超聲輔助提取條件對紅曲米中桔霉素提取效果的影響

楊　強,岳建明,王雨晨,尹　勝,張　嬋,王成濤,3,*

(1.北京工商大學 北京市食品添加劑工程技術研究中心,北京 100048;2.食品營養與人類健康北京高精尖創新中心,北京 100048;3.食品質量與安全北京實驗室,北京 100048)

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超聲輔助提取條件對紅曲米中桔霉素提取效果的影響

楊強1,2,岳建明1,王雨晨1,尹勝1,2,張嬋1,2,王成濤1,2,3,*

(1.北京工商大學 北京市食品添加劑工程技術研究中心,北京 100048;2.食品營養與人類健康北京高精尖創新中心,北京 100048;3.食品質量與安全北京實驗室,北京 100048)

以紅曲米為原料,研究了超聲輔助法提取紅曲米中桔霉素的影響因素。在單因素的實驗基礎上,利用響應面法優化了桔霉素的提取工藝參數,建立了二次回歸模型,得到提取工藝的最佳條件:超聲功率213.54 W,超聲時間20.76 min,超聲溫度60.57 ℃。最佳工藝條件下,桔霉素含量的理論值為12.354 mg/kg,最終驗證的結果為12.375 mg/kg,誤差僅0.17%,表明該工藝參數可信度較高,模型可較好的預測桔霉素的提取量。

紅曲米,桔霉素,超聲提取,響應面

紅曲是我國傳統食用色素,在我國已有千年食用歷史。紅曲作為一種藥食兩用品,作為著色劑廣泛應用于食品、藥品、化妝品等行業,現代醫學研究表明,紅曲具有降低膽固醇、降血壓、降血脂等營養功效[1-2]。1995年,BLANC等[3]首次報道,紅曲霉次級代謝產物中含有一種較強致癌、致突變作用的真菌毒素-桔霉素,紅曲安全性引起世界各國的重視。目前,紅曲發酵生產過程中常伴隨產生桔霉素已嚴重影響到紅曲產品安全,成為限制我國紅曲產品出口的瓶頸問題,亟待解決。

目前對于桔霉素的檢測方法主要包括[4-9]:高效液相色譜(質譜)法、薄層層析法、酶聯免疫法、毛細管色譜法和抑菌圈法等。然而,這些方法存在一個共同的缺陷就是對于樣品的前處理方法不統一,溶劑浸提法、超聲萃取、震蕩、大孔樹脂及微波萃取法等處理均有文獻報道[10-12],桔霉素前處理的方法多樣且差別較大。因此,高效、準確統一的樣品前處理方法對于桔霉素檢測具有重要意義。Liu、靳賽、Pattanagul、王雅芬、Wang等[13-17]在提取紅曲米中桔霉素時采用的提取方法、提取溶劑、提取時間、提取順序方面均存在差異,因此即使處理的樣品種類一致,但結果依然存在一定差異。目前國際對紅曲米及其相關產品中桔霉素檢測的前處理沒有統一標準,制定統一桔霉素檢測的前處理提取方法,對于解決國際爭端也有積極意義。

超聲輔助提取具有提取時間短、效率高等優點,因此被廣泛應用于天然產物的提取中[18-19]。本文將超聲技術應用于紅曲米中桔霉素提取(檢測前處理),重點研究了有機溶劑、配比、料液比、超聲溫度、超聲時間和超聲功率對桔霉素提取效果的影響,并通過響應面設計優化桔霉素提取條件,尋求紅曲米中桔霉素提取的快捷、高效方法,以期為桔霉素檢測提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

紅曲粉半夏科技有限公司;甲醇、乙腈(色譜純)賽默飛世爾科技(北京)有限公司;桔霉素標品(純度≥98%)sigma公司;甲酸、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、丙醇、氯仿、四氯化碳(以上試劑均為分析純)西隴化工股份有限公司。

KQ-300DE型數控超聲波清洗機昆山市超聲儀器有限公司;R201型旋轉蒸發器上海申勝生物科技有限公司;FW-80微型高速粉碎機北京中興偉業有限公司;BSA224S電子天平塞多利斯科學儀器(北京)有限公司;TGL-10C高速臺式離心機上海安亭科學儀器廠;LC-20AT高效液相色譜日本島津公司。

