四氧化三鐵磁性納米顆粒人工模擬酶在快速檢測二硝基甲苯中的研究及應用

聶冬霞施國躍于妍妍（上海市農業科學院，農產品質量標準與檢測技術研究所，上海 040）（華東師范大學化學系，上海 004）（徐州醫學院藥學院，徐州 004）

四氧化三鐵磁性納米顆粒人工模擬酶在快速檢測二硝基甲苯中的研究及應用

聶冬霞1施國躍*2于妍妍31
（上海市農業科學院，農產品質量標準與檢測技術研究所，上海 201403）
2（華東師范大學化學系，上海 200241）3（徐州醫學院藥學院，徐州 221004）

通過共沉淀法制備了具有類過氧化物酶催化活性的四氧化三鐵磁性納米顆粒（Fe3O4MNPs）。研究表明，Fe3O4MNPs可以催化H2O2氧化2，2'-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）二銨鹽，生成有色的氧化態ABTS，同時也可催化H2O2氧化二硝基甲苯（DNT）的反應，消耗反應物H2O2?；谏鲜鲈?，構建了Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2-DNT反應體系，用于檢測DNT。結果表明，氧化態ABTS在417 nm處的吸收值隨著DNT含量的增加而降低，與DNT濃度在5×10-7～2.0×10-5mol/L范圍內呈良好的線性關系，檢測限為1.5×10-7mol/L（S/N=3）。采用紫外-可見分光光度法對Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2-DNT體系的反應機理、反應條件等進行了深入探討。所建立的硝基苯類化合物含量的比色分析方法簡便、快速、靈敏、可靠，對環境水樣中硝基苯類化合物的在線監測具有潛在的應用價值。

二硝基甲苯；四氧化三鐵磁性納米顆粒；過氧化物模擬酶；分光光度法

1 引言

四氧化三鐵（Fe3O4）納米顆粒除具有普通納米顆粒所具有的特性外，還具有磁性強、制備簡單、生物兼容性好等優點，被廣泛應用于生物分離［1，2］、催化、傳感器等領域［3，4］。Gao等［5］發現，Fe3O4磁性納米顆粒（MNPs）具有類似天然過氧化物酶的特性，可以催化特定過氧化物酶底物與H2O2的反應。與天然過氧化物酶相比，Fe3O4MNPs具有化學穩定性好、儲存方便、制備簡單且成本低、易于實現磁性分離等優勢，因而引起廣泛的研究興趣［6～9］。如Wei等［6］利用Fe3O4MNPs催化H2O2氧化2，2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）的反應，建立了用于H2O2和葡萄糖檢測的比色分析法。Ding等［7］根據H2O2和三聚氰胺混合生成新的物質從而消耗H2O2這一機理，構建了Fe3O4MNPs-H2O2-ABTS比色分析方法，實現了牛奶中三聚氰胺的定量檢測。

硝基苯類化合物具有較高毒性和致癌性，對人和動植物都有很大危害［10，11］，已引起廣泛關注［12～16］，關于硝基苯類化合物的降解原理及方法已經有很多報道［17～20］。Chen等［17］采用Fenton試劑礦化二硝基甲苯（2，4-DNT）和三硝基甲苯（TNT），發現Fenton試劑在純化工業廢酸中的硝基苯類化合物中有潛在的應用價值。Matta等［18］采用不同的氧化劑（包括Fenton試劑、高錳酸鉀等）和不同的鐵礦物質（包括磁鐵礦、黃鐵礦、赤鐵礦等）作為催化劑降解溶液中的TNT，發現只有Fenton試劑及類似Fenton（Fenton-like）試劑的磁鐵礦和黃鐵礦才能降解溶液中的TNT。Lee等［19］基于電化學反應，通過辣根過氧化酶（HRP）及電化學反應器中原位反應產生的H2O2催化降解溶液中2，4，6-TNT，發現采用電化學酶催化方法去除TNT的效率遠高于其它電化學或生物化學法。Yang等［20］基于TNT在降解的過程中會消耗溶液中的H2O2的原理，研制了Nafion/MWCNTs/HRP生物傳感器，用于痕量TNT的檢測。

