逆流色譜研究進展

吳大同 潘遠江

（浙江大學化學系，杭州 310027）

評述與進展

逆流色譜研究進展

吳大同 潘遠江*

（浙江大學化學系，杭州 310027）

逆流色譜（Counter-current chromatography，CCC）是以分析物在液-液兩相溶劑中的分配差異為核心的快速分離技術。近年來，逆流色譜對復雜樣品的分離，尤其是對天然產物的分離已獲得廣泛的關注。本文綜述了近年來逆流色譜在儀器改進、溶劑體系篩選等領域的研究進展，并介紹了CCC在分離手性化合物中的應用前景。最后，對該領域未來的研究內容進行了展望。

逆流色譜；儀器改進；溶劑體系；手性分離；評述

1 逆流色譜簡介

20世紀70年代，美國國家健康研究院Ito博士發明了逆流色譜。逆流色譜（Counter-current chromatography，CCC）是一種連續液-液分配色譜技術，無需任何固態支撐體，依托于兩相溶劑連續有序的重復混合實現分析物高效分離。經過40多年的發展與完善，逆流色譜作為一種高效的制備或半制備分離技術已廣泛用于分離復雜樣品，如天然產物［1～10］，生物蛋白［11～15］，納米粒子［16］等。與以固相載體作為固定相的色譜技術相比，其具有樣品損失小、無不可逆吸附、分辨率高等優點［17］。因此，逆流色譜正被越來越多的分離工作者接納。至今，已經建立了快速分析型CCC，半制備型CCC，大分子蛋白質分離用的CCC以及pH區帶制備型CCC。眾多的應用實例表明，逆流色譜憑借其獨特的優勢，已成為現代分離技術不可缺少的手段之一。

本文主要對近5年逆流色譜在儀器改進、溶劑體系篩選等領域的研究進展進行綜述，重點介紹了圍繞提高固定相保留值而進行的儀器改進，并對CCC在分離手性化合物中的應用做了簡要介紹。

2 逆流色譜儀器的優化和改進

發展快速、高效的色譜分離技術是分離工作者不斷追求的目標。經過多年發展，特別是2000年以來，制備或半制備型逆流色譜在儀器改進、設計方面已取得較大的突破，主要包括以下幾個方面：（1）色譜柱幾何構型的設計；（2）多重色譜柱的串、并聯設計；（3）多維逆流色譜以及逆流色譜與制備液相色譜聯用技術。圍繞這三方面，研究人員做了大量的系統工作。設計出多種獨具特色且高效的逆流色譜，顯著提高了復雜樣品的分離效率，大大縮短了分離時間。

其中，對色譜柱的改進，即是增加其固定相保留值。固定相保留值是逆流色譜的一個重要參數。通常，保留值越高，分離得到的峰分辨率就越好。但是，傳統逆流色譜普遍存在著固定相保留值較低的缺點（＜40%）。近年來，針對這個問題，研究人員對色譜柱幾何構型進行了改進。

Liang等［18］構建了新型圓錐體色譜柱的逆流色譜（圖1），并在理論上得到了最優的圓錐體構造關系，他們發現，不同于傳統的圓柱體色譜柱，該型色譜柱能顯著提高固定相保留值，最高可達71.56%。此外，Cao等［19］設計了螺旋管圓盤柱，使固定相保留值提高了10%，并成功應用于對大極性化合物的分離。這些設計都有效地提高了逆流色譜的分離能力，證明了對色譜柱的優化是一種可靠的方案。

改進多重色譜柱的串、并聯設計是提高逆流色譜分離效率的另一種重要途徑。如今廣泛使用的高速逆流色譜［20～24］，就是利用螺旋管的一種特殊的同步行星式運動模式（J型模式），能夠實現快速、高效分離。然而，由于其運動模式的限制，大極性溶劑體系很難在色譜柱中得到保留，因此對多肽、糖類以及蛋白質等大極性化合物分離效果很差。

