分子印跡固相萃取聯用高效液相色譜分離測定海水中的膝溝藻毒素GTX1，4

梅曉頎 何秀平 王江濤

（中國海洋大學海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室，青島 266100）

分子印跡固相萃取聯用高效液相色譜分離測定海水中的膝溝藻毒素GTX1，4

梅曉頎 何秀平 王江濤*

（中國海洋大學海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室，青島 266100）

采用分子印跡技術，以鳥嘌呤核苷為虛擬模板，本體聚合，合成GTX1，4的分子印跡聚合物（MIP）。傅里葉紅外變換光譜（FT-IR）和掃描電子顯微鏡（SEM）的結果顯示，MIP具有分布均勻、大小均一的孔穴。平衡吸附實驗表明，分子印跡聚合物（MIP）比非分子印跡聚合物（NIP）具有更高的結合容量，對膝溝藻毒素GTX1，4有更好的選擇性。用MIP填充固相萃取小柱（MISPE），以0.1 mol/L乙酸溶液為淋洗液，甲醇-水（95∶5，V/V）溶液為洗脫液時回收率最高，達到85.0%。用優化后的淋洗洗脫條件測定微小亞歷山大藻和塔瑪亞歷山大藻藻液中的GTX1，4，分別為1.10和0.99 μg/L，RSD分別為3.3%和4.4%，說明本方法具有較好的檢測限和較高的測定精密度。

膝溝藻毒素GTX1，4；分子印跡固相萃??；分離富集；微小亞歷山大藻；塔瑪亞歷山大藻

1 引言

麻痹性貝毒（Paralytic shellfish poisoning，PSP）是一類以石房蛤毒素（Saxitoxin，STX）為骨架，具有四氫嘌呤結構的生物堿分子。根據取代基的不同，可將其分為四類化合物［1］:氨基甲酸酯類毒素（Carbamate toxins）、N-磺酰胺甲?；惗舅兀∟-Sulfocarbamoyl toxins）、脫氨甲?；惗舅兀―ecarbamoyl toxins）以及脫氧脫氨甲?；惗舅兀―eoxydecarbamoyl toxins）。膝溝藻毒素1，4（GTX1，4）就是一類氨基甲酸酯類毒素，是赤潮發生時海水中存在的主要藻毒素之一，其產毒藻種主要有亞歷山大藻屬（Alexandrium）的A.tamarense、A.minutum，膝溝藻屬（Gonyaulax）的G.tamarensis，裸甲藻屬（Gymnodinium）的G.catenatum，以及旋溝藻屬（Prodinium）的P.bahamense var.compressum等屬種［2～5］。同時，由于PSP在貝類中大量富集，人類誤食后易中毒，其毒性機理是:PSP的活性部位與神經細胞膜上Na+通道位點1的氨基酸殘基高度結合，阻斷了Na+通道，從而產生麻痹作用［6，7］，使人頭疼、頭暈，呼吸困難，甚至死亡［8］，因此研究一種快速高效測定PSP的方法非常重要。

目前，檢測PSP的方法主要有生物檢測法和色譜法等，其中色譜法是現在最普遍的方法。生物檢測法包括小鼠生物測試法（Mouse bioassay，MBA）［9，10］和酶聯免疫法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）［11，12］；色譜分析法主要是高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS）［13］，包括柱前衍生［14］和柱后衍生［15］。雖然HPLC-MS具有高選擇性和靈敏度、檢測限低等優點，但存在費時、成本高且技術要求高等缺點，限制了其廣泛應用。

分子印跡固相萃取技術（MISPE）作為一種常見的分離富集技術，能夠選擇性地吸附目標物質，再通過合適的淋洗、洗脫步驟，使目標物質分離富集。該技術具有高選擇性、高特異性結合能力、高靈敏度和高回收率等優勢，且成本低，耗時少，技術要求不高，已逐漸成為分離富集及檢測微量、痕量物質的普遍方法。

本研究采用本體聚合法，以GTX1，4結構類似物鳥嘌呤核苷為模板，甲基丙烯酸（MAA）為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯劑，偶氮二異丁腈（AIBN）為引發劑，合成了分子印跡聚合物，對該聚合物的性質進行了相關分析，并測定了塔瑪亞歷山大藻和微小亞歷山大藻藻液中GTX1，4的濃度。