本研究基于Fe3O4MNPs的類過氧化物酶催化活性，構建了Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2-DNT反應體系，探討了Fe3O4MNPs在催化降解硝基苯類化合物中的應用；根據在硝基苯類化合物降解中會消耗H2O2，進而會影響Fe3O4-MNPs-ABTS-H2O2-DNT反應體系中有色氧化態ABTS的生成機理，建立了一種快速檢測DNT的比色分析方法。本方法儀器設備簡單、準確度高、分析成本低，易于實現現場檢測，具有潛在應用價值。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Cary 50紫外-可見分光光度計（美國瓦里安公司）。

二硝基甲苯（DNT）和2，2'-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）（美國Sigma-Aldrich公司）；FeCl3，FeCl2，NH3·H2O和30%H2O2（上?；瘜W試劑公司）；其余試劑均為分析純；實驗用水為二次去離子水。乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH 4.0）。河水樣品分別取自華東師范大學麗娃河水（樣品1）及上海市農業科學院河水（樣品2）。

2.2 實驗方法

2.2.1 Fe3O4MNPs制備 參照文獻［6］方法制備:將5.0 mL 1.0 mol/L FeCl3與1.0 mL 2.0 mol/L FeCl2溶液混合，通氮除氧10 min后，加入50 mL 0.7 mol/L NH3·H2O，在室溫和氮氣氛中攪拌30 min。制得的Fe3O4MNPs用磁鐵分離，水洗3次后，在氮氣氛中干燥。取0.16 g Fe3O4MNPs重新分散于30 mL水中（濃度為5.3 mg/mL），室溫下放置待用。

2.2.2 Fe3O4MNPs的類過氧化物酶活性考察 將10 μL Fe3O4MNPs（5.3 mg/mL）、20 μL 0.1 mol/L H2O2和24 μL 0.1 mol/L ABTS加入到946 μL 0.2 mol/L乙酸鹽緩沖溶液（pH=4.0）中，在50℃水浴中反應10 min。磁分離去除Fe3O4MNPs。反應液用水稀釋10倍，測定紫外-可見吸收光譜。

2.2.3 Fe3O4MNPs催化降解DNT 除了在初始反應液中加入10 μL 1 mmol/L DNT外（DNT終濃度為10μmol/L），其余步驟與2.2.2節相同。

2.2.4 影響因素考察以及標準曲線的建立 在反應體系中，通過調節加入乙酸鹽緩沖溶液的量，保持初始反應液體積為1 mL，分別研究了Fe3O4MNPs含量、反應體系溫度、H2O2濃度、ABTS濃度、反應時間等對吸光度的影響。其它實驗步驟與2.2.2和2.2.3節相同。在最優實驗條件下，于Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2反應體系中加入不同濃度的DNT，建立DNT濃度與吸光度值的標準曲線。

3 結果與討論

3.1 DNT的檢測機理

HRP可催化H2O2氧化TNT生成氧化態的TNT［19，20］，而Fe3O4MNPs具有類似過氧化物酶活性，因此推測Fe3O4MNPs可以進行反應（1）。由于反應（1）會消耗溶液中的H2O2，進而會影響反應（2）中生成的有色的氧化態ABTS的量。因此，根據生成的氧化態ABTS的量的不同所導致吸光度的變化，可實現DNT的定量檢測。

3.2 Fe3O4MNPs的類過氧化物酶活性及其在DNT檢測中的應用

通過Fe3O4MNPs催化H2O2氧化ABTS的反應，考察了Fe3O4MNPs的類過氧化物酶活性。如圖1曲線（a）所示，不加入H2O2時，ABTS與Fe3O4MNPs的反應液無可見吸收峰，為無色溶液；在加入H2O2后，如曲線（c）和（e）所示，在417 nm處出現氧化態ABTS的吸收峰，溶液顏色也表現為不同深淺的綠色，證明ABTS被H2O2氧化，生成氧化態ABTS。在加入Fe3O4MNPs后，生成的氧化態ABTS的吸收峰強度為不加入Fe3O4MNPs時的3.25倍，表明所制備的Fe3O4MNPs對于H2O2氧化ABTS具有較高的催化活性。

為驗證Fe3O4MNPs是否可催化H2O2氧化DNT，在上述實驗基礎上，考察了反應液中加入DNT后吸收峰的變化。由圖1可見，與不加DNT相比（如曲線c和e所示），在含有ABTS和H2O2溶液中加入DNT后（如曲線b和d所示），反應液在417 nm處的吸收峰強度都明顯減小，表明無論是否存在Fe3O4MNPs，DNT都會消耗反應體系中的H2O2。另外，在無Fe3O4MNPs參與反應的條件下，吸光度值僅降低了0.054（曲線b和c），而在Fe3O4MNPs的催化下，加入DNT后反應液的吸光度值降低了0.215（曲線d 和e），表明Fe3O4MNPs可以催化H2O2氧化DNT的反應，由于反應體系中的H2O2被消耗，因此反應體系的吸光度值降低。

