高效液相色譜檢測運動飲料中的人工合成色素

周峰

（海南熱帶海洋學院體育與健康學院，海南三亞572000）

高效液相色譜檢測運動飲料中的人工合成色素

周峰

（海南熱帶海洋學院體育與健康學院，海南三亞572000）

建立一種同時測定運動飲料中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍等6種人工合成色素的固相萃取-高效液相色譜（SPE-HPLC）方法。樣品前處理采用固相萃取小柱進行富集和凈化，淋洗液選擇甲酸-水溶液，洗脫液選擇氨化甲醇，氮氣吹干后用水復溶上機檢測。采用Waters RP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離，以甲醇-乙酸銨水溶液（20.0 mmol/L）作為流動相，用PDA檢測器檢測，外標法峰面積定量。結果表明，6種人工合成色素在2.00 μg/mL～32.00 μg/mL濃度范圍內線性良好，相關系數r2為0.99，檢出限在0.04 μg/mL～0.15 μg/mL，定量限為0.12 μg/mL～0.50 μg/mL，加標回收率達到85.6%～92.4%。該方法具有前處理簡單、凈化效果好、靈敏度高和檢測速度快的優點，適用于運動飲料中人工合成色素的分離和定量檢測。

高效液相色譜；運動飲料；人工合成色素

人工合成色素屬于化工染色劑，大多以苯、甲苯、萘等化工產品為原料，經過磺化、硝化、偶氮化等一系列有機反應化合而成。由于人工合成色素，生產成本低，給人的感觀度好，易溶于水，可直接進行添加等特點，一定程度上彌補了天然色素的一些不足，因此在食品生產加工中被大量應用。但是，大量合成色素的攝入可能引起過敏、哮喘、喉頭水腫、鼻炎、蕁麻疫、皮膚瘙癢以及神經性頭痛等癥狀，特別是兒童的成長期間，若長期過量攝入合成色素，對生長發育會造成極為不利的影響［1-4］。因此，世界各國對合成色素的使用種類，使用范圍和使用量都做了嚴格限制。在我國標準中，針對運動飲料GB15266-2009《運動飲料衛生標準》規定了允許使用的色素品種、使用范圍及最大使用量［5］。

運動飲料是根據人體運動的生理消耗而配置的，針對特殊人群的飲料。運動飲料中主要含有電解質，維生素，氨基酸等成分，能補充人體所需的營養成分，抗疲勞，平衡新陳代謝［6］。但是近些年來運動飲料市場魚龍混雜，不法商家為了追求飲料的色澤亮麗，超量或者違規添加人工合成色素。由于現行國標中人工合成色素的檢驗方法GB/T 5009.35-2003《食品中合成著色劑的測定》［7］中的處理方法操作繁瑣，加標回收率低等因素，本實驗對標準中前處理方法進行了一些相應改變，并進行了加標回收驗證。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

高效液相色譜系統：Waters 2695，配PDA檢測器：Waters 2998。

檸檬黃（99%）、莧菜紅（98%）、胭脂紅（92%）、日落黃（97%）、誘惑紅（99%）、亮藍（92%）標準品：均購于國家標準物質中心。

HLB固相萃取小柱：Waters公司，規格3cc。

1.2樣品來源

樣品均為隨機抽取市場上銷售的運動型飲料。

1.3色譜條件

色譜柱：Waters RP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

柱溫：30℃；流動相：乙酸銨（20 mmol/L）水溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脫程序為0 min～5.0 min，20% B～35%B；3.0 min～5.0 min，35%B；5.0 min～10.0 min，35%B～98%B；10.0 min～15.0 min，98%B；15.0 min～16.0 min，90%B～15%B。

1.4方法

1.4.1甲醇-乙酸銨水溶液體系中乙酸銨對6種人工合成色素色譜行為的影響

固定流動相梯度洗脫程序，配制不同濃度的乙酸銨水溶液5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mmol/L，考察乙酸銨對6種合成人工合成色素色譜行為的影響。

1.4.2檢測波長的選擇

本試驗采用PDA檢測器進行全波長掃描（掃描范圍200 nm～600 nm），根據6種人工合成色素的全波長掃描圖，選擇比較合適的檢測波長。

1.4.3標準曲線的制作

稱取相應質量的檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍標準品，配制成濃度為2.00、4.00、8.00、16.00、32.00 μg/mL的標準混合溶液，進行儀器分析，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.4.4樣品前處理條件的優化