2 實驗方法

2.1 儀器、試劑與材料

日立Hitachi D-2000 Elite高效液相色譜，L-2485熒光檢測器；Nicolet Avatar-360傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）；日立Hitachi S-4800冷場發射掃描電鏡（SEM）；Millipore Milli-Q超純水儀。

GTX1，4標準品（GTX1濃度為（60.4±3.1）μmol/L，GTX4濃度為（19.7±1.6）μmol/L，加拿大國家海洋研究所）；鳥嘌呤核苷（99%，上海阿拉丁生化科技）；MAA（99%，天津博迪化工）；EGDMA（98%，上海阿拉丁生化科技）；AIBN（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；高碘酸（電泳純，Sigma-Aldrich公司）；甲酸銨（HPLC純，Sigma-Aldrich公司）；冰醋酸（HPLC純，天津市科密歐化學試劑公司），甲醇、乙腈（HPLC純，Merck公司）；塔瑪亞歷山大藻、微小亞歷山大藻（國家海洋局第一海洋研究所）。

2.2 分子印跡聚合物（Molecular imprinted polymer，MIP）的合成

參照文獻［16］的方法合成MIP:將0.1416 g（0.5 mmol）鳥嘌呤核苷溶于15 mL二甲基亞砜（DMSO），加入170.5 μL（2 mmol）MAA，超聲15 min，進行預聚合；加入1.8824 mL（10 mmol）EGDMA和30 mg AIBN，攪拌溶解；將得到的溶液倒入250 mL三口燒瓶中，通N2氣15 min，60℃下，在恒溫電磁攪拌器中本體聚合24 h，得到白色塊狀固體；將固體研碎，以150 mL甲醇-乙酸（9∶1，V/V）溶液為提取液，索氏提取48 h，去除模板分子，每隔一段時間用液相色譜檢測洗脫液中的模板分子，直至色譜圖中無模板分子峰出現，說明洗脫已完全；用甲醇和水反復洗滌固體3次，烘干，研磨過篩，收集40～75目（200 ～450μm）之間的固體。非分子印跡聚合物（Non-molecular imprinted polymer，NIP）在相同條件下合成，只是沒有加入模板分子。

2.3 聚合物形態結構表征

聚合物的分子結構通過傅里葉變換紅外光譜測定（KBr壓片法），聚合物形態通過掃描電鏡表征，表征之前需要噴金處理。

2.4 平衡吸附實驗

稱取20 mg MIP和NIP各5份，分別加入到含2 mL GTX1，4標準品溶液的離心管中（濃度分別為0，25，50，100和200 μg/L）。將離心管置于恒溫振蕩器中，25℃下避光振蕩24 h。用注射器取上層液體，過0.22μm濾膜，再取100 μL過濾后的溶液于液相瓶中待測。

2.5 分子印跡固相萃取柱（Molecular imprinted solid-phase extraction，MISPE）

MISPE的裝柱過程參考文獻［17］的方法。稱取50 mg MIP或NIP進行濕法裝柱，氮氣吹干備用。過柱前先用5 mL甲醇和5 mL水活化柱子，然后分別進行上柱、淋洗和洗脫，探索最佳淋洗與洗脫條件，每兩步之間都須氮氣吹干。分別收集上柱液、淋洗液和洗脫液，進液相色譜測定。

2.6 柱前衍生條件及液相色譜條件

2.6.1 衍生劑的制備及衍生過程 參考文獻［18］的衍生方法，分別配制0.03 mol/L高碘酸溶液、0.3 mol/L甲酸銨溶液和0.3 mol/L磷酸氫二鈉溶液。分別取上述溶液各5 mL混合于燒杯中，用1 mol/L NaOH調至pH 8.2，備用。衍生過程中在100 μL待測溶液中加入500 μL衍生試劑，室溫下反應至少1 min。隨后加入5 μL冰醋酸終止反應。

2.6.2 液相色譜條件 參考文獻［19］的液相色譜條件:流動相為0.1 mol/L甲酸銨溶液（含2%乙腈），流速為1.1 mL/min；色譜柱為Agela TechnologiesVenusil XBP C18（2）（250 mm×4.6 mm），柱溫為30℃；熒光檢測器激發波長為340 nm，發射波長為390 nm。

2.6.3 海水中GTX1，4的測定 取進入穩定期的微小亞歷山大藻和塔瑪亞歷山大藻藻液，經0.45μm濾膜過濾，各取50 mL通過MISPE，在最佳淋洗條件下進行淋洗、洗脫，進液相色譜測定。

