低溫耗氮技術在低醇白葡萄酒釀造中的應用

呂文，唐敏慧，崔艷

（1.中法合營王朝葡萄釀酒有限公司，天津300402；2.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津300384）

低溫耗氮技術在低醇白葡萄酒釀造中的應用

呂文1，唐敏慧2，崔艷2

（1.中法合營王朝葡萄釀酒有限公司，天津300402；2.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津300384）

采用低溫耗氮方式進行了低醇葡萄酒的發酵工藝研究。在發酵過程中摸索了不同的拉低溫時機、低溫溫度及去除部分生物量等對于低醇葡萄酒發酵中的酵母生長代謝、總氮量、α-氨基氮、還原糖、總酸等理化、感官指標以及穩定性的影響，進而評價低溫耗氮技術釀造較高穩定性的低醇葡萄酒的可能性。結果表明，發酵前期拉低溫處理和去除部分生物量能夠明顯增加酵母菌的耗氮，改變其生長代謝狀況。在發酵36 h時拉低溫至0℃處理，之后低溫離心并回填1/5酵母生物量至醪液繼續正常發酵的低醇葡萄酒，酒精度更易控制在低醇范圍，微生物穩定性更好，且葡萄酒具有更好的品種特性。

低溫；低醇；生物量移除；耗氮；葡萄酒

低醇葡萄酒因其酒精度低，契合當前人們的健康生活理念，所以越來越受到市場的親睞，也引起了更多研究人員和相關企業的關注。但是低醇葡萄酒由于殘糖高、發酵終止困難，往往導致最終的低醇葡萄酒穩定性較低，且過短的發酵時間使得葡萄的香氣風味成分以及有益的酵母次級代謝產物不能充分在酒體中積累，從而使得酒體單薄，口感寡淡，缺乏層次。盡管目前國外已經有采用脫糖、脫醇、有機溶劑萃取、超臨界二氧化氮萃取等多種方式生產低醇葡萄酒，但這些技術對葡萄酒的酒體香氣或風味均有一定程度的損害，另外其高昂的附加成本仍然是國內消費者所不能接受的。

在葡萄酒發酵過程中，釀酒酵母通常是在發酵生長期的前24～48 h更多地利用氮源，而在氮源接近耗盡時，它會促使酵母生長進入穩定期［1］，而糖類的代謝則多是在氮源相對缺乏時更加明顯［2］。因此可以說氮源的利用不僅會影響酵母的生長狀況，發酵速率，還會影響發酵持續的時間和糖代謝的速率［3］，甚至由于酵母可利用氮（YAN）中的α-氨基酸是某些香氣成分的前體物質，它還會影響葡萄酒中酯類物質、高級醇和脂肪酸等物質的生成［4］。當葡萄醪液中氮源降低到一定程度時，酵母菌發酵活力降低，其生長速率也會隨之降低［5-7］。所以利用好發酵葡萄漿中的氮源是決定低醇葡萄酒品質好壞的關鍵因素之一。目前國內關于葡萄酒酵母對氮源利用方面的研究較少，國外則在葡萄汁氮源及發酵助劑的添加對發酵酒精動力學及葡萄酒香氣的產生及其基因表達方面做了較多的研究［8-10］。

本研究利用了酵母菌在發酵前期大量消耗氮源這一特點，在發酵前期的24～48 h中，取出部分發酵醪液將其置于低溫下處理，因為酵母在低溫下會發生聚集沉淀，酵母細胞變大，細胞核消失，芽細胞處的隔壁消失，其活性因此而受到明顯的抑制。同時去除部分生物量，然后將剩余生物量回填至發酵醪液中繼續發酵，使其再度重復生長初期的耗氮階段，通過氮源的消耗以及生物量的減少，控制酵母的生長代謝狀況，一方面適當延長低醇葡萄酒的發酵時間，利于代謝的香氣、風味及營養物質的積累，另一方面使得終止發酵變得容易，利于保持較恒定的低酒精度和穩定的酒體。本研究的成果可對了解這一技術在低醇葡萄酒方面的應用提供一定的參考數據。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及設備