圖1 （A）圓錐體色譜柱設計示意圖和（B）實物圖［18］Fig.1 （A）Schematic illustration of upright conical coils and（B）photographs of the product［18］

Shinomiya等［25］以主、從動軸不同的轉動方式構建了交叉軸螺旋管式離心型逆流色譜（圖2），具體運動方式為支撐軸在水平方向轉動，從動軸在豎直方向轉動。與傳統的J型螺旋管式離心型逆流色譜相比，其對大極性溶劑體系具有較好的固定相保留值，能夠顯著提高大極性化合物的分離效率。實驗表明，該型逆流色譜可以基于雙水相系統成功分離5種多糖類似物。此外，該設計極大地豐富了逆流色譜色譜柱的設計思路，為儀器的改進提供了較佳方案。

圖2 （A）J-型螺旋管和交叉軸型螺旋管運動模式設計示意圖及（B）實物圖［25］Fig.2 （A）Schematic illustration of planetary motions of the type-J coil planet centrifuge（CPC）and cross-axis CPC and（B）photograph of the product［25］

其后，該研究小組又利用4個偏心軸將同步行星式運動模式（J型模式）與非同步離心模式（I型模式）結合，構建了新型四柱并聯逆流色譜（圖3）［26］，并分別測試了以頭到尾和尾到頭洗脫方式分離復雜樣品。無論是以上相或下相為固定相，都具有較高的固定相保留值和較好的分離度。該方法既能保留兩種不同運動模式的優點，又能擴大其應用范圍，適用于分離極性差別大的復雜樣品。

多重色譜聯用技術是提高分離效率的有效手段之一。近年來，Qiu等［27，28］利用獨特的接口技術和不間斷分離模式，發展了逆流色譜與制備型液相色譜聯用技術（圖4）。以逆流色譜為第一維分離，制備液相色譜為第二維分離，一次性分離得到12種化合物，且純度達到90%以上。該結果表明，多維色譜技術能有效的結合每個色譜的技術特點，綜合利用其優勢使分離效率達到最優化。

為了進一步優化二維逆流色譜系統，本課題組設計了一種新型二維逆流色譜接口技術［29］。如圖5所示，該系統結合了固相萃取技術，用固相萃取小柱除去一維產生的大量溶劑，同時將目標樣品吸附在固相萃取柱上。通過少量的流動相即可將固相萃取柱上的樣品引入二維分離。該逆流色譜系統通過特殊的接口及色譜聯用設計實現了兩柱并聯集成化，大大提高了逆流色譜的分離效率。其后，本課題組又利用該二維逆流色譜系統開發出兩種不同類型溶劑體系，同時在線分離大黃提取物中的4種蒽醌類化合物［30］。具體操作步驟如下：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1∶1∶1∶1，V/V）作為第一維逆流色譜溶劑體系；甲基叔丁基醚-乙腈-水（2∶2∶3，V/V），上相加入三氟乙酸（10 mmol/L），下相加入三乙胺（10 mmol/L）的酸堿溶劑體系作為第二維逆流色譜溶劑體系，實現了對復雜樣品的高效、快速分離。

圖3 （A）J型模式和I型模式并聯設計示意圖和（B）實物圖［26］Fig.3 （A）Schematic illustration of type-J forward and type-I backward columns and（B）photograph of the product［26］

圖4 CCC和制備型HPLC聯用設計示意圖［27］Fig.4 Scheme for flow programming CCC×preparative HPLC system［27］CCC：Counter-current chromatography.