圖1 含有2.4 mmol/L ABTS的乙酸緩沖溶液（pH 4.0）中分別加入（a）Fe3O4MNPs，（b）H2O2和DNT，（c）H2O2，（d）H2O2、DNT及Fe3O4MNP，（e）H2O2和Fe3O4MNPs后，在50℃水浴中反應10 min后的吸收光譜圖。H2O2和DNT終濃度分別為2.0 mmol/L及10μmol/L。插圖為各曲線對應的反應液的照片。Fig.1 Absorption spectra of NaAC-HAC buffer solution（pH 4.0）containing 2.4 mmol/L 2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate（ABTS）solutions in the presence of（a）Fe3O4magnetic nanoparticles（MNPs）；（b）H2O2and 2，4-dinitrotoluene（DNT）；（c）H2O2；（d）H2O2，DNT and Fe3O4MNP；（e）H2O2and Fe3O4MNPs after incubated at 50℃ for 10 min.The final concentrations of H2O2and DNT were 2.0 mmol/L and 10μmol/L，respectively.Inset is the typical photograph of the corresponding curve.

3.3 Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2-DNT反應體系影響因素的考察

3.3.1 Fe3O4MNPs濃度的影響 Fe3O4MNPs不僅可以催化H2O2與ABTS的反應，同時可以催化H2O2與DNT的反應。從圖2可見，在加入DNT后，隨著Fe3O4MNPs含量的增大，反應液吸光度值的減小值（ΔA）也逐漸變大。當Fe3O4MNPs含量大于50 mg/L時，其吸光度差值趨于穩定。因此，后續實驗中采用50 mg/L Fe3O4MNPs。

3.3.2 反應溫度的影響 研究了反體系在417 nm的吸光度值隨溫度在40℃ ～70℃范圍內的變化關系。如圖3所示，無論是否加入DNT，反應液的吸光度值都隨著溫度的升高而線性增大。當加入DNT后，Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2-DNT反應體系的斜率值明顯小于未加DNT時反應體系的斜率；且隨著溫度的升高，反應液吸光度值的減小值（ΔA）也增大?？紤]到反應溫度過高會限制本反應體系的實際應用，本研究選擇50℃作為體系最佳反應溫度。

圖2 Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2反應體系在不加入及加入10μmol/L DNT后，吸光度值隨Fe3O4磁性納米粒子含量變化曲線。H2O2與ABTS濃度分別為2.0 和2.4 mmol/L，反應溫度為50℃，反應時間為10 min。Fig.2 Fe3O4MNPs concentration-absorbance（417 nm）curve of Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2system in the absence and presence of 10μmol/L DNT；The concentrations of H2O2and ABTS are 2.0 and 2.4 mmol/L，respectively. The reaction temperature is 50℃.The reaction time is 10 min.

3.3.3 H2O2濃度的影響 研究了反應液的吸光度值隨H2O2濃度在0.5～10 mmol/L范圍內的變化關系。如圖4所示，Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2反應體系的吸光度值隨著H2O2濃度增大而增大，當H2O2濃度大于8 mmol/L時，吸光度達到最大值。加入DNT后，反應液的吸光度值隨著H2O2濃度在0.5～10 mmol/L范圍內升高而呈增大趨勢。當H2O2濃度為2.0 mmol/L時，二者的吸光度差值（ΔA）接近最大值。然而當H2O2增加到10 mmol/L時，ΔA反而大幅度降低，表明在反應體系中加入過量的H2O2反而不利于DNT的檢測，這與文獻［21］報道相似。推測主要有兩個原因:（1）H2O2與DNT在Fe3O4MNPs表面上吸附存在競爭性關系，在Fe3O4MNPs含量一定的條件下，過量H2O2吸附在Fe3O4MNPs表面，會抑制DNT在Fe3O4MNPs表面的吸附，使Fe3O4MNPs表面上參與反應的DNT含量減少，進而不利于DNT的檢測；（2）過量H2O2會誘導產生 —OH自由基作為自由基清除劑，抑制H2O2氧化反應的進行，降低反應效率。因此，選擇2.0×10-3mol/L為最佳H2O2濃度。

