小五臺山蟹蛛DNA條形碼分子鑒定

何靜超，胡嵐嵐，郭晨輝，張鋒

(河北大學生命科學學院,河北保定　071002)

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小五臺山蟹蛛DNA條形碼分子鑒定

何靜超，胡嵐嵐，郭晨輝，張鋒

(河北大學生命科學學院,河北保定071002)

為了探討DNA條形碼技術在蟹蛛科蜘蛛物種鑒定中的可行性，本研究基于線粒體COI基因序列，使用鄰接法和貝葉斯法構建系統發育樹，ABGD(automatic barcode gap discovery)軟件對樣本進行劃分，對小五臺山25種蟹蛛110個樣本進行DNA條形碼分子鑒定.結果表明：鄰接法和貝葉斯法構建的系統發育樹聚類結果與ABGD軟件劃分結果以及形態分類鑒定結果相一致.據此筆者認為DNA條形碼作為一種有效的分子鑒定工具可以應用到蟹蛛科蜘蛛物種鑒定中.

蟹蛛科；DNA條形碼；系統發育樹；ABGD

科學準確的物種鑒定是深入開展生物多樣性、環境監測、生態學、進化生物學、人口健康和醫學等多學科研究和利用的前提[1].傳統的分類學研究對標本的完整性要求較高，且需要通過長時間的專業訓練才能培養出精通于特定類群的分類學專家.除此之外，由于形態學鑒定存在局限性并且分類學家隊伍也在不斷縮減，使得進化分類學的發展面臨著巨大的挑戰[2].

Hebert等[3-4]于2003年提出利用一段較短的DNA序列作為分子標記可以精準地進行物種鑒定，此技術稱為DNA條形碼技術.同時他們認為動物的DNA條形碼可以用線粒體基因細胞色素C氧化酶I(COI)5′端一段長度為658 bp的DNA序列表示.

到目前為止，DNA條形碼技術已應用到大部分動物物種鑒定中[5-13]，其中包括鳥類、魚類、昆蟲、哺乳類、兩棲類、獸類、浮游和海洋小型底棲動物等.該片段不僅可在物種水平上對絕大多數動物類群進行鑒定，還能夠準確地區分近緣類群,同時也是鑒定新種與發現隱存種的良好工具，并用于快速構建不同分類階元的系統發育關系[14].因此，COI基因已被公認為動物DNA標準條形碼片段并得到廣泛應用.但是由于DNA條形碼的COI基因位于線粒體上，而線粒體是母系遺傳，因此在鑒定存在雜交的生物類群時存在缺陷[15]，對于存在不完全支序演化與基因滲入現象的生物類群，DNA條形碼難以區分[16].例如：蠅屬中大約有60%的物種無法用COI基因進行鑒別，因為一些種的條形碼是一樣的；在對珊瑚蟲的研究中發現COI基因在不同的物種間變化極小，因此也不能成功地鑒別該物種[1].Sperling利用COI基因分析昆蟲，結果顯示：至少有1/4的昆蟲物種很難被區分[17].而蜘蛛類此方面的報道甚少，因此，利用COI基因對蜘蛛進行物種鑒定的可行性有待于證明.

蟹蛛科Thomisidae是蜘蛛目中的第7大科[18]，物種多樣性豐富，體型變化較大.傳統的蟹蛛分類鑒定工作主要依據成熟標本的外生殖器官來進行分類，即雄蛛的觸肢器和雌蛛的外雌器.但對于外形相近的隱存種的鑒別、多組形態上相近物種的雌雄配對、同一物種受分布區域及生境變化引起的種內差異以及發育未成熟物種的鑒定等問題，單純依靠進化分類學方法較難解決.有鑒于此，本研究選用分布于小五臺山的10屬25種蟹蛛作為實驗材料，利用線粒體COI基因，進行基于系統發育樹和距離方法的DNA條形碼分析，探索了DNA條形碼技術對蟹蛛科物種鑒定的準確性，以探索建立快速高效的蜘蛛目物種分類的新方法.

1　材料與方法

1.1標本采集及形態鑒定

本研究選用的110頭蜘蛛標本均由本研究室成員于2013年6～9月和2014年6～9月在河北小五臺山(東經114°50′～115°15′，北緯39°40′～40°10′)采得(表1).

標本采集后保存于體積分數為95%的酒精中，由本研究室成員進行了形態學種類鑒定，并保存于河北大學博物館(MHBU).

表1　所用標本信息Tab.1　Thomisidae samples used in this study

續表1 Continue tab.1

1.2DNA的提取、PCR擴增及測序

取樣本一側步足，在液氮中研磨后使用天根生化科技(北京)有限公司的TIANamp血液/組織/細胞基因組DNA提取試劑盒提取總DNA.