玫瑰香葡萄：采自天津漢沽葡萄基地。

菌種及耗材：釀酒酵母QA23（法國Laffort公司），果膠酶（LATAZYMCL公司），偏重亞硫酸鉀、硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅、茚三酮、果糖、碘酸鉀、甘氨酸（天津市天大化工實驗廠）。

儀器設備：HHBII600恒溫培養箱，天津天寧技術實業有限公司；UDK140凱氏定氮儀，意大利VELP公司。

1.2實驗方法

1.2.1操作

將新鮮無腐敗無爛果的玫瑰香葡萄，去皮破碎打漿，同時添加二氧化硫，然后加果膠酶0.2 g/L，在12℃下隔夜靜置8 h后過濾。將在40℃水浴中活化好的釀酒酵母（QA23）接種（2.15×106個/mL）至果汁中，置于恒溫培養箱開始發酵，溫度設定為19℃。當發酵進行到24 h、36 h、48 h時，分別取出部分發酵醪液放置在0℃和4℃的溫度下進行低溫處理，時間均為24 h。然后將上述醪液進行低溫離心（4℃，4000 r/min，20 min），收集沉淀后以酵母活菌計數分別取1/5、1/3、1/2的酵母生物量回填到上清液中，同時以0℃和4℃下未離心的組（即不回填組）作為該溫度下的對照組，將回填后的發酵葡萄醪及各自溫度下的對照組一起放回19℃培養箱中繼續發酵。當酒精度達到目標值7%vol時，添加60 mg/L的SO2終止發酵，置于0℃下保存7 d后，用一定量的皂土進行澄清處理7 d，澄清過濾獲得低醇玫瑰香葡萄原酒，置于4℃下保存待測。整個發酵過程中每隔12 h測定酵母數、殘糖、總氮量以及α-氨基氮含量，最后檢測成品酒的酒精度、殘糖、總酸及冷、熱穩定性。以19℃下正常發酵的低醇葡萄酒作為對照組。試驗中的每個組均設3個平行樣。

1.2.2檢測方法

理化指標：α-氨基氮采用茚三酮法，總氮量測定采用凱氏定氮法（GB 5009.5—2010）［11］，酒精度測定采用密度瓶法，還原糖測定采用斐林法，總酸測定采用指示劑法（GB/T 15038—2006）［12］。