圖3 Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2反應體系在不加及加入10μmol/L DNT后，吸光度值隨溫度變化曲線。H2O2與ABTS濃度分別為2.0和2.4 mmol/L，反應時間為10 min。Fig.3 Temperature-response curve for Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2in the absence and presence of 10μmol/L DNT.The concentration of H2O2and ABTS is 2.0 and 2.4 mmol/L，respectively.The reaction time is 10 min

圖4 Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2反應體系在不含有DNT及加入10μmol/L DNT后，其吸光度值隨H2O2濃度變化曲線；其中ABTS濃度為2.4 mmol/L，反應溫度和反應時間為50℃和10 min。Fig.4 H2O2concentration-response curve for Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2in theabsenceand presenceof 10μmol/L DNT. The concentration of ABTS is 2.4 mmol/L.The reaction temperature and time is 50℃and 10 min，respectively

3.3.4 ABTS濃度 考察了ABTS濃度在0.02～4.0 mmol/L范圍內反應液的吸光度值的變化情況。如圖5所示，在Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2反應體系中，無論是否加入DNT，反應液的吸光度值均隨著ABTS濃度的增大而增大。當ABTS濃度大于3.2 mmol/L時，吸光度值趨于穩定。當ABTS濃度為2.4 mmol/L時，二者的吸光度差值（ΔA）接近最大值。而當ABTS濃度為4.0 mmol/L時，ΔA降低，這是由于ABTS與DNT均可與H2O2反應，二者存在一定競爭關系。當ABTS濃度過量時，會抑制DNT與H2O2反應，使得H2O2與DNT反應中消耗的H2O2量變少，從而不利于DNT的檢測。因此選擇ABTS最佳濃度為2.4 mmol/L。

3.3.5 反應時間的優化 考察了反應時間對該反應體系的影響。如圖6所示，對于Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2-DNT和Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2反應體系，反應體系的吸光度值均隨反應時間的增加而線性增大，而且前者的斜率略小于后者。當反應時間大于10 min，二者的吸光度差值（ΔA）變化不大，為節約反應時間，本工作確定10 min為最佳反應時間。

通過對實驗參數的優化，確定反應體系的最佳條件為:反應溫度為50℃，反應時間為10 min，H2O2濃度為2.0 mmol/L，ABTS濃度為2.4 mmol/L。

3.4 線性范圍、檢出限、重現性及穩定性

在最優化實驗條件下，測定Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2-DNT反應體系中，加入不同濃度的DNT后的吸光度值。如圖7所示，417 nm處的吸光度值與DNT濃度在5×10-7～2.0×10-5mol/L范圍內呈線性關系，檢出限為1.5×10-7mol/L（S/N=3），低于文獻［22，23］報道的采用大孔碳材料及分子印跡材料修飾電極電化學檢測DNT的檢測限，表明在Fe3O4MNPs催化作用下，所建立的檢測方法對DNT具有較高的靈敏度。

圖5 Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2反應體系在不含有DNT及加入10μmol/L DNT后，其吸光度值隨ABTS濃度變化曲線；其中H2O2濃度為2.0 mmol/L，反應溫度為50℃，反應時間為10 min。Fig.5 ABTS concentration-response curve for Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2system in the absence and presence of 10μmol/L DNT；The concentration of H2O2and ABTS is 2.0 and 2.4 mmol/L，respectively.Reaction temperature is 50℃ and reaction time is 10 min，respectively.

圖6 Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2反應體系在不含有DNT及加入10μmol/L DNT后，吸光度值隨反應時間變化曲線；其中 H2O2與 ABTS濃度分別為2.0和2.4 mmol/L，反應溫度為50℃。Fig.6 Reaction time-response curve for Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2system in the absence and presence of 10μmol/L DNT，respectively. The concentration of H2O2and ABTS is 2.0 and 2.4 mmol/L.The reaction temperature is 50℃

圖7 Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2-DNT反應體系在加入不同濃度DNT后溶液顏色變化（A）以及吸收光譜（B）。其中反應溫度為50℃，反應時間為10 min，H2O2濃度為2.0 mmol/L，ABTS濃度為2.4 mmol/L。所加入DNT濃度分別為（1）0，（2）0.5，（3）0.75，（4）1.0，（5）2.0，（6）5.0，（7）10，（8）20μmol/L。圖（C）為反應體系在417 nm處吸光度值與DNT濃度線性關系曲線。Fig.7 Typical photographs（A）and absorption spectra（B）of Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2-DNT reaction solutions incubated at 50℃ for 10 min in the presence of different concentrations of DNT:（1）0，（2）0.5，（3）0.75，（4）1.0，（5）2.0，（6）5.0，（7）10，（8）20μmol/L，respectively.2.0 mmol/L H2O2，2.0 mmol/L ABTS. （C）gives the linear correlation between the DNT concentrations and absorbance at 417 nm.