1.2實驗方法

1.2.1紅曲米粉的制備紅曲米干燥后采用FW-80微型高速粉碎機研磨成粉待用。

1.2.2桔霉素的測定采用HPLC法[20]。YMC-Triart C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm);熒光檢測器的激發波長為λex=331 nm,發射波長λem=500 nm;乙腈∶水(磷酸調pH 2.5)=35∶65作為流動相;28 ℃柱溫;1.2 mL/min流速;10 μL進樣量。用甲醇溶解、稀釋制備20 mg/L桔霉素標準品儲備溶液,4 ℃保存。甲醇稀釋儲備液配置0.05～12 mg/L桔霉素溶液,HPLC檢測,以峰面積與桔霉素濃度進行線性回歸。

1.2.3因素條件對桔霉素提取效果的影響

1.2.3.1提取溶劑對桔霉素提取效果的影響稱取0.500 g紅曲米粉樣品,分別用甲苯、乙酸乙酯、甲酸、甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、氯仿、四氯化碳等溶劑按照一定體積配比提取紅曲米粉中桔霉素,提取溫度60 ℃,超聲功率210 W,料液比1∶20(g/mL),提取時間30 min。提取液經旋轉蒸發儀濃縮至干,用甲醇復溶過0.45 μm有機濾膜,濾液上機測定桔霉素含量。

1.2.3.2料液比對桔霉素提取效果的影響稱取0.500 g紅曲米粉樣品,分別以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 (g/mL)的料液比混合均勻。超聲功率210 W,提取溫度60 ℃,提取時間30 min。提取液經旋轉蒸發儀濃縮至干,用甲醇復溶過0.45 μm有機濾膜,濾液上機測定桔霉素含量。

1.2.3.3超聲溫度對桔霉素提取效果的影響稱取0.500 g紅曲米粉樣品,分別將超聲提取溫度設為30、40、50、60、70、80 ℃。超聲功率210 W,料液比1∶20(g/mL),提取時間30 min。提取液經旋轉蒸發儀濃縮至干,用甲醇復溶過0.45 μm有機濾膜,濾液上機測定桔霉素含量。

1.2.3.4超聲功率對桔霉素提取效果的影響稱取0.500 g紅曲米粉樣品,分別將超聲功率設為120、150、180、210、240、270 W。提取溫度60 ℃,料液比1∶20,提取時間30 min。提取液經旋轉蒸發儀濃縮至干,用甲醇復溶過0.45 μm有機濾膜,濾液上機測定桔霉素含量。

1.2.3.5超聲時間對桔霉素提取效果的影響稱取0.500 g紅曲米粉樣品,分別超聲提取5、10、20、30、40、50 min。超聲功率210 W,料液比1∶20,提取溫度60 ℃。提取液經旋轉蒸發儀濃縮至干,用甲醇復溶過0.45 μm有機濾膜,濾液上機測定桔霉素含量。

1.2.4響應面優化桔霉素提取條件通過單因素實驗確定影響較顯著的實驗因素與水平。利用軟件Design Expert8.0.6中的Box-Behnken中心組合設計,見表1。對數據進行回歸分析,擬合得到二次多項回歸模型,并對此回歸模型進行方差分析,繪制多元回歸方程的響應面及其等高線。通過該組動態圖對任意兩因素之間交互影響的效應進行分析和評價,確定最佳水平范圍,進而得到最優超聲提取桔霉素的工藝參數[21]。

表1　響應面分析實驗因素水平表

2　結果與討論

2.1桔霉素標準曲線繪制

在1.2.2色譜條件HPLC檢測桔霉素含量。以桔霉素濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,建立標準曲線,得到回歸方程:y=1338586.204574x+112192.854990,R2=0.998819。

圖1　桔霉素標準曲線Fig.1　Citrinin with standard curve

表2　不同溶劑及體積配比對紅曲米粉中桔霉素提取效果的影響

2.2因素條件對超聲輔助提取紅曲米粉樣品中桔霉素效果的影響

2.2.1溶劑對紅曲米粉樣品中桔霉素提取效果的影響本文實驗了不同的提取溶劑及配比對紅曲米粉中桔霉素提取效果的影響,實驗結果如表2所示,最終驗證了以甲苯-乙酸乙酯-甲酸體積比7∶3∶1為提取劑所得的桔霉素含量最高,這與許贛榮[22]的實驗提取溶劑一致。