綜上所述，無論是對色譜柱的幾何構型優化設計，還是對多重色譜柱的串、并聯設計，均是為了增加固定相保留值，提高逆流色譜的分離度。此外，合理的多維色譜聯用設計能綜合不同色譜的技術優點，顯著提高分離效率。

3 溶劑體系的選擇和優化

選擇合適的溶劑體系是逆流色譜分離化合物最為關鍵一步，占全部工作量的90%以上。因此，建立合理的溶劑篩選策略，選擇合適的溶劑體系無疑是極其重要的。近年來，研究者陸續開發了新的溶劑篩選策略。針對四元溶劑體系：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，Margraff定義了其中的23種溶劑體系，并用字母命名A～Z定義了這23個溶劑體系（除E，I和O外），這些溶劑體系又被命名為Arizona體系。每個溶劑體系中正己烷/乙酸乙酯的比例與甲醇/水的比例必須保持一致。本課題組首先研究了溶質的分配系數以及Arizona體系從親水性的溶劑體系（乙酸乙酯-水）到疏水性溶劑體系（正己烷-甲醇）的極性變化關系［31］，以此提出了新的篩選策略（圖6），AZ系統被分成4個部分：Ⅰ親水性，A～H；Ⅱ弱親水性，J～M；Ⅲ弱疏水性，N～S；Ⅳ疏水性，T～Z。結果表明，利用三柱并聯分析型逆流色譜。僅需3次即可獲得最佳溶劑體系。該策略顯著縮短了獲得合適的溶劑體系所需要的時間，極大地提高了分離效率。

圖5 二維逆流色譜設計示意圖［29］Fig.5 Scheme of two-dimensional counter-current chromatography［29］

圖6 基于AZ兩相體系的復雜物物質快速篩選策略［31］Fig.6 Rapid screening strategy of a complex mixture based on liquid compositions of the AZ liquid system［31］

最近，研究人員發現利用建模的方法歸納出兩相體系中溶質的分配系數規律具有一定的可行性。具體步驟如下：首先，利用少量實驗數據得出溶質分配系數的一定規律，并用相應的數學方程式表示；其次，根據已建立的數學模型，尋找最佳的溶劑篩選體系。Hopmann等［32，33］基于非平衡溶劑化能數值計算的類導體屏蔽模型（COSMO-RS）對逆流色譜的溶劑體系進行篩選。結果表明，該模型可以準確地預測兩相溶劑系統的變化對溶質分配系數的影響，并以此篩選出合適的溶劑體系。Ren等［34，35］創新性地引入熱力學模型（非隨機兩相液體模型，NRTL），其可對逆流色譜常用的兩相溶劑系統的液-液平衡組成成分進行準確估算。具體篩選過程如圖7所示：根據實驗測定的溶質分配系數及其相應的溶劑體系計算NRTL模型參數，并用標準品數據證明該參數模型的可行性。其中，活度系數是非常重要的中間參數，該值的準確性將決定該模型能否準確預測合適的溶劑體系。

此外，傳統的溶劑體系（正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，甲基叔丁醚-乙腈-水等）適用于分離極性較小或中等極性的化合物。但對于一些大極性、容易失活的樣品，此類溶劑體系并不能滿足分離要求。因此，一些新的溶劑體系被開發用于分離多糖、多肽、蛋白質等樣品。Yin等［36］利用雙水相系統PEG1000-MgSO4-H2O（12∶16∶72，w/w）實現一步分離3種不同分子量的多糖。Bezold等［37］開發新型的溶劑體系［Emim］Cl-K2HPO4/KH2PO4-H2O，成功實現3種蛋白質（即溶解酵素、肌紅蛋白和牛血清蛋白）的分離。研究表明，含有離子液體的雙水相系統具有對樣品不易失活、對大極性化合物具有較好的分配系數等優點。Wu等［38］以正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水（4∶3∶4∶4，V/V）三相系統為基礎，以上層為固定相，下層為流動相。分離得到白芷提取物中8種香豆素類化合物；以上層為固定相，中間層為流動相，分離達到高良姜提取物中6種二芳基庚烷類衍生物；以中間層為固定相，下層為流動相，分離得到知母提取物中3種化合物。綜上所述，合適的溶劑體系有助于擴大逆流色譜的分離對象，增加其應用范圍。表1列舉了近年開發的新型溶劑體系。