3 結果與討論

3.1 聚合物形態結構表征

FT-IR用于觀察聚合物的分子結構并確定模板分子是否成功被洗脫下來（圖1）。圖1為未經過索氏提取的MIP、索氏提取后的MIP及NIP的紅外光譜圖。在圖1a中，1540 cm-1有一個峰，這是C==N的特征吸收峰，證明模板分子已經成功印跡到MIP中；而圖1b和1c幾乎沒有區別，說明經過索氏提取后，MIP中已經沒有模板分子殘余。3550～3400 cm-1是O—H和N—H的伸縮振動，3000和2958 cm-1分別為 C==C—H和C—H的伸縮振動，1732 cm-1為C==O的伸縮振動，1640 cm-1為 C==C的伸縮振動，1265 cm-1為羧基中C—O的伸縮振動，證明聚合物中存在MAA，1158 cm-1為酯基中C—O的伸縮振動，證明聚合物中存在EGDMA。

SEM用于觀察聚合物的表面及內部結構（圖2）。圖2a和2c是 MIP的表面和內部結構，圖2b和2d是NIP的表面和內部結構。從圖2a可見，MIP具有較多分布均勻緊密、孔徑大小均一的孔穴，而NIP不僅孔穴少，且分布不均，這是由于NIP缺少模板分子，而多孔結構的形成與致孔劑和模板分子的作用有關，且在索氏提取中也能形成大量孔穴。這種多孔結構提高了目標分子進入MIP的速率，也增大了MIP的吸附容量。同時，從圖2c與2d中也可見MIP比NIP具有更多分布均勻的孔穴。

圖2 MIP和NIP的表面及內部SEM圖Fig.2 SEM images of MIP（a.surface structure；c，inner stracture）and NIP（b，surface structure；d，inner structure）

3.2 平衡吸附實驗

準確移取適量GTX1，4標準儲備液，用水稀釋。按照2.5節的方法。采用HPLC測定吸附后溶液中剩余的GTX1，4的濃度，根據吸附前后溶液中GTX1， 4的濃度計算MIP和NIP對GTX1，4的結合量Q（ng/g），其計算公式如下:

其中，C0為吸附前的初始濃度（μg/L）；Ce為吸附后的平衡濃度（μg/L）；V為標準溶液的體積（mL）；M為聚合物的質量（g）。

以峰面積（y）對GTX1，4濃度（x）繪制標準曲線，曲線方程式為y=230.25x-1220.5，R2=0.9980。以溶液中GTX1，4的初始濃度為橫坐標，相應的結合量Q為縱坐標，繪制平衡吸附曲線（圖3）。從圖3可見，隨著GTX1，4初始濃度增加，MIP和NIP對GTX1，4的吸附量都呈現不斷增加的趨勢，但MIP的吸附量遠大于NIP，且隨著濃度的增加效果更明顯，說明MIP比NIP具有更高的吸附容量和對GTX1，4更強的結合能力。當初始濃度達到最大（200 μg/L）時，MIP的吸附量為8560 ng/g，遠大于 NIP （6293 ng/g），這是由于模板分子的存在，形成的印跡聚合物內部具有與GTX1，4在空間結構上相互匹配的結合位點，使MIP的結合量遠大于NIP。

3.3 標準溶液的MISPE

以50 μg/L GTX1，4標準溶液為上柱液，淋洗液和洗脫液的選擇參考文獻［17］的方法。以1 mL標準溶液為上柱液，當1 mL 0.1 mol/L乙酸溶液通過MISPE或NISPE時，溶液中幾乎沒有GTX1，4被洗下來（圖4a），說明經過淋洗過程后，大部分雜質被洗了下來，而絕大部分GTX1，4被保留了下來。而當1 mL不同比例的甲醇-水溶液通過固相萃取柱時，可觀察到GTX1，4的液相色譜峰（圖4b）。本研究以0.1 mol/L乙酸溶液為淋洗劑，探討不同比例的甲醇-水溶液作為洗脫劑的洗脫效果見表1。從表1可以看出，隨著甲醇-水比例的上升，MISPE和NISPE的回收率都呈先下降后上升的趨勢，在甲醇∶水體積比為5∶5時，達到最?。ǚ謩e為63.4%和45.5%），在甲醇-水體積比為95∶5時達到最大（分別為85.0%和59.9%）。因此，本研究選擇0.1 mol/L乙酸溶液為淋洗劑，甲醇-水（95∶5，V/V）溶液為洗脫劑。同時，從表1可見，在相同的洗脫條件下，MISPE的回收率都遠大于NISPE，也驗證了MIP比NIP具有更高的結合容量和選擇性。

