學誘導異構,可能是因為蘇丹紅標準品為固體,分子排列比較緊湊,接受光照的面積相對較小,而配成溶液后,蘇丹紅分子在溶液中分散比較均勻,能夠充分得接受光照,因而光誘導異構更容易發生。

圖6　不同處理方式的蘇丹紅標準品HPLC色譜圖Fig.6　HPLC chromatogram of Sudan under different treatments注:(a)20.00 mg/L即用即配的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的混標;(b)20.00 mg/L光照12 h的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的混標;(c)蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的標準品光照12 h后配制的20.00 mg/L的混標。

2.5溫度對蘇丹紅光學誘導異構的影響

由圖7和表2可知5.00 mg/L的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的混標在不同溫度下光照24 h后光學誘導異構量(以快峰的面積計)并沒有隨著環境溫度的下降或升高而產生很大的變化,因此可以認為蘇丹紅這類物質的熱敏性較低,溫度的變化對其光學異構的發生基本上沒有影響。

圖7　不同溫度下5.00 mg/L的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的混標光照24 h后的HPLC色譜圖Fig.7　HPLC chromatogram of 5.00 mg/L Sudan Ⅰ～Ⅳ mixed standard solution after illumination 24 h at different temperature

溫度(℃)蘇丹紅Ⅲ快峰面積(mAu·min)蘇丹紅Ⅳ快峰面積(mAu·min)00.2520.198250.2500.200400.2530.203500.2530.203600.2540.205

2.6進樣瓶對蘇丹紅光學誘導異構的影響

由圖8可知,盛放在棕色和透明進樣瓶中的20.00 mg/L的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的混標光照20 h后都發生了光學誘導異構現象,但異變程度不同:棕色進樣瓶中蘇丹紅的光學誘導異構量為蘇丹紅Ⅲ的快峰0.298 mAu·min,蘇丹紅Ⅳ的快峰0.304 mAu·min;透明進樣瓶中蘇丹紅的光學誘導異構量為蘇丹紅Ⅲ的快峰0.573 mAu·min,蘇丹紅Ⅳ的快峰0.524 mAu·min。產生異變差異的原因可能由于棕色進樣瓶透光性不及透明進樣瓶好,因而所盛蘇丹紅溶液的光學誘導異構量低于透明進樣瓶,但棕色進樣瓶并不能完全隔絕光照,因而并不能避免光學誘導異構現象的發生。

圖8　不同進樣瓶盛裝的20.00 mg/L的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的混標光照20 h后的HPLC色譜圖Fig.8　HPLC chromatogram of 20.00 mg/L SudanⅠ～Ⅳ mixed standard solution placed in different vial after illumination 20 h注:(a)棕色進樣瓶;(b)透明進樣瓶。

2.7光照方式對蘇丹紅光學誘導異構的影響

實際生活中添加蘇丹紅的基質樣品大都曝露于室外日光以及室內燈光下,且連續光照時間受室外日夜交替以及室內作息時間的影響,多數情況下光照時間一般不超過12 h,所以考察日光照射和節能燈光照射12 h后蘇丹紅光學誘導異構的變化情況具有重要的意義。

由圖9可以看出,日光和7 W的節能燈照射12 h后,1.00 mg/L的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ混標的光學誘導異構量相差不多,具體變化情況為:日光照射12 h后蘇丹紅的光學誘導異構量為蘇丹紅Ⅲ的快峰0.050 mAu·min,蘇丹紅Ⅳ的快峰0.043 mAu·min;7 W節能燈照射12 h后蘇丹紅的光學誘導異構量為蘇丹紅III的快峰0.048 mAu·min,蘇丹紅Ⅳ的快峰0.040 mAu·min?？梢娫谙嗤臈l件下,兩種光照方式誘發蘇丹紅產生光學誘導異構的效應比較接近。

圖9　不同光照方式處理的1.00 mg/L的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的混標HPLC色譜圖Fig.9　HPLC chromatogram of 1.00 mg/L Sudan Ⅰ～Ⅳ mixed standard solution under different light treatments注:(a)日光照射12 h;(b)7 W節能燈照射12 h。

2.8濃度對蘇丹紅光學誘導異構的影響

由于0.10 mg/L的蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ的混標濃度較低,加上HPLC檢測限的限制,導致光學誘導異構的異構量難以準確定量,所以僅對0.50 mg/L以上的4個濃度的蘇丹紅混標進行光學誘導異構量的分析。由圖10可知,各濃度的蘇丹紅光學誘導異構量都呈現先增加后穩定的變化趨勢,低濃度時(0.50、1.00 mg/L)的蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ的混標在連續光照12 h后光學誘導異構量開始穩定,高濃度時(5.00、20.00 mg/L)的蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ的混標在連續光照24 h后才趨于穩定,這說明蘇丹紅光學誘導異構平衡的時間和其濃度有關,濃度越高達到平衡所需要的時間越長。