圖7 NRTL模型的設計流程圖［34］Fig.7 Scheme of procedure of NRTL model［34］

表1 近年開發的新型溶劑體系Table 1 Novel liquid-liquid solvent systemin recent years

4 基于逆流色譜對手性化合物的拆分及其展望

手性對映體是一類具有特殊光學性質的化合物，其在精細化學品、生命科學以及醫藥中間體等領域占有及其重要的地位。大量制備單構型手性化合物一直是分離工作者不斷追求的目標。然而，現有的色譜分離技術，如液相色譜、氣相色譜和毛細管電泳，存在著樣品容量小和成本高等缺點，限制了其在手性拆分中的應用。

逆流色譜分離手性物質無疑還處于實驗階段。近年來，環糊精及其衍生物、蛋白質等都被嘗試作為基于逆流色譜分離方法的手性拆分劑。Han等［44，45］以環糊精和銅（II）絡合物為手性拆分劑，成功拆分D/L-扁桃酸及其類似物。實驗結果表明，溫度、溶劑pH值和被分析物濃度都會對分離效率產生影響。Ito等［46］首次嘗試以牛血清蛋白為手性拆分試劑，基于螺旋管式逆流色譜雙水相體系分離單構型的D/L-色氨酸。他們比較了液相色譜和逆流色譜在手性拆分中的優缺點，其以羥丙基-β-環糊精為手性拆分劑分離苯基丙酸對映體［47，48］。結果表明，液相色譜和逆流色譜對手性拆分都各有其優勢，制備型液相色譜適用于高效分離少量的手性化合物；逆流色譜更適用于大量制備高純度手性化合物。

然而，基于逆流色譜分離手性物質仍存在以下幾個問題：（1）CCC分離柱理論塔板數相對較低；（2）所用溶劑體系會破壞主、客體分子間的相互作用；（3）缺乏合適的手性配體。因此，仍需逆流色譜工作者不斷努力找到合適的解決辦法。但是，可以相信，對于大制備量分離手性化合物，逆流色譜是一個可以信賴的分離技術。

5 總結與展望

經過幾十年的不斷發展和完善，無論是儀器構造，還是新型溶劑體系的篩選，逆流色譜均有顯著進步。如今，CCC憑借其獨具特色的技術特點，已被越來越多的分離工作者作為制備或半制備分離技術，廣泛用于復雜樣品的分離，并成功得到高純度的化合物，如：生物堿、黃酮類、蛋白質等。大量分離實例證明了逆流色譜對復雜樣品具有高效分離的優勢。然而，與其它分離技術相比，逆流色譜還存在著一些問題亟需解決。例如，其較低的理論塔板數，限制了其進一步應用；分離工作者需要花費較長的時間和精力篩選得到合適的溶劑體系。這些問題的存在使得逆流色譜仍有進一步優化的空間。

對此，提出以下幾點展望：（1）由于逆流色譜可以有效避免死吸附，因此可以針對一些高附加值對象（如紫杉醇）進行分離，實現高回收率低消耗的分離過程。（2）逆流色譜是以分配比為基礎的分離技術，通過控制不同對象的分配比實現化合物的精確分段。隨著逆流色譜的不斷發展完善，它將發展成為一種更加成熟的、可產業化的高效分離技術。

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This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.21532005 ）

Recent Development in Counter-current Chromatography

WU Da-Tong，PAN Yuan-Jiang*
（Zhejiang University，Department of Chemistry，Hangzhou 310027，China）

Counter-current chromatography（CCC）is a quick preparative separation technique based on the different partition coefficient in liquid-liquid solvent systems.This paper reviews recent research progress in the region of solvent systems，instruments improvement of CCC.Moreover，some application prospects about enantioseparation of racemic compounds by CCC are also discussed.Finally，the contents and goal of further research in this field is discussed.

Counter-current chromatography；Instruments improvement；Solvent systems；Chiral separation；Review

20 September 2015；accepted 2 December 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150746

2015-09-20收稿；2015-12-02接受

本文系國家自然科學基金資助項目（No.21532005）

*E-mail：panyuanjiang@zju.edu.cn