響應面法優化大鯢魚油水酶法提取工藝

白鑫華,羅　秦,青　維,冉　旭

(四川大學 輕紡與食品學院,四川成都 610065)

?

響應面法優化大鯢魚油水酶法提取工藝

白鑫華,羅秦,青維,冉旭*

(四川大學 輕紡與食品學院,四川成都 610065)

通過單因素實驗考察中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和風味蛋白酶對大鯢油提取率的影響,確定木瓜蛋白酶為實驗用酶;采用中心組合實驗(CCD)對酶解工藝進行優化,確定酶解的最適工藝條件為:料液比為1∶1(w/w),酶添加量為6800 U/g,pH5.8,酶解溫度為50 ℃,酶解時間為130 min,在優化條件下大鯢油提取率為93.52%。對水酶法提取的大鯢油進行理化、感官分析,結果表明粗制大鯢油產品質量達到SC/T3502-2000二級粗魚油指標要求。

大鯢油,水酶法,脂肪酸

大鯢(Andriasdavidianus)屬兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科[1-2],因其叫聲與嬰兒哭聲相似,故又稱 “娃娃魚”。大鯢營養豐富,是一種食用價值極高的動物,李時珍在《本草綱目》中有記載:“山海經云:決水有魚,狀如衟,食之已癡疾,性甘淡,能截瘧。[3]”黃世英[4]、劉紹[5]、李林強[6]等人對大鯢肌肉脂肪酸檢測結果表明,大鯢肌肉脂肪中含有13種脂肪酸,不飽和脂肪酸含量達到75.91%,多不飽和脂肪酸含量為29.22%,其中DHA的含量是甲魚的31倍多[7]。目前魚油的生產工藝主要包括蒸煮、壓榨、稀堿水解、酶解、溶劑萃取和超臨界流體萃取幾種方法。水酶法作為一種新的提油技術,利用蛋白酶對蛋白質的水解作用,對脂肪細胞外由磷脂和蛋白質結合形成蛋白膜進行破壞,使油脂釋放出來,酶解過程條件溫和(50 ℃左右),可有效保護油脂中的功效成分不被高溫破壞,提油率高且無有機溶劑殘留,酶解后的物質還可進一步加工用于食品或飼料工業,工藝操作簡單,生產安全性高,是一種低投資,無污染的生產技術[9-10]。本研究以大鯢脂肪組織為主要原料,采用水酶法提取大鯢油,以提取率為主要評價指標,采用單因素與中心組合實驗對大鯢油的提取工藝參數進行優化,同時對水酶法提取的大鯢油進行評價分析,以期為大鯢油的工業化生產及深加工提供一定參考。

1　材料與方法

1.1材料與設備

大鯢四川溪源水產養殖有限公司;胰蛋白酶:0.025萬U/g、胃蛋白酶:0.3萬U/g、中性蛋白酶:5萬U/g、木瓜蛋白酶:10萬U/g、風味蛋白酶:1.5萬U/g食品級,江蘇銳陽生物科技有限公司。其它試劑均為分析純。

JA1203型電子天平上海精科天平廠;酸度計pHS-3C成都世紀方舟科技有限公司;組織搗碎機金壇市富華儀器有限公司;721型分光光度計上海精密科學儀器有限公司;HH-4型數顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司;恒溫振蕩水浴鍋金壇市富華儀器有限公司;TDL-40B臺式離心機上海安亭科學儀器廠;QP2010Plus氣-質聯用儀日本島津公司。

表1　中心組合實驗因素水平表

1.2實驗方法

1.2.1大鯢油脂理化指標及提取率計算酸值:參照GB/T5530-2005《動植物油脂酸值和酸度測定》;過氧化值:參照GB/T5538-2005《動植物油脂過氧化值測定》;碘值:參照GB/T5532-2008《動植物油脂碘值的測定》;水分:參照GB/T5528-2008《植物油脂水分及揮發物含量測定法》。

1.2.2水酶法提取大鯢油工藝流程大鯢脂肪組織→清洗、切塊→加水打漿→調節pH→加酶酶解→沸水浴滅酶15 min→4000 r/min離心20 min→粗大鯢油

提取率(%)=A×100/(B×C)