2.2.2料液比對紅曲米粉樣品中桔霉素提取效果的影響由圖2可知,當料液比由1∶10提升到1∶20后桔霉素的提取量上升,但隨著溶劑量的增加桔霉素的含量并沒有繼續上升,反而呈現平緩下降趨勢,分析可能當料液比為1∶10時提取溶劑量少因此對紅曲米粉的提取不夠充分,而當提取溶劑量多時紅曲米粉與溶劑的混合并不完全,因此桔霉素的含量反而降低。

圖2　料液比對紅曲米粉樣品中桔霉素提取率的影響Fig.2　Influence of solid-liquid ratio on the extraction of Citrinin

2.2.3溫度對超聲輔助提取紅曲米粉樣品中桔霉素效果的影響由圖3可知,在30～60 ℃范圍內,隨著溫度的提高,提取液中桔霉素的含量逐漸提高。當超聲溫度為60 ℃時,桔霉素的含量最高,隨著溫度繼續提升,桔霉素的含量卻開始降低,分析可能由于超聲波產生的熱效應導致紅曲米粉末中的色素成分與桔霉素的結構特性一同受到不利影響所致[22],因此出現含量下降的現象。由此可知在提取紅曲色素和紅曲桔霉素時,提取溫度不宜設置過高,適宜的溫度不僅節約能源而且利于提取充分。

圖3　超聲溫度對桔霉素提取效果的影響Fig.3　Influence of ultrasonic temperature on the extraction of Citrinin

2.2.4超聲功率對紅曲米粉樣品中桔霉素提取效果的影響在120～210 W范圍內,隨著超聲功率的增大,提取液中桔霉素的含量逐漸提高,如圖4所示。當超聲功率為210 W時,桔霉素的含量最高,繼續提高超聲功率,桔霉素的含量卻開始降低。這可能是由于超聲功率過高,產生的空化作用使體系中聚集了一部分非色素顆粒[23],這些顆粒不僅可能對色素產生吸附,對桔霉素也產生了一定的吸附作用,因此不利于桔霉素的提取完全,從而造成桔霉素含量降低。

圖4　超聲功率對桔霉素提取效果的影響Fig.4　Influence of ultrasonic power on the extraction of Citrinin

2.2.5超聲時間對紅曲米粉樣品中桔霉素提取效果的影響圖5可知,在超聲時間為5～50 min時,隨著超聲時間延長,桔霉素提取率逐漸提高。當超聲20 min時,桔霉素含量基本達到較高水平,繼續延長超聲時間,對桔霉素提取率影響不大。分析可能是隨著超聲時間延長,超聲波產生的熱效應及空化作用抑制了溶劑體系正常的滲透壓及蒸汽壓,不利于桔霉素提取。LIU等[10]在檢測紅曲米中桔霉素含量時前處理采用50%乙醇,料液比1∶5,超聲20 min;WANG等[14]在采用乙醇∶水體積比70∶30,40 ℃超聲30 min,再200 r/min震蕩1.5 h,進行紅曲米中桔霉素提取。

圖5　超聲時間對桔霉素提取效果的影響Fig.5　Influence of ultrasonic time on the extraction of Citrinin

2.3紅曲米粉樣品中桔霉素提取條件的響應面設計優化

2.3.1響應面實驗設計結果在以上因素條件對超聲輔助提取桔霉素效果的基礎上,選擇對桔霉素提取率影響最為顯著的3個因素:超聲功率(A)、超聲時間(B)和超聲溫度(C),根據Design Expert 8.0.6的中心組合實驗設計原理,以桔霉素含量為響應值,進行響應面優化設計實驗(表1),結果見表3。

表3　Design Expert實驗設計及結果

表4　桔霉素含量回歸模型方差分析

2.3.2回歸方程的方差分析Design Expert 8.0.6軟件對表3的桔霉素含量數據進行回歸分析,擬合得到二元回歸方程:桔霉素含量=12.30+0.42A+0.51B+0.30C-1.36AB-0.48AC-0.90BC-1.25A2-2.00B2-1.52C2,對此回歸模型進行方差分析,其結果見表4。

2.3.3響應面分析與優化多元回歸方程的響應面及其等高線見圖6～圖8。通過該組動態圖即可對任意兩因素之間交互影響的效應進行系統直觀的分析和評價,并從中確定最佳水平范圍。響應面是響應值對各實驗因素所構成的三維空間曲面圖,實驗因素對實驗結果影響越大,曲面越陡峭。等高線的形狀可以反映兩兩因素之間交互作用的顯著程度。圓形表示兩因素交互作用不顯著,而橢圓形則表示交互作用顯著[23]。