圖3 MIP和NIP的平衡吸附曲線Fig.3 Static equilibrium adsorption curve of MIP and NIP

圖4 0.1 mol/L乙酸溶液淋洗液（a）和甲醇-水（95∶5，V/V）洗脫液（b）色譜圖（50 μg/L）Fig.4 Chromatogram of gonyautoxins 1，4（GTX1，4）washed by 0.1 mol/L acetic acid（50 μg/L）（a）and methanol-water（95∶5，V/V）（50 μg/L）（b）

表1 不同比例甲醇-水作為洗脫液的GTX1，4回收率Table 1 Recovery of GTX1，4 using different ratio of methanol and water as elution solution

3.4 MISPE對海水中GTX1，4的富集作用

將培養到穩定期的微小亞歷山大藻和塔瑪亞歷山大藻（藻密度分別為2.4×104和2.2×104）的藻液過濾后，通過MISPE富集50倍，即將50 mL藻液通過MISPE后，分別用1mL淋洗液和洗脫液進行處理，收集洗脫液通過HPLC進行檢測，得到的色譜圖見圖5a和圖5b，在微小亞歷山大藻和塔瑪亞歷山大藻藻液中都檢測到了GTX1，4，其濃度分別為1.10和0.99 μg/L，RSD分別為3.3%和4.4%，說明HPLC的精密度良好，可用于GTX1，4的測定。

圖5 微小亞歷山大藻（a）和塔瑪亞歷山大藻（b）洗脫液色譜圖Fig.5 Elution chromatograms of Alexandrium minutum（a）and Alexandrium tamarense（b）

4 結論

利用本體聚合法，以DMSO為溶劑，鳥嘌呤核苷為模板，MAA為功能單體，EGDMA為交聯劑，AIBN為引發劑60℃下熱引發合成了分子印跡聚合物。通過FT-IR和SEM發現MIP具有較多分布均勻緊密、孔徑大小均一的孔穴。平衡吸附實驗表明，MIP比NIP具有更高的結合容量和對GTX1，4的選擇性。以0.1 mol/L乙酸溶液為淋洗液，甲醇-水（95∶5，V/V）溶液為洗脫液，可以有效分離富集GTX1，4，回收率達到85.05%。同時，在此淋洗條件成功的檢測出了微小亞歷山大藻和塔瑪亞歷山大藻藻液中的GTX1，4，說明此方法可有效用于分離富集海水中的GTX1，4，為檢測海水中的GTX1，4提供了一種新思路。

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Separation and Determination of Gonyautoxins 1，4 in Seawater by Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction Coupled with High Performance Liquid Chromatography

MEI Xiao-Qi，HE Xiu-Ping，WANG Jiang-Tao*
（Key Laboratory of Marine Chemistry Theory and Technology Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266100，China）

A kind of molecular imprinted polymer（MIP）was synthesized by bulk polymerization using guanosine as dummy template molecule.The results of Fourier transform infrared spectrometer（FT-IR）and scanning electron microscope showed that MIP had homogenous and uniform-sized cavities.It was confirmed that MIP had higher binding affinity and selectivity towards gonyautoxins 1，4（GTX1，4）than NIP according to the static equilibrium adsorption.The solid phase extraction columns were packed with MIP.The maximum recovery（85.05%）of MISPE was achieved using 0.1 mol/L acetic acid as washing solution and ethanolwater（95∶5，V/V）as elution solution.Then the concentrations of GTX1，4 from culture solution of Alexandrium minutum and Alexandrium tamarense were determined to be 1.10 and 0.99 μg/L，respectively，under the optimum conditions of washing and elution，and RSD was 3.3%and 4.4%，respectively，indicated good LOD and higher precision.

Gonyautoxins 1，4； Molecularly imprinted solid phase extraction； Separation and preconcentration；Alexandrium minutum；Alexandrium tamarense

19 September 2015；accepted 4 December 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150744

2015-09-19收稿；2015-12-04接受

* E-mail:jtwang@ouc.edu.cn