式中,A為離心提取的大鯢油的質量,g;B為原料脂肪的質量,g;C為原料脂肪中粗脂肪的百分含量,%。

1.2.3大鯢油脂肪酸組成分析GC-MS分析設備:采用日本島津QP2010Plus氣-質聯用儀進行分析。GC條件:Rxi-5 ms氣相毛細管色譜柱(柱長:30 m,內柱徑:0.25 μm,外柱徑:0.25 mm);程序升溫:起始溫度50 ℃,停留5 min,以10 ℃/min升至160 ℃,保留2 min;再以5 ℃/min升至200 ℃,保留5 min;以2 ℃/min升至260 ℃,保留10 min;最后以5 ℃/min升至300 ℃,保留10 min;進樣溫度280.00 ℃;壓力53.5 kPa;總流量9.0 mL/min;柱流量1.00 mL/min;線速度36.3 cm/sec;吹掃流量3.0 mL/min;分流比5.0∶1;進樣量1 μL;溶劑延遲時間3 min。MS條件:EI離子源;離子源溫度200 ℃;接口溫度220 ℃;掃描質量數范圍22.00～700.00 u。

1.2.4粗大鯢魚油提取單因素室驗先篩選蛋白酶,再采用1.2.1下法提取魚油,提取條件為:固定酶添加量5000 U/g,酶解溫度50 ℃,pH7.0,酶解時間240 min,考察不同料液比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)對提取率的影響;固定料液比為1∶1,酶解溫度50 ℃,pH7.0,酶解時間240 min,考察蛋白酶添加量(0、1000、3000、5000、7000、9000 U/g)對提取率的影響;固定料液比為1∶1,酶添加量5000 U/g,pH7.0,酶解時間240 min,考察不同溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)對提取率的影響;固定料液比為1∶1,酶解溫度50 ℃,酶添加量5000 U/g,酶解時間240 min,考察pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)對提取率的影響;固定料液比為1∶1,酶解溫度50 ℃,酶添加量5000 U/g,pH7.0,考察酶解時間(0、60、120、180、240、300 min)對提取率的影響。進行單因素實驗,考察各因素變量對魚油得率的影響。

1.2.5中心組合實驗設計固定料液比為1∶1,在單因素實驗的基礎上,選擇酶添加量、酶解溫度、酶解pH、酶解時間4個主要因素,以大鯢油提取率為指標,采用中心組合實驗(CCD)對水酶法提取大鯢油的工藝條件進行優化,中心組合實驗因素水平見表1。

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1蛋白酶種類篩選參考張偉偉[11]、劉沙[12]、楊小克[13]的研究成果,初步選取中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶5種蛋白酶,以大鯢油提取率為指標選取實驗用酶。各蛋白酶的酶解條件見表2。

表2　不同種類蛋白酶的水解條件

由圖1可知提取率最高的為木瓜蛋白酶90.43%。選擇木瓜蛋白酶作為大鯢油提取的實驗用酶。

圖1　不同種類蛋白酶對大鯢油提取率的影響Fig.1　Effects of different enzymes on extraction rate of andrias davidianus oil

2.1.2料液比對大鯢油提取率的影響由圖2可以看出,反應體系中底物濃度的增大或減小都會影響水解反應的進行。當料液比大于1∶1時,離心后的殘夜中有塊狀物,表明底物并未酶解完全,且離心過程中油層和水層不能很好的分離;當料液比為1∶1時,大鯢油提取率達到最大值89.55%,隨著料液比減小,提取率下降,因此,本實驗將料液比為固定為1∶1。

圖2　料液比對大鯢油提取率的影響Fig.2　Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of andrias davidianus oil

2.1.3酶添加量對大鯢油提取率的影響由圖3可知,添加蛋白酶可明顯提高大鯢油的提取率,隨著酶添加量的增加,提取率也隨之增大,當酶添加量為7000 U/g時,提取率達到89.13%,繼續增加酶量,大鯢油提取率趨于平緩,這可能是因為隨著酶添加量的增大,酶與底物結合形成的絡合物對酶形成了反饋抑制,造成反應速率下降,因此結合實際工業生產及成本考慮,選擇木瓜蛋白酶的酶添加量范圍5000～9000 U/g。

