柑橘多糖對小鼠佐劑性關節炎滑膜炎癥的影響

陶　紅,曾　昕,張　晶,胡芳麗,舒雪蓮,丁　虹,李曉斐

(武漢大學藥學院,湖北武漢 430071)

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柑橘多糖對小鼠佐劑性關節炎滑膜炎癥的影響

陶紅,曾昕+,張晶,胡芳麗,舒雪蓮,丁虹*,李曉斐*

目的:研究柑橘多糖對小鼠佐劑性關節炎模型(AA)的滑膜病理和炎癥因子表達的影響。方法:隨機將雌性昆明小鼠分為正常對照組,模型組,柑橘多糖高、低劑量組,地塞米松組。各組造模后12 d灌胃給藥,1次/d,連續14 d。正常對照組,模型組灌胃等體積生理鹽水。分別采用足容積法和5級評分法測量小鼠原發側足腫脹度及關節炎指數,并計算足腫脹率,測定胸腺、肝指數。HE染色法檢測小鼠滑膜病理。ELISA法測定血清中炎癥因子含量。結果:與正常組比較,模型組小鼠的體重顯著下降,關節腫脹率,胸腺、脾指數以及血清中炎癥因子含量顯著增加,具有統計學意義(p<0.01或p<0.05),且模型組的關節滑膜組織增厚,伴大量炎癥細胞浸潤;與模型組比較,高劑量組能顯著提高小鼠體重,降低小鼠關節腫脹率,胸腺、脾指數以及血清炎癥因子含量,具有統計學意義(p<0.01或p<0.05),且高劑量組能顯著改善滑膜病理,減少炎癥細胞的浸潤。低劑量組有一定效果,但效果不明顯,相對于高劑量組無治療意義。結論:適宜濃度的柑橘多糖對AA有抑制作用,其機制可能與柑橘多糖通過下調血液炎癥因子,減輕滑膜組織炎性細胞浸潤,發揮抗炎作用和通過降低AA小鼠胸腺指數,發揮免疫調節作用有關。

柑橘多糖,佐劑性關節炎,滑膜病理,炎癥因子

類風濕性關節炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種自身免疫性疾病,主要表現為關節滑膜慢性炎癥,可引起關節腫痛,繼而導致軟骨破壞,引起關節畸形,最終出現不同程度的殘疾[1]。RA的病理學表現主要為滑膜炎癥,表現為滑膜襯里呈肥厚增生狀態,襯里下層大量炎癥細胞浸潤,新生血管形成,滑膜炎的評估對臨床RA的病情活動及治療后反應檢測有重要意義,臨床研究證明治療滑膜炎癥可以在一定程度上緩解RA癥狀[2]。雖然如此,臨床上針對RA的治療卻并無特定的療法,通常采用非甾體抗炎藥,糖皮質激素和一些生物制劑等,這些藥物存在毒副作用大、價格昂貴的問題,使其在臨床上的使用受到了限制[3]。中藥是我國的寶貴財富,其資源豐富,療效顯著,毒副作用較低,價格低廉,近年來廣泛應用于各種抗炎治療研究。

柑橘屬的植物在中藥材中應用廣泛,大多能夠疏理氣機、調解氣逆、氣滯等?，F代藥理研究表明,柑橘屬植物具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降脂等多種生物學功能[4]。柑橘屬植物的安全無毒性及其抗炎效應,可能在類風濕關節炎的治療中具有很好的開發價值,但目前鮮有該方面的研究報道。佐劑型關節炎(Adjunvant arthritis,AA)又稱為弗氏佐劑型關節炎,是上世紀五十年代細菌學家Freud創立,它是建立免疫型關節炎動物模型的基本方法,類風濕性關節炎屬于免疫性關節炎[5],因此在本實驗中采用小鼠佐劑型關節炎模型,研究柑橘多糖對類風濕性關節炎的作用效果,并初步探討其作用機制。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

弗氏完全佐劑(FCA)Sigma公司;地塞米松廣東三才石岐制藥股份有限公司;腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒聯科生物技術有限公司;SPF級雌性昆明種小鼠50只,體重18～22 g,動物及飼料湖北省實驗動物研究中心,實驗動物合格證號:42000600010207。

