適于番茄葉片蛋白質組分析的雙向電泳優化體系的建立

王 強，王 娟，李 寧，唐亞萍，楊 濤，王柏柯，楊生保，帕提古麗，余慶輝

(1.新疆農業科學院園藝作物研究所/新疆園藝作物生物技術與分子育種重點實驗室，烏魯木齊　830091；2. 新疆農業科學院經濟作物研究所，烏魯木齊　830091)

?

適于番茄葉片蛋白質組分析的雙向電泳優化體系的建立

王 強1，王 娟2，李 寧1，唐亞萍1，楊 濤1，王柏柯1，楊生保1，帕提古麗1，余慶輝1

(1.新疆農業科學院園藝作物研究所/新疆園藝作物生物技術與分子育種重點實驗室，烏魯木齊830091；2. 新疆農業科學院經濟作物研究所，烏魯木齊830091)

【目的】建立適于番茄葉片蛋白質組分析的雙向電泳(2-DE)技術，為開展番茄蛋白質組學研究奠定技術基礎?！痉椒ā繉Ψ讶~片蛋白質提取方法、蛋白質裂解液、上樣量、膠條pH范圍等關鍵步驟進行優化?！窘Y果】采用三氯乙酸/丙酮法提取番茄葉片總蛋白質，含有7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS，30 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)裂解緩沖液，上樣量為100 mg，以pH 4～7、18 cm的IPG 膠條在12%SDS-PAGE凝膠濃度下進行雙向電泳，得到了蛋白點均勻分布、低峰度蛋白點較為清晰，蛋白點數目多且分辨率高的2-DE圖譜?！窘Y論】建立了一套適于番茄葉片蛋白質分析的雙向電泳技術體系，為下一步在蛋白組學水平上分析番茄逆境脅迫等相關蛋白提供了技術支持。

番茄葉片；蛋白質組；雙向電泳(2-DE)

0　引 言

【研究意義】蛋白質組學是后基因組時代研究生物學功能的重要組學，雙向電泳技術(2- DE) 已經成為了蛋白組學研究的核心技術之一，而雙向電泳技術涉及的環節較多，樣品制備中植物組織中存在影響雙向電泳的物質(如核酸、多糖和脂類等生物大分子以及鹽類) 會阻塞凝膠孔徑，鹽濃度過高會使等電聚焦的電壓降低，甚至損壞IPG 膠條[1]。其次植物組織中含有的色素、酚、多糖等代謝產物也會對后續蛋白質的分離和鑒定造成影響[2]。除了樣品制備外，上樣量的大小、蛋白質裂解的配方、IPG膠條的選擇等都會對雙向電泳的產生影響。任何一個環節出現問題都無法得到分辨率高的凝膠圖譜。因此，建立一套分辨率高的雙向電泳體系是成功開展番茄蛋白質組學分析的基礎?！厩叭搜芯窟M展】近年來，雙向電泳技術廣泛應用于植物等方面的研究，由于不同研究作物的蛋白質組成千差萬別，套用常規試驗程序有可能得不到滿意結果[3]。番茄不同器官蛋白質組學方面的研究有一些報道，如葉片[4-5]、根[6]和果實[7]等，由于雙向電泳涉及的環節較多，植物組織中代謝產物、材料的多樣性及不同器官所含蛋白種類及數量等也不相同，往往對電泳結果影響較大?！颈狙芯壳腥朦c】國內外研究番茄蛋白質組學的研究報道還很有限。利用雙向電泳技術，比較番茄葉片總蛋白質的提取方法、蛋白質裂解液、上樣量、IPG膠條等進一步的優化?！緮M解決的關鍵問題】探索出一套適于番茄葉片的雙向電泳技術，以期得到蛋白質點數目多，背景清晰，條紋較少，拖尾現象不明顯的電泳圖譜，為開展番茄蛋白質組學研究提供技術支撐。

1 　材料與方法

1.1材 料

供試番茄材料為M82，于2014 年 4 月種植于新疆農業科學院安寧渠綜合試驗基地，幼苗4片真葉時取樣，置于-80℃冰箱備用。實驗所用的載體兩性電解質、線性18 cm pH 3～10、pH 4～7 IPG膠條、礦物油均購于美國Bio-Rad公司。其它試劑均為國產分析純。