圖3　酶添加量對大鯢油提取率的影響Fig.3　Effects of enzyme dosage on extraction rate of andrias davidianus oil

圖4　酶解溫度對大鯢油提取率的影響Fig.4　Effects of temperature on extraction rate of andrias davidianus oil

2.1.4酶解溫度對大鯢油提取率的影響由圖4可以看出,隨著酶解溫度增大,大鯢油提取率呈現先增大后降低的趨勢,當溫度為55 ℃時,提取率達到最大值89.33%,進一步增大酶解溫度,提取率表現下降的趨勢。這可能是因為酶解溫度的增加可提高酶與底物間的相互作用,酶解反應較完全;而隨著溫度的繼續升高至甚至超過酶活所容許的最適溫度時,酶蛋白的結構發生改變,從而引起酶的失活效應,進而降低了酶解效率使得提取率下降[14]。因此,本實驗選擇酶解的溫度范圍45～55 ℃。

2.1.5酶解pH對大鯢油提取率的影響由圖5可知,隨著pH的增大,酶解提取率呈現先增大后降低的趨勢,當酶解pH為6.0時,提取率達到最大值91.29%;當酶解pH為5.5～7.0的范圍內時,pH對酶活影響較小,酶解反應較完全;當pH增大至8.0時,pH的變化改變了木瓜蛋白酶離子基團的離解狀態,酶的穩定性被破壞,因此阻礙了酶解反應的進行,從而導致酶解提取率的下降。因此,選擇pH范圍5.5～6.5。

圖5　酶解pH對大鯢油提取率的影響Fig.5　Effects of pH on extraction rate of andrias davidianus oil

2.1.6酶解時間對大鯢油提取率的影響由圖6可以看出,隨著酶解時間的增加,大鯢油的提取率有了明顯提高,當酶解時間為120 min時,提取率達到最大值89.16%,再繼續增大酶解時間,提取率趨于平緩,因此,選擇大鯢油的最佳酶解時間范圍90～ 150 min。

圖6　酶解時間對大鯢油提取率的影響Fig.6　Effects of enzymolysis time on extraction rate of andrias davidianus oil

2.2水酶法提取大鯢油工藝優化

在固定料液比為1∶1的基礎上,選擇酶添加量、酶解溫度、酶解pH、酶解時間為實驗因子,以提取率為指標,采用中心組合實驗(CCD)對大鯢油的提取工藝進行了優化研究,實驗結果見表3。

表3　中心組合實驗設計及結果

以大鯢油提取率為固定變量(Y),酶添加量(X1)、pH(X2)、酶解溫度(X3)、酶解時間(X4)為自變量,采用Design-Expert軟件對實驗所得數據進行擬合,建立大鯢油提取率與酶添加量、pH、酶解溫度、酶解時間4因素的多元二次響應面回歸模型:

Y=-777.43973+0.012195X1+178.73550X2+9.66742X3+0.95706X4+3.125×10-4X1X2-8.125×10-5X1X3-6.70833×10-6X1X4-0.53X2X3-0.063667X2X4+3.91667×10-3X3X4-6.62646×10-7X12-12.47223X22-0.064173X32-2.86037×10-3X42

對該模型進行方差分析,其結果見表4。

由表6可以看出,自變量一次項pH(X2),酶解時間(X4),交互項的pH和酶解溫度X2X3,酶解溫度(X32)顯著,酶添加量(X12),pH(X22),酶解時間(X42)極顯著,該模型極顯著(p<0.0001),失擬不顯著(p=0.3180>0.05),決定系數為0.9115,表明該模型只有8.85%的變異,91.15%的響應值能由該模型解釋,說明該模型的擬合程度較高,實驗誤差小,因此可以用此模型來預測和分析水酶法提取大鯢油的結果。