在5組Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2反應體系中，分別加入5.0μmol/L DNT，測定的吸光度值相對標準偏差僅為2.5%，表明建立的比色分析法對DNT的檢測具有良好的重現性。另外，采用所建立的方法對5.0μmol/L DNT每天測定一次，連續測定10天，吸光度值的相對標準偏差僅為3.5%，表示所建立的檢測方法具有很好的穩定性。

3.5 實際水樣測定

將所建立的方法用于河水樣品DNT的分析測定，考察所建立檢測方法的實用性。在兩種水樣中均未檢出DNT。在上述水樣中DNT的標準加入實驗結果如表1所示。在河水樣品中DNT的平均回收率為85.0%～95.1%，RSD小于5.0%（n=5），表明在實際樣品測定中，采用本方法所得實驗數據可靠，有望用于其它環境水樣的分析。

表1 實際水樣中回收率的測定Table 1 Recoveries of DNT in spiked water samples（n=5）

4 結論

四氧化三鐵磁性納米顆粒由于具有類過氧化物酶的催化活性，可以催化H2O2氧化ABTS反應，同時可以催化H2O2氧化DNT反應，消耗反應物H2O2?；谏鲜鲈?，本研究構建了Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2-DNT反應體系，體系在417 nm處的吸光度值與DNT濃度在5× 10-7～2.0×10-5mol/L呈良好的線性關系，檢出限為1.5×10-7mol/L（S/N=3），所建立的比色分析方法簡便、快速、靈敏、可靠，在現場快速監測環境中硝基苯類化合物方面具有潛在應用價值。根據文獻［21，24］報道，Fe3O4MNPs還可以催化多種過氧化物酶底物（如硝基苯類化合物、芳香胺化合物、酚類化合物等）與H2O2反應。因此，基于該反應原理，本研究所建立的反應體系也適用于其它硝基苯類化合物、芳香胺化合物、酚類化合物的檢測。本工作為Fe3O4MNPs模擬酶在硝基苯類化合物、芳香胺化合物、酚類化合物等環境污染物的快速檢測應用及相關理論研究開辟了新途徑，提供了重要參考。

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This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.31301494）.

Fe3O4Magnetic Nanoparticles as Peroxidase Mimetics Used in Colorimetric Determination of 2，4-Dinitrotoluene

NIE Dong-Xia1，SHI Guo-Yue*2，YU Yan-Yan31（Institute of Agro-food Standards and Testing Technologies，
Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China）
2（Department of Chemistry，East China Normal University，Shanghai 200062，China）
3（Department of Pharmaceutical Analysis，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221004，China）

Fe3O4magnetic nanoparticles（Fe3O4MNPs）were prepared by co-precipitation method，which possessed intrinsic peroxidase-like activity.It was found that the as-prepared Fe3O4MNPs could not only catalyze the oxidation of peroxidase substrate，diammonium 2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate）（ABTS）by H2O2to produce the colored product with maximum absorbance at 417 nm，but also catalyze the oxidation of 2，4-dinitrotoluene（DNT）by H2O2and thus consume H2O2in the reaction system.On the basis of the reaction described above，a novel colorimetric reaction system based on Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2-DNT was established for determination of trace amount of DNT.Some key influencing factors of the proposed Fe3O4MNPs-ABTS-H2O2-DNT system were systematically discussed and optimized.Under the optimal conditions，the absorbance of the system at 417 nm displayed a good linear response with DNT concentration in the range from 5×10-7to 2.0×10-5mol/L with a detection limit of 1.5 ×10-7mol/L（S/N=3）.These results demonstrated that the constructed colorimetric method was simple，rapid and sensitive enough for colorimetric detection of DNT，which would have a great potential in the application of on-line monitoring of DNT in environmental water samples.

2，4-Dinitrotoluene；Ferroferric oxide magnetic nanoparticles；Peroxidase mimetics；Colorimetric method

20 April 2015；accepted 15 October 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150319

2015-04-20收稿；2015-10-15接受

本文系國家自然科學基金（No.31301494）項目資助

* E-mail:gyshi@chem.ecnu.edu.cn