1.2方 法

1.2.1蛋白質提取

采用以下三種方法提取番茄葉片總蛋白并對提取效果進行比較。

三氯乙酸/丙酮沉淀法參照Gallardo等[8]并略作修改。取番茄葉片1 g在液氮中研磨成粉末，轉移至離心管中，加入-20℃預冷的丙酮4 mL(含10%三氯乙酸和0.07%β-巰基乙醇) 充分渦旋，-20℃靜置過夜，在4℃低溫離心機12 000 r/min，離心 30 min，棄上清，留沉淀；然后加80%丙酮4 mL (含0.07% β-巰基乙醇)去除色素及雜質，12 000 r/min，4℃低溫離心30 min，棄上清，留沉淀。再加入100%丙酮(含0.07%β-巰基乙醇)，-20℃冷藏30 min。然后4°C，12 000 r/min離心30 min，棄上清，洗滌步驟重復2～3次，直到有機相成無色，將所得蛋白沉淀置于-20℃冷凍成干粉，在-80℃保存備用。

飽和酚/甲醇醋酸銨法參照Mireille等[9]并略作修改。取番茄葉片 1 g 及少量的 PVP放入提前預冷的研缽中，在液氮中研磨成粉末，然后轉至離心管，加入3～4倍體積蛋白質提取緩沖液( pH 8.0，0.50 mmol/L Tris-HCl，700 mmol/L 蔗糖，5 mmol/L EDTA-Na2，0.1% 蛋白酶抑制劑)充分混勻。在12 000 r/min，4℃低溫離心機上離心 3 min，吸取上清液轉入另一離心管中，向管中加 1.2 倍體積的水飽和酚充分混勻，12 000 r/min 離心20 min，取上清液加3倍體積 0.1 mol/L 乙酸銨/甲醇，-20℃過夜，然后12 000 r/min離心20 min，收集沉淀； 再用乙酸銨/甲醇洗滌 1 次，依次再用預冷的甲醇洗滌 2 次，80%丙酮洗滌 1 次，最后將沉淀在-20℃冷凍干燥，得到粉末狀蛋白放入-80℃保存備用。

二硫蘇糖醇/丙酮法參照王紅等[10]并略作修改。取 1 g 番茄葉片，液氮中研磨成粉末，轉移至離心管中，加入 5 mL 2%二硫蘇糖醇的水溶液，在 4℃ 下12 000 r/min離心 30 min，取上清液，棄沉淀；上清液加4倍體積的冷丙酮，放于-20℃冰箱過夜。之后 4℃下 12 000 r/min 離心 30 min，沉淀用80%丙酮溶液清洗 2～3 次；最后沉淀在-20℃冷凍干燥，放入-80℃冰箱備用。

1.2.2蛋白質定量

測定蛋白質濃度參考 Bradford[11]的方法，稱取蛋白質沉淀，以10 mg 蛋白加入200 μL 蛋白質裂解液復溶，在冰浴超聲波中處理15 min，取出后在4℃搖床搖勻30 min，然后在4℃， 12 000 r/min 離心 30 min，取上清液，即為蛋白樣品。采用的蛋白裂解液如下：

蛋白裂解液Ⅰ：7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2% CHAPS，2% SB3-10；

蛋白裂解液Ⅱ：7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS，30 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)；

蛋白裂解液Ⅲ：0.05 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl；

1.2.3單向SDS-PAGE凝膠電泳

將濃度為12%的分離膠注入玻璃板夾層中，用去離子水封膠面，待分離膠聚合后，配制濃度為4%濃縮膠，倒去分離膠表面的去離子水，灌入濃縮膠，插入點樣梳，待濃縮膠聚合后，在電泳槽中加入電泳緩沖液，拔去上樣梳點樣，蛋白上樣量為20 μL。加樣完畢開始電泳，起始電壓為80 V，待溴酚藍線到達分離膠時把電壓提高到120 V。當溴酚藍指示劑達到分離膠底部時停止電泳。