菌落計數：采用平板菌落計數及血球計數板。

穩定性檢測：冷穩定性，-4℃下維持3 d觀察；熱穩定性，85℃下15 min保溫觀察。

感官指標：選10位評審專家對所釀低醇葡萄酒進行外觀、香氣、滋味和典型性評價（GB/T 15038—2006）。

2　結果與分析

2.1低溫耗氮對發酵過程中酵母菌細胞生長代謝的影響（圖1、圖2、圖3）

圖1　24h時拉低溫處理對酵母菌生長代謝的影響

圖2　36h時拉低溫處理對酵母菌生長代謝的影響

圖3　48h時拉低溫處理對酵母菌生長代謝的影響

由圖1、圖2、圖3可以看出，在發酵過程中低溫處理、去除酵母量以及拉低溫處理時機均不同程度地改變了酵母菌的生長軌跡，延長了發酵時間，而對照組僅72 h的酒精度就達到了目標值7%vol。僅從低溫處理來看，0℃的效果要好于4℃，除去低溫放置時間24 h外，它對延長發酵期的影響并不太大，只是通過降溫處理鈍化了酵母，對酵母數的影響并不明顯。僅從去除酵母生物量可以看出，回填量越大，繼續發酵后酵母起酵越快，回填量1/2的酵母數的增長要明顯高于1/3和1/5的。但當去除生物量再低溫處理以后，可以明顯看出，拉低溫后回填部分生物量的組酵母菌的發酵期延長，均在120 h以后達到較為理想的酒精度時而終止發酵，說明低溫處理有助于確定回填生物量的準確性，因為低溫處理一定時間后，絕大部分酵母鈍化而通過離心進入沉淀，通過酵母菌落計數也發現，此時離心后上清液的酵母數相比未低溫處理的要少很多。而拉低溫處理的時機也決定了當回填酵母菌再次起酵后的生長特征，在24 h拉低溫的圖中，可以看出當發酵進行到60 h時，回填后的酵母再次起酵，當發酵到理想酒精度時，酵母的生長曲線已經開始進入穩定期，其酵母生長速率逐漸平穩。36 h拉低溫組同樣在發酵到72 h時再次起酵，由于拉低溫時機較晚，故其酵母量要高于24 h組，因此回填量也高于24 h，起酵也較24 h更快，因此發酵到132 h時，基本上達到目標酒精度，且此時酵母菌生長也接近平穩，生長速率已開始下降。而48 h拉低溫組再次起酵時酵母量過高，且酵母生長已經進入穩定期，即酒精度已經有一定積累，因此更接近終點，當發酵終止時，重新起酵后的酵母菌生長依然旺盛，處于對數上升期，會造成發酵終止的困難。

2.2低溫耗氮對α-氨基氮的影響

α-氨基氮是酵母可利用氮的主要來源［13］，研究過程中，發現總氮量和α-氨基氮隨著發酵時間的變化，其變化趨勢大體相同（圖4、圖5、圖6）。從圖中的對照組線可以看出，發酵中12～36 h之間α-氨基氮降低最快，從222.8 mg/L降到了130.2 mg/L，降低了92.6 mg/L，可能是因為酵母在這個時間段對氮源的需求量最大，這和Tesniere C等［14］的研究基本一致，此時氮源主要被酵母菌用來構建自身所需的蛋白質。實驗也發現，在低醇葡萄酒的發酵過程中，碳源消耗最快的階段是在60～72 h之間，說明氮源的利用優先于碳源。在拉低溫處理或回填處理后，曲線比對照組曲線更陡，說明拉低溫或者回填處理能再次增大酵母菌對氮源的消耗，應該是部分回填及低溫處理使得酵母菌再次處于發酵初期的起酵階段，重新開始進入生長期，重復利用更多的氮源用于自身的生長繁殖，從而使得氮源的消耗速度要快于對照組。

圖4　24h進行拉低溫溫度及回填量對于原酒中α-氨基氮的影響

圖5　36h進行拉低溫溫度及回填量對于原酒中α-氨基氮的影響

圖6　48h進行拉低溫溫度及回填量對于原酒中α-氨基氮的影響

從拉低溫時機看，48 h拉低溫后的曲線較平緩，24 h和36 h的曲線則較陡，原因可能是24 h、36 h組比48 h組的葡萄醪液中氮含量多，酵母菌再次起酵后重復快速耗氮。但同時發現，36 h和48 h拉低溫組再次耗氮的量要大于19℃組，而24 h的則直到發酵結束時，總的耗氮量和19℃組的基本接近?？赡苁且驗榈幢焕米疃嗟氖窃谄鸾秃蟮?4～48 h。明顯看出，36 h拉低溫后，無論是耗氮的速度還是耗氮總量上均優于其他2個時機。從低溫處理來看，0℃和4℃對α-氨基氮影響的區別并不大，但均大于19℃組，說明拉低溫處理是有效的。而回填量的不同在回填后的48 h內均顯示出1/5回填量耗氮多于其他的量，可能是因為酵母量少時它需要更多的可利用氮來生長繁殖，發酵到后期，隨著酵母數的不斷增多，這3個回填量的耗氮量差別不再明顯。