圖6　超聲功率和超聲時間交互作用的響應面Fig.6　Response surface of ultrasonic power and time

圖7　超聲功率和超聲溫度交互作用的響應面Fig.7　Response surface of ultrasonic power and temperature

圖8　超聲溫度和超聲時間交互作用的響應面Fig.8　Response surface of ultrasonic time and temperature

由圖6～圖8的立體響應面圖及其投影等高線可直觀的看出,超聲功率與超聲時間、超聲溫度兩兩間的交互作用顯著,曲線較陡。根據Box-Behnken實驗得到的結果和二次多項回歸方程,利用Design Expert8.0.6軟件獲得了提取桔霉素含量最高時各因素的最佳參數條件:超聲功率213.54 W,超聲時間20.76 min,超聲溫度60.57 ℃。在此優化條件下,桔霉素的含量理論值為12.354 mg/kg?？紤]到儀器的實際操作狀態,在超聲功率210 W,超聲時間21 min,超聲溫度60 ℃的條件下,驗證實驗重復5次,實驗結果分別為12.156、12.632、12.366、12.117、12.603 mg/kg,最終驗證的結果為12.375 mg/kg,與理論預測值誤差僅0.17%。相同的樣品及提取溶劑,在60 ℃溫度下放置21 min后的桔霉素提取含量為6.95 mg/kg,在常溫下超聲21 min的桔霉素提取含量為8.03 mg/kg。本實驗所得提取條件下的桔霉素提取含量較二者分別提高78.06%和54.11%。

3　結論

研究了超聲輔助提取條件對紅曲米中桔霉素提取效果的影響,并通過響應面設計優化桔霉素提取條件。結果表明,甲苯-乙酸乙酯-甲酸體積比7∶3∶1、料液比1∶20 (g/mL)時,其桔霉素提取率最高,超聲功率、超聲時間和超聲溫度對桔霉素提取率的影響顯著。響應面設計優化實驗,獲得桔霉素提取最佳參數條件為:超聲功率213.54 W,超聲時間20.76 min,超聲溫度60.57 ℃。在微調整后的條件下,驗證實驗重復5次,桔霉素檢測值平均值為12.38 mg/kg,與理論預測值(12.35 mg/kg)誤差僅0.17%。本文采用超聲技術提取紅曲米中桔霉素,并首次較為系統的研究了溶劑配比、料液比、超聲溫度、超聲時間和超聲功率對提取紅曲米中桔霉素的影響,響應面法優化得到了最佳提取前處理條件,相較于復雜的提取步驟,本實驗結論操作簡單、提取效果明顯且用時經濟,這將為紅曲米中桔霉素的檢測及食品安全檢測提供科學依據。

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Effect of ultrasound-assisted conditions on the extraction of citrinin from red kojic rice

YANG Qiang1,2,YUE Jian-ming1,WANG Yu-chen1,YIN Sheng1,2,ZHANG Chan1,2,WANG Cheng-tao1,2,3，*

(1.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China; 2.Beijing Innovation Centre of Food Nutrition and Human Health,Beijing 100048,China; 3.Beijing Laboratory of Food Quality and Safety,Beijing 100048,China)

The ultrasound-assisted extraction technology of citrinin from red kojic rice was studied.On the basis of single factor experiments,the technique parameters were optimized by the response surface methodology. The optimum extraction conditions were as follows:ultrasonic power 213.54 W,ultrasonic time 20.76 min,ultrasonic temperature 60.57 ℃.Under such conditions,the citrinin concentration of the extract reached the 12.375 mg/kg,agreeing with the predicted value(12.354 mg/kg),the relative error was 0.17%.Therefore,the optimized extraction procedure was reliable and the proposed prediction model could accurately predict the extraction yield of citrinin.

red kojic rice;citrinin;ultrasound-assisted extraction;response surface methodology

2016-03-14

楊強(1990-)，女，助理實驗師，碩士，研究方向：食品微生物與發酵技術，E-mail：yq_0314@126.com。

王成濤(1969-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：wct5566@163.com。

國家自然科學基金項目(31301411、31401669、31571801)；北京市科技計劃項目(Z151100001215008)；科技創新服務能力建設-科技成果轉化-提升計劃項目(PXM2016-014213-000034)。

TS201.3

B

1002-0306(2016)17-0190-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.029