1.2.4第一向等電聚焦

采用Protean IEF cell等電聚焦系統。將提取的番茄蛋白樣品加裂解液至總體積為500 μL，均勻加入上樣IPG 膠條槽，將IPG膠條保護膜揭掉，IPG 膠條與膠條槽正負極一致，放在加有蛋白上樣液的IPG 膠條槽內，然后在膠面上加2～3 mL礦物油，置于等電聚焦儀上，聚焦條件為20℃。運行參數：50 V水化12 h，250 V，30 min；500 V，1 h；1 000 V，30 min；4 000 V穩壓聚焦，總電壓時間積達到20 000 Vh時結束電泳。

1.2.5第二SDS-PAGE凝膠電泳

等一向等電聚焦結束后，將IPG 膠條從膠條槽中取出，放入濾紙上吸取膠條表面的礦物油，然后將膠面朝上的IPG 膠條放于5 mL 膠條平衡緩沖液 I[6 mol /L尿素，20%甘油，0.375 mol /L Tris-HCl (pH 8.8)，2% SDS，2%DTT]中在脫色搖床上緩慢搖蕩平衡15 min，再將IPG 膠條放入濾紙上吸取膠條表面的溶液，再轉入5 mL 膠條平衡緩沖液 II [6 mol/ L尿素，2.5%碘乙酰胺，20%甘油，0.375 mol /L Tris-HCl (pH 8.8)，2%SDS]中在脫色搖床上緩慢搖蕩平衡15 min。使用Mini Protein 3垂直電泳儀，將平衡完畢的IPG膠條轉移到提前預制的12%SDS-PAGE 凝膠上，使IPG膠條與凝膠表面充分接觸，用低熔點瓊脂糖封膠，在120 V 電壓下進行電泳，待溴酚藍移至電泳槽凝膠底部時停止電泳。

1.2.6蛋白質染色與圖像分析

第二SDS-PAGE凝膠電泳結束后，采用改良的考馬斯亮藍染色法[12]，固定、致敏、染色、脫色至凝膠背景清晰為止，脫色后的凝膠在GE Healthcare凝膠掃描儀上掃描獲取圖像；用PDQuest8.0軟件進行蛋白點檢測及圖像分析。

2　結果與分析

2.1不同方法提取番茄葉片總蛋白質比較

二硫蘇糖醇/丙酮法、飽和酚/甲醇醋酸銨法、改良的三氯乙酸/丙酮法分別提取番茄葉片蛋白質樣品并通過單向SDS-PAGE凝膠電泳進行檢測，結果表明，利用二硫蘇糖醇/丙酮法提取蛋白質含量較豐富，條帶較多，蛋白經多次洗脫后呈黃色色素，最終難以消除。(泳道1～3)；飽和酚/甲醇醋酸銨法所提取的蛋白質含量少，且條帶較少不清晰(泳道4～6)；而利用三氯乙酸/丙酮法所提取蛋白質含量豐富，條帶數量最多(泳道7～9)；因此，研究認為三氯乙酸/丙酮法是較為理想的番茄葉片蛋白質的提取方法。圖1

2.2蛋白質裂解液選擇

蛋白質裂解液直接影響蛋白質樣品中各種蛋白質能否充分溶解，并是其能否在2-DE凝膠上分離出來的關鍵因素[13]。蛋白樣品制備，應盡可能的避免蛋白質的降解與損失，保證蛋白樣品最大程度的溶解，因此選擇合適的裂解液也十分重要[14]。SDS-PAGE分析結果顯示，三種裂解液對蛋白質樣品的溶解效果差異明顯。不同蛋白質提取方法在三種裂解液配方溶解后，通過單向SDS-PAGE凝膠電泳看出裂解液I、II對蛋白質樣品的溶解效果較好，但裂解液II在不同方法提取樣品中蛋白裂解效果好于裂解液I，蛋白質條帶范圍較為廣泛。裂解液III在三氯乙酸/丙酮提取法、飽和酚/甲醇醋酸銨提取法中蛋白條帶模糊不清，在二硫蘇糖醇/丙酮法提取蛋白中顯示蛋白條帶較弱，范圍內的條帶較少。圖2

注：1～3：二硫蘇糖醇/丙酮法；4～6：飽和酚/甲醇醋酸銨法；7～9：改良的三氯乙酸/丙酮法

Note：1-3：DTT- acetone method；4-6：Phenol-methanol-ammonium acetate method；7-9：modified TCA- acetone method