2.3低溫耗氮對低醇葡萄酒其他指標的影響（表1）

表1　酒樣的理化指標穩定性結果

按照低醇葡萄酒的要求，本研究目標酒精度低于7%vol，對照組終止發酵時酒精度為6.89%vol，但是在保存2周后發現仍有氣泡產生，熱穩定性檢測出現了絮狀物，冷穩定性有少量的白色沉淀，且酒精度上升到7.51%vol。拉低溫處理組和回填生物量組的酒精度和總酸均比對照組低，說明耗氮培養對酵母菌的糖代謝有一定的影響。且0℃較4℃的酒精度低，19℃最高，說明0℃對酵母菌的抑制作用更強；但低溫組中不回填組均出現了穩定性不合格的問題，說明僅降低溫度能在一定程度上鈍化酵母，抑制其活性，延遲酵母的生長期，但隨著繼續回到培養箱發酵后很快酵母就會恢復?；靥?/ 5酵母量的酒精度要低于其他的回填量，而且酒體更穩定，說明酵母菌數對酒精度的影響很大，以36 h為例，回填1/5的酵母數約為2.43×106個/mL，酵母菌利用氮源和碳源合成自身所需物質的需求要大于酒精代謝，從而當發酵快結束，氮源消耗低至一定量的時候，由于酵母菌的生長速率下降，發酵終止變得相對容易，使得酒精度穩定在低醇范圍之內，而不會因為殘糖高而引發貯藏過程中的微生物不穩定問題，這和郭凡移除生物量釀造低醇蘋果酒的研究結果相近［15］。而不回填組除酒精度較高外，也在貯藏期間發生產氣和渾濁現象。從拉低溫時機來看，24 h組的酒精度總體最低，因為此時酵母數量較少，同樣的回填量也是最少的，因此酒精度相對較低，其次是36 h，最高的是48 h，但是因為36 h拉低溫的耗氮量最大，所以其最終酒精度和24 h組的差別較小?？偹岢龑φ战M略高以外，其他組的差別并不大。

通過10位專家小組成員的感官評價，24 h、36 h拉低溫至0℃處理，且酵母生物量回填為1/5的組，各批次低醇葡萄酒的最終酒精度較低而且保持穩定，且后續的貯藏期間無氣泡、無渾濁產生。酒體呈淡黃綠色，澄清透明，酸甜適宜，舒順易飲，層次結構感較強，并無因酒精度低而帶來的寡淡單薄的口感，且清爽的果香味明顯，有較為典型的葡萄品種香氣。

3　結論

通過以上研究表明，采用發酵過程中拉低溫處理結合部分去除酵母生物量的低溫耗氮技術確實可以用來進行低醇葡萄酒的釀造。綜合研究數據、穩定性及感官評價認為最佳低溫耗氮條件為：在葡萄醪液正常發酵（19℃）至36 h時，取出醪液置于0℃下進行低溫處理（24 h），然后低溫離心，將離心沉淀中酵母生物量的1/5回填至離心上清液中置于19℃下繼續發酵直至達到理想酒精度。結果顯示回填酵母菌重復生長初期的耗氮可以達到降低酒精度的目的。且利用該技術釀造的低醇葡萄酒酒精度較低，酒體澄清透明、穩定性好，具有葡萄品種的典型性，且層次豐富，酸甜適宜，舒順易飲。該工藝是在工業生產需求的基礎上做的研究，充分考慮了進一步擴大的可能性及操作的可行性，具有一定的推廣和參考價值。

［1］Brice C，Sanchez I，Tesniere C，et al.Assessing the mechanisms responsible for differences in nitrogen requirements between Saccharomyces cerevisiae wine yeasts in alcoholic fermentation［J］.Applied and Environmental Microbiology，2014，80：1330-1339.

［2］Novo M T，Betltran G，Rozes N，et al.Effect of nitrogen limitation and surplus upon trehalose metabolism in wine yeast［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2005，66：560-566.

［3］Barbosa C，Falco V，Mendes-faiaA，et al.Nitrogen addition influences formation of aroma compounds，volatile acidity and ethanol in nitrogen deficient media fermented by Saccharomyces cerevisiae wine strains［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2009，108（2）：99-104.

［4］Hernandez-orte P，Bely M，Cacho J，et al.Impact of ammonium additions on volatile acidity，ethanol，and aromatic compound production by different Saccharomyces cerevisiae strains during fermentation in controlled synthetic media［J］. Australian Journal of Grape and Wine Research，2006，12：150-160.