響應面圖的形狀可反映出酶添加量(X1)、pH(X2)、酶解溫度(X3)和酶解時間(X4)各因素交互效應的強弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則與之相反。由圖7、圖9、圖10等高線的形狀可知,兩因素軸向等高線密度變化相差不大,因此X1X2、X1X4、X2X4的交互作用不顯著;圖8中,等高線形狀近似圓形,因此X1X3的交互作用不顯著;圖11中X4對提取率的影響顯著,曲面較陡,X3對提取率的影響相對不顯著,曲面較緩和;圖12中,X2X3交互作用強,沿X2軸向等高線密集,X3軸向等高線相對稀疏,說明X2對響應值峰值的影響比X3大。

圖7　酶添加量與pH的交互作用Fig.7　The interaction for enzyme dosage and pH

圖8　酶添加量與酶解溫度的交互作用Fig.8　The interaction for enzyme dosageand enzymolysis temprature

圖9　酶添加量與酶解時間的交互作用Fig.9　The interaction for enzyme dosage and enzymolysis time

通過Design-Expert軟件分析得到水酶法提取大鯢油的最佳工藝條件為:酶添加量6808.11 U/g,pH5.84,酶解溫度50.83 ℃,酶解時間129.12 min,大鯢油的提取率為93.57%。為方便實驗,使酶添加量為6800 U/g,pH5.8,酶解溫度50 ℃,酶解時間130 min,經3次驗證實驗得到,大鯢油的提取率平均值為93.52%,與模型預測值基本一致,由此表明該模型是可靠的。

表4　回歸模型系數及顯著性檢驗

圖10　pH與酶解時間的交互作用Fig.10　The interaction for pH and enzymolysis time

圖11　酶解溫度與酶解時間的交互作用Fig.11　The interaction for enzymolysis temprature and time

圖12　pH與酶解溫度的交互作用Fig.12　The interaction for pH and enzymolysis temprature

注:**表示極顯著(p<0.01);*表示顯著(p<0.05)。2.3水酶法提取粗大鯢油品質及脂肪酸分析

2.3.1粗制大鯢油理化及感官分析評價對水酶法提取的粗制大鯢油進行理化及感官分析評價,結果見表5、表6所示。

表5　粗大鯢油主要理化指標

表6　粗大鯢油的感官指標

從表5理化檢測結果來看,水酶法提取的大鯢油水分和過氧化值大于SC/T 3502-2000中華人民共和國農業部漁業局提出的《魚油》一級粗魚油標準;表6感官評價中,水酶法提取的粗制大鯢油呈黃色、稍有渾濁,但無明顯的分層現象,無明顯雜質,腥味較大,無酸敗味,總體上粗制大鯢油的品質達到了SC/T 3502-2000粗魚油的二級標準。

2.3.2脂肪酸組成分析由表7可以看出,水酶法提取粗制大鯢油中共檢測出25種脂肪酸,都由C11～C22脂肪酸組成,與海產動物油(海豹油、深海魚油)以及植物油[15]中的花生油進行脂肪酸比較,大鯢油中油酸及亞油酸的含量要明顯高于深海魚油及海豹油,低于花生油；DHA及EPA含量低于深海魚油及海豹油?？傮w比較,大鯢油不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例與深海魚油的組成極為接近,前者為2.72∶1,后者為2.70∶1。

表7　水酶法提取大鯢油脂肪酸組成及相對含量

綜上所述,大鯢油既具備海產動物油脂中不飽和脂肪酸含量較高的優點,又含有植物油脂中常見的油酸與亞油酸,因此其脂肪酸組成是比較理想的。

3　結論

通過單因素實驗和中心組合實驗(CCD)對水酶法提取大鯢油的工藝進行了優化,得到優化工藝參數為:料液比1∶1(w/w),木瓜蛋白酶添加量6800 U/g,pH5.8,酶解溫度50 ℃,酶解時間130 min,在此條件下,驗證實驗所得大鯢油的提取率為93.52%。