圖1三種方法提取番茄葉片總蛋白SDS-PAGE分析
Fig.1SDS-PAGE pattern of tomato levers proteins extracted by three sample preparation methods

飽和酚/甲醇醋酸銨法　二硫蘇糖醇/丙酮法　三氯乙酸/丙酮法

注：1、4、7為裂解液I；2、5、8為裂解液II；3、6、9為裂解液III

Note：1，4，7 for lysis buffer I；2，5，8 for lysis buffer II；3，6，9 for lysis buffer III

圖2 不同裂解液配方和方法提取蛋白溶解效果
Fig.2 Different lysis buffer formula of dissolution effect in different methods to extract protein

2.3上樣量對2-DE圖譜的影響

等電聚焦的上樣量多少直接影響到聚焦的效果及雙向電泳的分辨率，上樣量過少，低豐度蛋白不容易檢出，上樣量太多，高豐度蛋白的斑點掩蓋低豐度蛋白點，而且鹽離子越多，等電聚焦時電壓的上升受到干擾，直接影響聚焦效果[15]。采用18 cm IPG(pH 3～10)膠條、12%SDS-PAGE濃度、改良考馬斯亮藍染色后的2-DE圖譜可以看出，不同濃度蛋白質上樣量對2-DE圖譜分辨率有明顯的影響，當番茄葉片蛋白質的上樣量為75 mg時(圖3A)， 蛋白質點雖然無拖尾現象，但2-DE圖譜上只檢出了約343個蛋白質點，而且低豐度蛋白檢出數量很少。上樣量為100 mg時(圖3B)，蛋白點呈圓點型，形態好，幾乎無拖尾現象，蛋白質點數量約為757個蛋白質點。上樣量為125 mg時(圖3C)，高豐度蛋白質之間重疊現象嚴重，與其臨近的低豐度蛋白質點有很多被覆蓋，條紋較多，同時也出現較多蛋白質點拖尾的現象。據此認為，適合于番茄葉片蛋白質雙向電泳的最佳上樣量為100 mg。圖3

注：18 cm，pH 3～10，12%SDS-PAGE，改良的考馬斯亮藍染色；A.上樣量為75 mg；B.上樣量為100 mg；C.上樣量為125 mg

Note：18 cm，pH 3-10，12%SDS-PAGE，modified coomassie R-250 staining；A.75 mg；B.100 mg；C.125 mg

圖3不同上樣量番茄葉片蛋白質2-DE圖譜
Fig.3The effect of different protein-loading amounts on 2-DE map of tomato leaf protein

2.4膠條范圍對2-DE圖譜的影響

分別采用18 cm，pH 3～10和pH 4～7的IPG膠條，從圖4A可以看出，當使用pH 3～10的膠條進行2-DE電泳時，2-DE凝膠圖譜中的蛋白質點大部分集中在酸性端范圍內，堿性端蛋白質點分布極少，且圖中橢圓區域部分蛋白質點豐度低，模糊不清，導致分辨率低。根據觀察結果，進一步將2～DE圖譜分為：3≤pH<4、4≤pH<7、7≤pH<10三個區域，利用PDQuest8.0軟件對各區域中蛋白質點數檢測，有72%蛋白點穩定分布在4