旋轉蒸發儀鄭州宏朗儀器設備有限公司;恒溫水浴箱浙江力辰儀器科技有限公司;PV一200型動物足跖容積測量儀成都泰盟科技有限公司;電子天平上海上平儀器有限公司;離心機長沙英泰儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1柑橘多糖制備柑橘由武漢大學藥學院實驗中心提供。稱量500 g去皮柑橘,加入5倍量的蒸餾水,100 ℃提取2 h后過濾,濾渣按照第一次提取方法再提取兩次,提取液抽濾合并,減壓濃縮得濃縮液,在所得濃縮液中加入50 mL乙醇溶液,4 ℃冰箱中靜置保存12 h,減壓抽濾后收集沉淀并冷凍干燥及稱重,苯酚硫酸法檢測多糖含量[6],測得其含量為75.86%。

1.2.2動物分組與造模隨機將小鼠分為正常對照組,模型組,柑橘多糖高、低劑量組,陽性藥地塞米松組,每組10只。根據常規的AA造模方法[7],除正常組外,其余各組小鼠左后足皮內各注射0.1 mL FCA致炎。各組均于致炎后12 d開始灌胃給藥,1次/d,連續14 d。柑橘多糖高、低劑量組給藥劑量分別為200、100 mg/kg;地塞米松組給藥0.15 mg/kg;正常對照組、模型組灌胃等體積生理鹽水。

1.2.3體重及足腫脹率變化于致炎后16、20、24、28、30 d稱取小鼠體重后,測定每只小鼠原發足足容積,并計算足腫脹率。腫脹率(%)=(足容積-平均足容積)/平均足容積×100。

1.2.4關節炎指數評分于致炎后16、20、24、28、30 d用5級評分法對小鼠進行關節炎指數評分。0分:正常,無癥狀。1分:關節紅而不腫。2分:關節輕度紅腫。3分:關節中度紅腫。4分:踝關節重度紅腫伴功能性障礙[8]。

1.2.5免疫器官指數于致炎后30 d實驗結束后,稱量小鼠體重后,處死小鼠,取出脾、胸腺,用生理鹽水漂洗后再用紗布將其表面水分吸干,置于電子天平上稱相應質量,并計算脾臟和胸腺指數。臟器指數=器官質量(g)/小鼠體重(g)。

1.2.6組織病理學觀察于致炎后30 d實驗結束后,處死小鼠,分離左后足踝關節部位,用福爾馬林溶液固定。并用10% EDTA溶液4 ℃浸潤30 d左右進行脫鈣處理,石蠟包埋,切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,并進行拍照分析。

1.2.7血清中炎癥因子測定于致炎后30 d實驗結束后,小鼠眼球取血,靜置兩小時后3000 r/min離心10 min,分離血清,-20 ℃保存,用ELISA試劑盒測定血清中的TNF-α,IL-1β的含量。

1.3統計學處理

統計學處理實驗結果以x±s表示,采用SPSS13.0統計軟件包,運用單因素方差分析對所有實驗數據進行多組間兩兩比較。p<0.05有統計學意義。

2　結果與分析

2.1柑橘多糖對AA小鼠體重的影響

與正常組相比,模型組小鼠體重明顯下降(p<0.05)。與模型組相比,柑橘多糖低劑量組小鼠體重較模型組有顯著提高(p<0.05),高劑量組小鼠體重在致炎24 d后也出現顯著增加現象(p<0.05),這可能與中藥含量復雜,柑橘多糖量效關系呈現倒U型有關,有待進一步研究;陽性藥地塞米松組的小鼠體重在致炎20 d后較模型組也顯著增加(p<0.05)。結果見表1。

表1　柑橘多糖對AA小鼠體重的影響(g,x±s,n=10)

注:與正常對照組相比,##p<0.01,#p<0.05,與模型組相比**p<0.01,*p<0.05。表2～表5同。

表2　柑橘多糖對AA小鼠原發性足腫脹的影響(%,x±s,n=10)

表3　小鼠關節炎指數評分結果　(x±s,n=10)

2.2柑橘多糖對AA小鼠原發性足腫脹率的影響

各組均于致炎后12 d開始給藥,連續14 d。于致炎后第16、20、24、28、30 d測量小鼠原發足足容積,計算足腫脹率并進行方差分析。結果顯示,造模后,小鼠左后足出現了局部炎癥反應,模型組小鼠原發足腫脹率逐漸增大,極顯著高于正常對照組(p<0.01)。柑橘多糖高劑量組從24 d后開始發揮作用,可明顯抑制AA小鼠的原發性足腫脹,但在16 d和20 d時并無顯著療效,可能由于柑橘多糖在開始階段療程劑量等因素產生了刺激免疫的現象[9](p<0.05或p<0.01)。結果見表2。