水酶法提取的粗制大鯢油外觀呈黃色,稍混濁,但無明顯分層,帶有特殊的魚腥味,無酸敗味,理化指標分析結果表明粗制大鯢油達到SC/T3502-2000二級粗魚油標準。水酶法提取大鯢油GC-MS分析共檢出25種脂肪酸成分,飽和脂肪酸所占比例為25.32%,不飽和脂肪酸為68.79%,其中單不飽和脂肪酸為43.17%,多不飽和脂肪酸為25.62%。大鯢油中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例為2.72∶1,與深海魚油的組成比例極為接近,ω-6/ω-3的比值為3.75∶1,這一結果略低于我國多不飽和脂肪酸4～6∶1的推薦值。大鯢油既具備海產動物油脂中不飽和脂肪酸含量較高的優點,又含有植物油脂中常見的油酸與亞油酸,因此其脂肪酸組成是比較理想的。

[1]陳德經. 大鯢黏液、皮膚及肉中氨基酸分析[J]. 食品科學,2010(18):375-376.

[2]費梁. 中國兩棲動物圖鑒[M]. 鄭州:河南科學技術出版社,1999:38-40.

[3]李時珍. 本草綱目[M]. 北京:中國書店影印出版社,2006:20-25.

[4]黃世英,郭文韜,楊志偉,等. 人工養殖大鯢肉營養成分分析[J]. 時珍國醫國藥,2009,20(5):1-2.

[5]劉紹,劉卉琳,周月華,等. 中國大鯢營養成分的分析[J]. 營養學報,2010,32(2):198-200.

[6]李林強,昝林森,任正東. 中國大鯢肌內脂肪酸組成及其抗氧化研究[J]. 食品工業科技,2010,31(1):364-366.

[7]劉紹,劉卉琳,周治德,等. 飼養中國大鯢肝臟與肌肉中幾種重要脂肪酸的測定與分析[J]. 食品與機械,2009,25(3):21-25.

[9]Ranalli A,De Mattia G. Characterization of olive oil produced with a new enzyme processing aid[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society,1997,74(9):1105-1113.

[11]Rosenthal A,Pyle Dl,Niranjan K,et al. Combined effect of operational variables and enzyme activity in aqueous enzymatic extraction of oil and protein from soybean[J]. Enzyme and Microbial Technology,2001,28:499-509.

[12]張偉偉. 斑點叉尾鮰內臟油提取、精制及其氧化穩定性的研究[D]. 合肥:合肥工業大學,2010.

[13]劉沙. 斑點叉尾鮰魚多不飽和脂肪酸富集工藝研究[D].長沙:湖南農業大學,2010.

[14]于殿宇.油脂工藝學[M]. 北京:科學出版社,2012:210-221.

[15]楊小克. 魷魚內臟的魚油提取工藝及綜合利用研究[D]. 青島:中國海洋大學,2012.

Optimization of extraction ofAndriasdavidianusoil by aqueous enzymes using response surface methodology

BAI Xin-hua,LUO Qin,QING Wei,RAN Xu*

(College of Light Industry,Textile and Food Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

The effect of enzymes(neutral protease,papain,pepsin,trypsin and flavourzyme)on extraction rate ofAndriasdavidianusoil were studied by the single factor experiment,and papain was selected to be the enzyme for the experiment. Central composite design(CCD)were used to optimize the condition of aqueous enzymatic process. The optimal conditions were as follows:solid-to-liquid ration of 1∶1(w/w),papain added dosage of 6800 U/g,pH5.8,hydrolysis temperature of 50 ℃,and hydrolysis time of 130 min,and under such condition the extraction rate was 93.52%. Chemical and sensory evaluation results showed that the crudeAndriasdavidianusoil extracted by aqueous enzymatic conformed to the secondary standards crude fish oil of SC/T 3502-2000.

Andriasdavidianusoil;aqueous enzymatic;fatty acid

2016-03-18

白鑫華(1993-),男,碩士研究生,研究方向:食品工程,E-mail:18328008864@163.com。

冉旭(1966-),男,博士,副教授,研究方向:農產品加工與貯藏,E-mail:ranxu01@sina.com。

TS222+.3

B

1002-0306(2016)17-0247-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.040