注：A. 18 cm，IPG膠條pH 3～10；B. 18 cm，IPG膠條pH 4～7

Note：A.18 cm，IPG strips of pH 3-10；B. 18 cm，IPG strips of pH 4-7

圖4不同IPG膠條pH范圍下2-DE圖譜

Fig.4The effect of different IPG strips of pH on 2-DE map of tomato leaf protein

3　討 論

番茄葉片組織中含有大量鹽離子、多酚、色素及多糖等次生代謝物[16]。在蛋白質提取過程中選擇適宜的蛋白質提取方法，除去上述次生代謝等干擾物質，并減少蛋白質的損失和降解[17]，是影響2-DE成敗的關鍵因素。實驗通過比較前人研究結果，以二硫蘇糖醇/丙酮法、飽和酚/甲醇醋酸銨法、三氯乙酸/丙酮法分別提取番茄葉片蛋白質，結果顯示飽和酚/甲醇醋酸銨法所提取的蛋白質含量少，且條帶不清晰，可能由于該方法只收集酚相與水相界面層液，丟棄大量沉淀物，導致蛋白樣品在制備過程中損失過多。二硫蘇糖醇/丙酮法提取番茄葉片蛋白含量相對較豐富，條帶較多，蛋白呈黃色色素，經多次洗脫后還是難以消除。表明二硫蘇糖醇/丙酮反復洗滌蛋白質，雖然可除去鹽離子，但對色素、多糖等雜質的去除效果并不理想。實驗中，三氯乙酸/丙酮法在蛋白提取液中加入β-巰基乙醇，通過丙酮沉淀達到有效除去色素、鹽類等干擾物質，并且減少蛋白酶在提取過程中酶的失活和降解，對去除次生代謝物中雜質也有很好效果。

蛋白質的溶解影響2-DE蛋白質分離，選用合適的裂解液來充分溶解蛋白質是蛋白質組學研究中的一個重要的技術因素[18]。實驗結果顯示裂解液I、II對番茄葉片蛋白質樣品的溶解效果較好，表明尿素與硫脲混合有利于增加番茄葉片蛋白質樣品的溶解。裂解液II中7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲混合4%CHAPS對番茄葉片蛋白質的溶解效果最佳，這與相關文獻結論相近[19]。因此，裂解液中是否含有尿素、硫脲對番茄葉片蛋白質的溶解能力有很大影響。實驗不同配方裂解蛋白質樣品的單向SDS-PAGE凝膠表明，采用7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS，30 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)作為番茄葉片蛋白復溶的裂解液效果最好。

蛋白上樣量的大小和IPG膠條pH對2-DE凝膠的分辨率有直接影響。上樣量太大易引起蛋白上樣溶液中鹽離子及其它雜質含量的提高，導致第一向等電聚焦時蛋白質不能有效均勻分布IPG膠條上，并且易發生蛋白質的凝聚和沉淀，在SDS-PAGE凝膠上，易產生“點飽和”現象，使低豐度蛋白易被掩蓋[20]，或產生水平和垂直紋理現象[21]。上樣量過低，較低豐度的蛋白點有可能無法檢測，進而影響對2-DE凝膠圖譜蛋白點的準確識別。另外，要對2-DE凝膠進行差異蛋白圖譜比較，尤其是低豐度蛋白點，在2-DE凝膠圖譜上達到可識別與分辨，需要選擇適宜的IPG膠條。研究首先釆用pH 3～10的IPG膠條對番茄葉片蛋白質樣品2-DE凝膠分離，結果顯示大部分蛋白點集中在酸性端范圍內少數蛋白點之間相互緊密相連，甚至重疊，個別高分度蛋白點周圍的低豐度蛋白點被覆蓋，導致低豐度蛋白點模糊不清不易區分。用pH 4～7的IPG膠條進行2-DE分離，極大地提高了此區域蛋白點的分辨率，通過2-DE凝膠圖譜比較分析，獲得的2-DE圖譜背景清晰，檢測到的蛋白點數增多且分辨率高。

4　結 論

以三氯乙酸/丙酮法提取番茄葉片蛋白質，選擇蛋白質裂解液為[7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，30 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)]溶解，上樣量為100 mg，18 cm、pH 4～7的IPG膠條更適合番茄葉片總蛋白質2-DE的分離，經PDQuest8.0軟件統計分析，可在2-DE圖譜上分辨出947個蛋白點，蛋白點清晰呈圓形，分布均勻、檢測到的蛋白點數增多且低峰度蛋白較為清晰，分辨率高，優化后的體系更適合于番茄葉片蛋白質組雙向電泳的分析。

References)

[1] 郭堯君. 蛋白質電泳實驗技術[M].北京:科學出版社，2005：215-224.

GUO Yao-jun. (2005).Proteinelectrophoresisexperimenttechnology[M]. Beijing: Science Press：215-224. (in Chinese)

[2] Bodzon-Kulakowska, A., Bierczynska-Krzysik, A., Dylag, T., Drabik, A., Suder, P., & Noga, M., et al. (2007). Methods for samples preparation in proteomic research.JournalofChromatographyBAnalyticalTechnologiesintheBiomedical&LifeSciences, 849(s 1-2)：1-31.