2.3小鼠關節炎指數評分結果

與正常組比較,模型組小鼠在致炎后開始出現不同程度的全身癥狀,未致炎的關節出現紅腫,變形且尾部有結節。與模型組比較,柑橘多糖高劑量組與陽性藥地塞米松組關節炎指數均在24 d后明顯降低(p<0.05),初期可能由于柑橘多糖的療程劑量等因素產生了刺激免疫的現象而呈現關節炎指數偏高現象[9],對于地塞米松,由于文獻報道其對成纖維樣滑膜細胞的增殖沒有明顯抑制作用,所以可能在給藥初期對關節炎的保護作用不明顯[10],也有可能是其抑制了MSCs的免疫功能導致初期腫脹度加重,其作用原理可能還有其他,還需要進一步的研究探討[11]。小鼠全身癥狀緩解。結果見表3。

2.4柑橘多糖對AA小鼠免疫器官指數的影響

與正常對照組相比,AA模型組小鼠的胸腺指數和脾指數均升高(p<0.05),柑橘多糖的高劑量組與AA模型組小鼠比較,胸腺指數明顯降低(p<0.01)。柑橘多糖低劑量組的脾指數高于模型組可能是由于中藥的復雜未知成分作用引起,由于中藥多糖多是含有多糖成分的粗制劑,其多糖藥理作用的分子機制與構效關系不太明顯;陽性藥地塞米松作為免疫抑制藥,對AA小鼠的免疫器官胸腺的生長起到了明顯的抑制作用(p<0.01),脾指數與AA模型組小鼠相比并無顯著性差異。結果見表4。

表4　柑橘多糖對AA小鼠免疫器官指數的影響(g/g, x±s,n=10)

2.5柑橘多糖對AA小鼠滑膜組織病理的影響

對佐劑性關節炎小鼠踝關節切片進行病理學觀察,結果顯示,正常組小鼠滑膜襯里層呈1～3層細胞厚度,且細胞排列規則,無炎性細胞浸潤;模型組小鼠滑膜下炎性細胞大量浸潤,滑膜增生明顯;與模型組比較,柑橘多糖高劑量組滑膜炎癥反應減弱,且增生程度減輕,軟骨結構較為清晰,柑橘多糖低劑量組滑膜炎癥反應也有一定程度的減輕,陽性藥地塞米松組滑膜炎癥反應減輕,但仍存在少部分滑膜炎性浸潤,且軟骨結構有一定損傷。結果見圖1。

圖1　AA小鼠滑膜組織病理切片Fig.1　Synovium pathological tissue section of AA mice 注:A:正常組;B:模型組;C柑橘多糖高劑量組;D:柑橘多糖低劑量組;E:地塞米松組。

2.6柑橘多糖對AA小鼠血清炎癥因子含量的影響

模型組小鼠TNF-α、IL-β的含量明顯高于正常對照組(p<0.01)。與模型組比較,柑橘多糖高、低劑量治療組減少IL-β的含量(p<0.01),TNF-α的含量也有所減少,低劑量組效果優于高劑量組,可能與中藥含量復雜,量效關系不明顯呈現倒U型有關,有待進一步研究,陽性對照組地塞米松能夠較好的減少TNF-α、IL-1β含量。結果見表5。

表5　柑橘多糖對AA小鼠血清炎癥因子含量的影響(pg·L-1,x±s,n=10)

3　結論與討論

類風濕性關節炎(RA)是一種慢性的,以關節進行性破壞及炎癥反應為特點的免疫性疾病。小鼠的AA模型的免疫學和組織病理學的改變與人類RA類似,故是篩選和研究治療RA的理想動物模型[9]。

目前對于RA臨床上尚無特定的療法,多采用對癥治療,西醫常采用非甾體抗炎藥,免疫抑制劑,皮質激素等,中醫常采用青風藤,雷公藤等,但以上藥物在其療效和藥物毒副作用等方面均不理想[11-13]。柑橘屬于藥食同源的物質,近年來,國內有柑橘在免疫病理學和藥理學方面的報道,表明它具有抗炎,鎮痛和免疫調節的作用,其對于免疫性疾病的研究具有潛在的價值[14]。