圖10　不同濃度的蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ的混標在不同光照時間下的光學誘導異構量Fig.10　Optical induced heterogeneous quantity of different concentration of Sudan Ⅲ and Ⅳ mixed standard solution at different illumination times

異構范圍在實際的生活和檢測工作中具有重要的應用價值。雖然蘇丹紅在不同的濃度和光照時間下的異構量不同,但在光學誘導異構平衡時的異構率卻比較接近,研究表明0.50～20.00 mg/L的蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ的混標在光學異構達到平衡時蘇丹紅Ⅲ的異構率為5.324%～5.787%,蘇丹紅Ⅳ的異構率為5.121%～5.507%。

3　結論

高效液相色譜法對蘇丹紅分析結果表明:蘇丹紅混標在光照后色譜圖中會有兩個快峰出現,光譜掃描證明兩個快峰分別是由蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ異構產生,即蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ會產生光學誘導異構,蘇丹紅Ⅰ和Ⅱ不會產生光學誘導異構,發生光學誘導異構的蘇丹紅在避光24 h后異構部分會發生逆轉;蘇丹紅標準溶液比固體蘇丹紅標準品更易發生光學誘導異構;溫度的變化對蘇丹紅光學誘導異構的影響很小;棕色進樣瓶只能在一定程度上抑制光學誘導異構的發生,但不能完全避免;日光和7 W的節能燈誘發蘇丹紅產生光學誘導異構的效應幾乎相同;在一定的時間內,蘇丹紅光學誘導異構量會隨光照時間的增加而增加,但最終會達到一個穩定值,濃度越高達到平衡所需要的時間越長,0.50、1.00 mg/L的蘇丹紅在光照12 h后異構趨于穩定,5.00、20.00 mg/L的蘇丹紅在光照24 h后異構趨于穩定;無論濃度高低,0.50、1.00、5.00、20.00 mg/L的蘇丹紅Ⅲ和Ⅳ在光學異構達到平衡時的異構率都比較接近,蘇丹紅Ⅲ光學異構平衡時的異構率為5.324%～5.787%,蘇丹紅Ⅳ光學異構平衡時的異構率為5.121%～5.507%。

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Study on optical induced heterogeneous phenomenon of Sudan based on HPLC detection

SHAO Ming-hua,JIANG Chen-zhou*,ZHANG Chi-zhong,FU Jia-ping,WANG Li-juan

(ANPEL Scientific Instrument(Shanghai)Co.,Ltd.,Shanghai 201608,China)

Determination and optical induced heterogeneous phenomenon of Sudan was studied using a Shimadzu LC-20AB liquid chromatograph equipped with a SPD-M20A diode array detector. Chromatographic separations were performed using a CNW Athena C18-WP(4.6 mm×150 mm,5 μm)column,the column temperature was 30 ℃. The mobile phase consisted of acetonitrile-water(88∶12 by volume)and was delivered at a flow rate of 1.0 mL/min with equivalent elution. The detection wave length was 500 nm. The results showed that Sudan Ⅰ-Ⅳ were linear within a range of 0.10～20.00 mg/L,and the correlation coefficient was 1.0000. Sudan Ⅰ and Ⅱ could not occur optical induced heterogeneous phenomenon,but Sudan Ⅲ and Ⅳ could. Optical induced heterogeneous of Sudan was a reversible change,and it could be reversed when there was no illumination condition. Sudan standard solution was more easily to occur optical induced heterogeneous than solid Sudan standard. Temperature had little effect on optical induced heterogeneous of Sudan in the range of 0～60 ℃. Illumination had a significant effect on optical induced heterogeneous phenomenon of Sudan,the degree was brown vial>sunlight=7 W energy saving light. Concentration of Sudan also had a significant impact on its optical induced heterogeneous phenomenon. The higher the concentration,the longer the time that heterogeneous tended to stable needed. Within the range of 0.50～20.00 mg/L,optical induced heterogeneous rate of Sudan III was 5.324%～5.787% in the state of heterogeneous balance,and Sudan Ⅳ was 5.121%～5.507% under that condition. The study had important reference value in research and application of Sudan detection methods.

HPLC;Sudan;optical induced heterogeneous

2016-02-26

邵明華(1968-)，男，本科，研究方向：分析化學，E-mail：shaominghua@anpel.com.cn 。

江晨舟(1983-)，男，碩士，研究方向：分析化學，E-mail：brucehom@126.com。

TS201.2

A

1002-0306(2016)17-0142-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.019