[3]黎飛，徐秋芳，臧憲朋，等.番茄子葉總蛋白雙向電泳體系的建立[J].園藝學報，2010，37(4):661-668.

LI Fei，XU Qiu-fang，ZANG Xian-peng，et al. (2010). Establishment of Two-dimensional Electrophoresis System of Tomato Cotyledons [J].ActaHorticulturaeSinica，37(4)：661-668. (in Chinese)

[4] 張超，郭斌，祁洋，等.轉HBsAg基因櫻桃番茄組培苗葉片總蛋白雙向電泳體系的建立[J].核農學報，2012，26(8): 1 111-1 117.

ZHANG Chao， GUO Bin，QI Yang， et al. (2012). Establishment of Two-dimensional Gel Electrophoresis System for Leaf Proteins of HBsAg Transgenic Cherry Tomato [J].JournalofNuclearAgriculturalSciences, 26(8): 1,111 -1,117. (in Chinese)

[5]白汝瑾，莊天明，劉楊，等.利用雙向電泳技術分離鹽脅迫下番茄葉片蛋白[J].上海交通大學學報，2008，25(4):363-366.

BAI Ru- jin，ZHUANG Tian- ming，LIU Yang, et al. (2008). 2D- PAGE Analysis of Wild Tomato Leaf Protein under Salt Stress [J].JournalofShanghaiJiaotongUiversity, 25(4):363-366. (in Chinese)

[6]邢佳毅，雷慧，程繼鴻，等.番茄幼苗根系總蛋白SDS-PAGE方法的優化[J].安徽農業科學， 2012，40(2):675-677.

XING Jia-yi，LEI Hui，CHENG Ji-hong, et al.(2012). Optimization of SDS-PAGE Procedures for Analyzing the Total Protein in Seedling Roots of Lycopersicon esculentum [J].JournalofAnhuiAgriculturalSciences, 40(2):675-677. (in Chinese)

[7]盧丞文，潘曉琪，田慧琴，等.番茄果實中蛋白質的提取和雙向電泳條件的優化[J].食品科技，2010 ，35(10)：196-200.

LU Cheng-wen，PAN Xiao-qi，TIAN Hui-qin, et al. (2010). Improvement of extraction method and two-dimensional electrophoresis conditions for proteome study of tomato fruit [J].Foodscienceandtechnology，35 (10 )：196-200. (in Chinese)

[8] Gallardo, K., Spc, J. C., Puype, M., Demol, H., & Vandekerckhove, J. (2001). Proteomic analysis of arabidopsis seed germination and priming 1.PlantPhysiology, 126(2)：835-848.

[9] Faurobert, M., Pelpoir, E., & Cha b, J. (2007). Phenol extraction of proteins for proteomic studies of recalcitrant plant tissues.MethodsinMolecularBiology, 355：9-14.

[10]王紅，李浩戈，楊濤，等.黃瓜葉片蛋白質雙向電泳條件優化[J]. 遼寧農業科學，2012，(3) : 11-14.

WANG Hong，LI Hao-ge，YANG Tao, et al. (2012). Conditions Optimization of Cucumber Leaf Protein Two-dimensional Electrophoresis [J].LiaoningAgriculturalSciences，(3) : 11-14. (in Chinese)

[11] Bradford, M. M. (1976). A rapid method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, anal. biochem.AnalyticalBiochemistry, 72(s 1-2)：248-254.

[12] Wang, X., Li, X., & Li, Y. (2007). A modified coomassie brilliant blue staining method at nanogram sensitivity compatible with proteomic analysis.BiotechnologyLetters, 29(10)：1,599-1,603.

[13] Valcu, C., & Schlink, K. (2006). Efficient extraction of proteins from woody plant samples for two-dimensional electrophoresis.Proteomics,6(14)：4,166-4,175.

[14] 陳蕊紅，張改生，劉衛，等.小麥花藥蛋白質組雙向電泳技術體系的優化[J].核農學報，2008，22(4):404-409.