本實驗采用佐劑型關節炎動物模型,定期測定小鼠體重,足腫脹容積以及關節炎指數評分,結果顯示,模型組小鼠體重降低,足腫脹率及關節炎指數升高,而柑橘多糖能夠使模型基本恢復正常水平,表明柑橘多糖對佐劑型關節炎具有明顯的治療作用。在此基礎上我們對柑橘多糖的治療機制進行了初步探討。

研究表明,在RA的發病過程中,炎癥因子的過度增殖活躍對其有重要影響,其中TNF-α、IL-1β參與多種病理學過程,在發病機制中尤為重要[15],實驗結果顯示柑橘多糖可減少TNF-α、IL-1β的產生,從而抑制小鼠的滑膜炎癥反應,緩和模型小鼠的滑膜內炎性細胞的浸潤和關節腔的炎性滲出物的損傷,研究表明柑橘多糖能夠通過下調血液炎癥因子,減輕滑膜炎癥,具有抗炎作用。另一方面,胸腺和脾臟作為機體主要的免疫器官,其重量變化可以反映藥物對免疫器官有無調節及抑制作用,其相對質量的變化在免疫評價中占有重要的地位,藥物對于動物胸腺脾臟質量的影響,可作為免疫藥理學的基本指標[16],本研究發現柑橘多糖對于胸腺質量有明顯的降低作用,但對脾臟質量作用較小,即降低了小鼠的胸腺指數,對于脾臟指數的影響還有待于進一步研究,表明柑橘多糖可以通過減輕胸腺的質量來有效調節AA小鼠的免疫功能,使其發揮正常的功能。

總之,本研究首次發現柑橘多糖可通過下調TNF-α、IL-1β等炎癥因子的含量來抑制AA小鼠的滑膜炎癥反應,同時也可能通過減輕胸腺質量發揮免疫調節作用,抗炎和免疫調節是其發揮作用的相關機制,具體機制還有待于進一步研究。柑橘多糖可能是一種同時具有抗炎和免疫調節作用的重要物質,具有較高的臨床開發價值。

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Effect of citrus polysaccharide on synovitis of the Adjuvant Arthritis mice

TAO Hong,ZENG Xin+,ZHANG Jing,HU Fang-li,SHU Xue-lian,DING Hong*,LI Xiao-fei*

(College of Pharmacy,Wuhan University,Wuhan 430071,China)

Objective:To investigate the influence of citrus polysaccharide on the synovium pathomorphology and the production of inflammatory cytokines in mice with AA. Methods:Female mice were randomly divided into normal control group,model group,citrus polysaccharide high and low dose groups,dexamethasone group. Each group were stated to give medicine 12 days after model establishing,medicine were given once daily for continue 14 days. The normal and model groups were given a gavage of normal saline water of the same volume with the drug. Foot volume method was adopted to measure paw swelling of mice and five grading evaluations was used to evaluate arthritis index of mice,then the swelling rate,thymus index and liver index were calculated. Synovium pathomorphology was measured by HE,and inflammatory factor was measured by ELISA. Results:Compared with the normal group,the model mice’s weight were decreased,the swelling rate,thymus,spleen index and inflammatory factor were all increased.(p<0.01 orp<0.05),and the synovial proliferation and hyperplasia enlargement of the tissue were all raised. Compared with the model group,the citrus polysaccharide high dose mice’s weight were increased,the swelling rate,thymus,spleen index and inflammatory factor were all decreased.(p<0.01 orp<0.05),and the synovial proliferation and hyperplasia enlargement of the tissue were all reduced. Low-dose group had some effect,but the effect is not obvious,with respect to the high-dose group had no therapeutic significance Conclusions:citrus polysaccharide of suitable concentrations could suppress the AA mice. Its active mechanisms may be related to decrease the levels of inflammatory factors and infiltration of inflammatory cells of AA mice,and active immunomodulatory by reduce thyrmus weight.

citrus polysaccharide;Adjuvant Arthritis;synovium pathomorphology;inflammatory factors

(武漢大學藥學院,湖北武漢 430071)

2016-03-01+并列第一作者

陶紅(1995-),女，本科，研究方向：藥學，E-mail:13277939131@163.com。

曾昕(1995-),女，本科，研究方向：藥學，E-mail:1298601247@qq.com。

丁虹(1965-)，女，博士，教授，研究方向：神經藥理學，炎癥性腸病，E-mail：dinghong1106@whu.edu.cn。

李曉斐(1993-)，女，碩士，研究方向：心血管疾病，E-mail:448481262@qq.com。

TS201.4

A

1002-0306(2016)17-0352-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.061