運動飲料中除了固有的一些食品基質外，還含有很多的人為添加的營養元素，成分復雜，對前處理要求高，所以本實驗樣品前處理使用HLB固相萃取小柱，對人工合成色素起到一個凈化和富集的作用。并對HLB固相萃取小柱操作條件進行優化，以樣品加標平均回收率為比較依據，制定較優的前處理條件。

1.4.5加標回收試驗

以市售未檢出人工合成色素的運動飲料為空白基質，加入混合標準液，選擇優化后的前處理條件操作，氮吹近干后再用水定容，上機檢測，計算回收率。

2　結果與討論

2.1甲醇-乙酸銨水溶液體系中乙酸銨對6種人工合成色素色譜行為的影響

為了了解乙酸銨對6種人工合成色素色譜行為的影響，本研究固定流動相梯度洗脫程序，配制不同濃度的乙酸銨水溶液，乙酸銨濃度分別為5.0、10.0、20.0、30.0、40.0 mmol/L，考察了乙酸銨對六種合成人工合成色素色譜行為的影響。如圖1所示。

結果表明：在甲醇-乙酸銨水溶液體系中，乙酸銨濃度對6種合成人工合成色素的色譜保留行為有不同程度的影響，其濃度與6種合成人工合成色素保留因子的相互關系符合lnk=a+cCB方程［8-10］，且具有良好的線性（r2＞0.99）。當乙酸銨濃度在20.0 mmol/L時，6種合成人工合成色素在RP C18柱上可得到良好的基線分離，其峰型良好。

2.2檢測波長的選擇

圖1　6種合成人工合成色素的色譜圖Fig.1The chromatogram of six synthetic colorants

這6種人工合成色素均為水溶性酸性染料，在國標方法中選用254 nm作為這6種人工合成色素的檢測波長。但試驗發現運動型飲料經前處理后樣品的譜圖在254 nm波長處的干擾峰比較多，難以滿足實際檢測需要。所以本試驗采用PDA檢測器進行全波長掃描（掃描范圍210 nm～700 nm），如圖2所示。

圖2　6種合成人工合成色素的全波長掃描圖Fig.2Full wavelength scanning chart of six synthetic colorants

實驗結果表明：以上6種人工合成色素除了在紫外區有著較強特征吸收外，由于各種色素的結構中含有不同的發色及助色基團，在可見光區也有最大吸收波長。6種色素最大吸收波長分別為檸檬黃：257.2、427.1 nm；莧菜紅215.9、520.7 nm；胭脂紅214.7、 509.7 nm；日落黃234.7、484.2 nm；誘惑紅212.3、509.7 nm；亮藍307.2、407.8 nm。綜合考慮，選擇在500 nm的條件下同時檢測檢測6種人工合成色素，此時各組分的響應值高，背景干擾小，符合試驗的要求。如圖3。

圖3　運動飲料中莧菜紅、胭脂紅分別在254 nm波長、500 nm波長下的色譜圖Fig.3The chromatograms of amaranth，carmine in sports drink at 254 nm wavelength and 500 nm wavelength

是一款運動型飲料中兩種人工合成色素分別在254 nm和500 nm的檢測條件下的色譜圖對比，可以發現在500 nm的檢測條件下，樣品的色譜圖中雜峰干擾明顯小于254 nm檢測條件下的譜圖。

2.3標準曲線的制作

為了驗證6種合成人工合成色素在甲醇-乙酸銨（20 mmol/L）水溶液流動相體系中的線性關系，配制了濃度為2.00、4.00、8.00、16.00、32.00 μg/mL的系列混合標準溶液。結果見表1。

試驗結果表明，6種合成人工合成色素在2.00μg/mL～32.00 μg/mL內均具有良好的線性關系（r2＞0.99）；采用在空白基質中添加目標組分的方法，依據色譜峰的性噪比（S/N）大于3倍確定檢出限（LOD），S/N大于10倍確定定量限（LOQ），得到6種目標組分的LOD和LOQ分別為0.04 μg/mL～0.15 μg/mL和0.12 μg/mL～0.50 μg/mL。

表1　6種合成人工合成色素的保留時間、標準曲線、相關系數、檢出限與定量限Table 1Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of six synthetic colorants