［5］Ugliano M，Siebert T，Mercurio M，et al.Volatile and color composition of young and model-aged Shiraz wines as affected by diammonium phosphate supplementation before alcoholic fermentation［J］.Journal ofAgricultural and Food Chemistry，2008，56：9175-9182.

［6］Varela C，Pizarro F，Agosin E.Biomass content governs fermentation rate in nitrogen deficient wine musts［J］.Applied and Environmental Microbiology，2004，6：3392-3400.

［7］Orlic S，Arroyo-lopez F N，Huic-babic K，et al.Acomparative study of the wine fermentation performance of Saccharomyces paradoxus under different nitrogen concentrations and glucose/ fructose ratios［J］.Journal ofApplied Microbiology，2010，108：73-80.

［8］周光榮，楊雪峰，段雪榮，等.葡萄酒發酵過程中氮源的控制與管理［J］.應用科技，2014（24）：287-288.

［9］Garde-cerdan T，Martinez-gilAM，Lorenzo C，et al. Implications of nitrogen compounds during alcoholic fermentation from some grape varieties at different maturation stages and cultivation systems［J］.Food Chemistry，2011，124：106-116.

［10］Callejon R M，TroncosoAM，Morales M L.Determination of amino acids in grape-derived products:Areview［J］.Talanta，2010，81：1143-1152.

［11］食品安全國家標準食品中蛋白質的測定：GB 5009.5—2010［S］.北京：中國標準出版社，2010.

［12］中國輕工業聯合會.葡萄酒、果酒通用分析方法：GB/T 15038—2006［S］.北京：中國標準出版社，2008.

［13］Maisonnave P，Sanchez I，Moine V，et al.Stuck fermentation: development of asynthetic stuck wine and study of a restart procedure［J］.International Journal of Food Microbiology，2013，163：239-247.

［14］Tesniere C，Brice C，Blondin B.Responses of Saccharomyces cerevisiae to nitrogen starvation in wine alcoholic fermentation［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2015，99：7025-7034.

［15］郭凡，唐圣云，王戎，等.生物量移除技術發酵低醇蘋果酒［J］.中國釀造，2012，31（9）：186-189.

Application of Low Temperature and Nitrogen Consumption Technology in Brewing of Low-Alcohol Wine

LV Wen1，TANG Minhui2and CUI Yan2
（1.Sino-French Joint-venture Dynasty Winery Co.Ltd.，Tianjin 300402；2.School of Food Science and Bioengineering，TianjinAgricultural University，Tianjin 300384，China）

In this paper，we studied the brewing of low-alcohol white wine by low temperature treatment combined with nitrogen consumption technology.The temperature，the timing of lowering the temperature，and biomass reduction amount were explored to study their influence on the yeast metabolism，total nitrogen，α-amino nitrogen，reducing sugar，total acids，sensory indexes，wine stability，etc.，and to evaluate the possibility of brewing stable low-alcohol wine by low temperature treatment combined with nitrogen consumption technology.The results showed that，low temperature treatment combined with biomass reduction during the early stage of fermentation could significantly increase the nitrogen consumption of yeasts，and change their metabolism conditions.The optimal technique conditions were as follows:lowering temperature to 0℃after 36 h fermentation，then backfilling 1/5 of the biomass into the fermentation liquid after cryogenic centrifugation.Under above conditions，the alcohol content was easier to control，the wine body was stable，and the wine had a typical varietal taste.（Trans.by HUANG Xiaoli）

low temperature；low alcohol；biomass reduction；nitrogen consumption；grape wine

TS262.6；TS261.4

A

1001-9286（2016）10-0056-05

10.13746/j.njkj.2016215

天津市農業科技成果轉化與推廣項目（201502130）。

2016-06-30

呂文（1973-），男，高級工程師，碩士，研究方向：葡萄酒工藝技術。

崔艷，女，副教授，碩士，研究方向：葡萄酒釀造與分析。