CHEN Rui-hong，ZHANG Gai-sheng，LIU Wei，et al. (2008). Optimization of Two-dimensional Gel Electrophoresis for Proteome from Wheat Anthers [J].JournalofNuclearAgriculturalSciences，22(4):404-409. (in Chinese)

[15] Giavalisco, P., Nordhoff, E., Lehrach, H., Gobom, J., & Klose, J. (2003). Extraction of proteins from plant tissues for two-dimensional electrophoresis analysis.Electrophoresis, 24(1-2)：207-216.

[16]趙新準，徐紅華，姜毓君.食品蛋白質[M].北京:科學出版社，2009: 244-245.

ZHAO Xin-zhun，XU Hong-hua，JIANG Yu-jun.(2009).Foodprotein[M]. Beijing: Science Press：244-245.(in Chinese)

[17]Rober, P.，Timothy, J. F.，Anthony, L. M.，et al. (2006). An accurate and reproducible method for proteome profiling of the effects of salt stress in the rice leaf lamina.ExperimentalBotany，57(5): 1,109-1,118.

[18] Méchin, V., Consoli, L., Guilloux, M. L., & Damerval, C. (2003). An efficient solubilization buffer for plant proteins focused in immobilized ph gradients.Proteomics, 3(7)：1,299-1,302.

[19] Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., & Lunardi, J. (1997). Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized ph gradients.Electrophoresis,18(3-4)：307-316.

[20] Giavalisco, P., Nordhoff, E., Lehrach, H., Gobom, J., & Klose, J. (2003). Extraction of proteins from plant tissues for two-dimensional electrophoresis analysis.Electrophoresis, 24(1-2)：207-216.

[21]王麗娟，任學敏，杜艷慧，等.菜籽蛋白質組雙向電泳技術體系的優化研究[J].安徽農業科學，2011，39(17): 10 178-10 181.

WANG Li-juan，REN Xue-min，DU Yan-hui, et al.(2011). Optimization of Two-dimensional Electrophoresis Technology System for Rapeseed Proteome [J].JournalofAnhuiAgriculturalSciences，39(17)：10,178-10,181.(in Chinese)

Fund project:Supported Natural science foundation project of Xinjiang Uygur Autonomous Region(2014211B035)

Establishment of Two-dimensional Electrophoresis Optimization System for Proteomic Analysis of Tomato Leaves

WANG Qiang1，WANG Juan2，LI Ning1，TANG Ya-ping1，YANG Tao1，WANG Bai-ke1，YANG Sheng-bao1，Patiguli1，YU Qing-hui1

(1.ResearchInstituteofHorticulture/KeyLaboratoryofHorticulturalBiotechnology&MolecularBreedingofXinjiang，XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091，China；2.ResearchInstituteofEconomicCrops，XinjiangAcademyofAgriculturalSciences，Urumqi830091，China；)

【Objective】 To establish a two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) protocol for proteomic analysis of tomato leaves，this system aims to make a foundation for tomato proteomic research.【Method】 The method of protein extraction，reagent of lysis buffer，the sampling amount，pH gradient of IPG strip and other factors were optimized.【Result】 The results showed that optimal tomato leaf protein extraction was obtained by the improved TCA/acetone method，with lysis buffer containing 7 mol/L Urea，2 mol/L Thiourea，4% CHAPS，30 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，a protein loading amount of 100 mg. Under pH 4-7，18 cm IPG strip and 12% concentrations of the SDS-AGE gel. The protein spots we got were evenly distributed and the low protein kurtosis were clearer，with more numbers of protein and higher resolution two-dimensional electrophoresis. 【Conclusion】 This established experiment is sui
Table for the tomato leaf protein analysis system of two-dimensional electrophoresis，which might provide technical support for the next step proteomics level analysis of tomato stress conditions and other related proteins.

tomato leaves；proteomic；two-dimensional electrophoresis(2-DE)

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.04.004

2015-11-17

新疆維吾爾自治區自然科學基金項目(2014211B035)

王強(1983-)，男，甘肅人，副研究員，研究方向為蔬菜栽培生理與逆境脅迫，(E-mail)wangqiang201004@sina．com

余慶輝(1970-)，男，廣東人，研究員，研究方向為加工番茄新品種選育和栽培，(E-mail)tomato-yu@xaas.ac.cn

S188；S641.2

A

1001-4330(2016)04-0610-07