2.4淋洗液、洗脫液的選擇

參考相關文獻［11-12］后，針對于運動飲料的固相萃取流程，樣品選擇過濾后上樣，然后淋洗，最后洗脫。淋洗液是在樣品進入吸附劑、目標化合物被吸附后，用較弱的溶劑將弱保留干擾化合物洗掉，一般有用酸化甲醇-水溶液、甲酸-水溶液、檸檬酸-水溶液、水這四種淋洗方式，分別對這4種的淋洗效果進行比較；洗脫液一般是用較強的溶劑將目標化合物洗脫下來，常用的有氨化甲醇、甲醇、酸化甲醇3種洗脫溶劑。

試驗結果以6種人工合成色素的平均回收率為比較依據，如圖4所示：甲酸-水溶液作為淋洗液效果最好；氨化甲醇的洗脫效果要優于甲醇和酸化甲醇。

圖4　淋洗液、洗脫液的選擇對6種人工合成色素平均回收率的影響Fig.4The effect of leaching solution and elution solution on the average recovery rate of six synthetic colorants

2.5樣品的測定及加標回收

在我們隨機抽取的30個批次的運動飲料樣品中，根據上述試驗結果選擇優化后儀器條件，上樣后選擇甲酸-水溶液淋洗HLB小柱，氨化甲醇洗脫后氮吹，最后用水復容上機檢測。結果表明：在所檢測的運動飲料樣品中，6種合成人工合成色素檢出7批次，但均未超過國家限量值。加標回收試驗中，在加標濃度為16.00 μg/mL的飲料樣品中，6種色素的加標回收率在85.6%～92.4%之間，符合檢測要求。

3　結論

建立了一種固相萃取-反相高效液相色譜法梯度洗脫同時檢測運動飲料中6種人工合成色素的分析方法。結果表明，在甲醇-乙酸銨體系中，乙酸銨對于溶質的色譜保留行為具有較強的調節能力；在甲醇與乙酸銨的協同作用下，甲醇-乙酸銨（20 mmol/L）水溶液流動相體系中，6種人工人工合成色素得到了良好的基線分離。在500 nm的檢測波長下，優化后的HLB固相萃取柱法可有效去除樣品中的復雜基質，實現對6種人工人工合成色素的凈化與富集，準確有效地檢測運動飲料中的人工合成色素。

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［5］中華人民共和國衛生部.GB15266-2009運動飲料衛生標準［S］.北京：中國標準出版社，2009

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［7］中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.35-2003食品中合成著色劑的測定［S］.北京：中國標準出版社，2003

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［11］劉曉穎，魯莉，于維森.食品中人工合成著色劑測定方法的改進［J］.衛生研究，2002（12）：479-480

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Analysis of Synthetic Colorants in Sports Drink by High Performance Liquid Chromatography

ZHOU Feng
（School of Physical Education and Health，Hainan Tropical Ocean University，Sanya 572000，Hainan，China）

A rapid and effective method was established for the determination of six synthetic colorants，including tartrazine，amaranth，carmine，sunset yellow，allura red，and brilliant blue in sports drink by solid－phase extraction coupled with reversed-phase high performance liquid chromatography（SPE-HPLC）.The samples were concentrated and purified by solid phase extraction column，and the leaching solution of formic acid aqueous solution，the eluent of amonium methanol The elution liquid was dried under nitrogen，and detected after re-dissolution with water.The separation of targeted compound was performed on a Waters RP C18chromatographic column（4.6 mm×250 mm，5 μm）using ammonium acetate aqueous solution（20.0 mmol/L）as mobile phase，with PDA detector and external standard method peak area quantification.The linear range of 6 synthetic colorants was inthe range of 2.00 μg/mL-32.00 μg/mL with a correlation coefficient of 0.99.The detection limit was 0.04 μg/mL-0.15 μg/mL and the quantitative limit was 0.12 μg/mL-0.50 μg/mL.The recovery rate was 85.6%-92.4%.The method has the advantages of simple pretreatment，good purifying effect，high sensitivity and fast detection rate，andis suitable for the separationandquantitative detectionofsynthetic colorants insports drink.

high performance liquid chromatography（HPLC）；sports drink；synthetic colorants

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.037

周峰（1970—），男（漢），副教授，碩士，研究方向：運動營養學。

2016-07-04