對于提取的總DNA使用通用引物LCO 1490 (5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO 2198 (5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)[19]進行擴增.PCR體系為25 μL：MasterMix 12.5 μL，LCO 1490(10 μmol/L)HCO 2198(10 μmol/L)各0.8 μL，ddH2O 8.9 μL， DNA模板2.0 μL.PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，33～35個循環；72 ℃延伸7 min.

用質量分數1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，將條帶清晰的PCR樣品送金維智生物科技有限公司(北京)進行雙向測序.測序結果首先用Chromas軟件判斷峰圖質量，并對每個堿基逐一進行人工校對，然后用seqman軟件對雙向測序結果進行拼接后，以Fasta格式輸出.

1.3系統發育分析

1.3.1系統發育分析

經校對的序列以園蛛科的1條COI序列為外群，用Clustal X[20]進行比對，用MEGA 6.05[21]中的Kimura雙參數模型(Kimura-2-parameter，K2P)[22]計算種內和種間遺傳距離，采用鄰接法構建系統發育樹，自展檢驗值(Bootstrap)設置為1 000，得到NJ樹上各分支節點的支持率.使用 MrBayes v3.2.1[23]，以園蛛科的1條相應序列為外群，構建各單倍型的 Bayesian 系統發育樹，替代模型為GTR+I.貝葉斯分析包含5×104generations 的運算，以運算得到的后驗概率來標示系統發育樹各分支的置信度.

1.3.2BACODING GAP 分析

基于K2P模型使用MEGA6.05計算種內及種間遺傳距離并在EXCEL中進行距離統計，根據統計結果畫出頻率分布直方圖，進行“barcoding gap”[24]分析.

1.3.3ABGD劃分

基于遺傳距離使用ABGD(automatic barcode gap discovery)軟件[25]對樣本進行劃分，劃分在同一組的樣本被認為是同一種.將111個樣本的基因序列的fasta文件在線提交到ABGD網站(http://wwwabi.snv.jussieu.fr/public/abgd/)，其中種內差異先驗值P(prior intraspecific divergence)設置為0.001到0.1， 最小相對gap 寬度值X(minimum relative gap width)設置為1.0，將樣本劃分結果與形態鑒定結果逐一進行比較.

2　結果及分析

2.1系統發育樹的聚類分析

以樣本的總DNA為模板，將經PCR擴增、公司測序得到的110條長度為658 bp的COI序列提交到中國生命條形碼數據門戶中心(http://www.barcodeoflife.cn/).

根據形態學鑒定，110頭蟹蛛標本最終被鑒定為10屬25種.分別采用鄰接法和貝葉斯法，以1種園蛛的COI序列為外群構建NJ系統發育樹和BI系統發育樹，聚類結果如圖1所示，圓花葉蛛Synemaglobosum和其他種的蜘蛛形成姐妹群，每個種聚類明顯，沒有出現物種交叉現象，并且均各自聚成一個單系群，且各單系分支的支持率均超過60%.

A.NJ 系統發育樹； B.BI 系統發育樹； n.序列條數 group、ABGD自動分組結果.圖1　基于COI序列構建的小五臺山蟹蛛的系統發育樹Fig.1　Phylogenetic tree of the spiders of thomisidae based on COI gene

2.2DNA條形碼的GAP分析

使用MEGA6.05基于K2P模型進行“barcoding gap”分析，做頻率直方圖(圖2)，種內遺傳距離為0～0.5%，平均為0.15%；種間遺傳距離為5.25%～23.06%，平均為13.97%；存在明顯的GAP區，即種內的最大值小于種間的最小值，說明所用蟹蛛科數據能夠很好地區分種內和種間.

圖2　蟹蛛科COI序列遺傳距離分析Fig.2　Analysis of genetic distance of COI gene from Thomisidae taxa

2.3基于距離的分類分析

用ABGD軟件對111個樣本(包含外群)進行劃分，結果包括初始劃分和遞歸劃分2種情況(圖3)：初始劃分較穩定，111個樣本被分成26種；遞歸劃分把111個樣本分成1～36組，但是在很大的P值范圍內都維持在26組.將初始劃分結果與進化分類學鑒定結果進行比較，發現初始劃分中每個分組的種與形態種均呈現一一對應的關系，基于樣本遺傳距離的ABGD方法鑒定25種蟹蛛的成功率為100%.

圖3　ABGD劃分結果Fig.3　Automatic partition results of ABGD

3　討論

本研究利用通用引物對河北小五臺山的110頭蟹蛛進行了COI基因序列的擴增，利用鄰接法和貝葉斯法分別構建了系統發育樹，結果顯示所有的種均各自聚成了一個單系群.對種內和種間遺傳距離分析可得，種間平均遺傳距離(13.97%)是種內平均遺傳距離(0.15%)的93.1倍，符合種間差異是種內差異的10倍[3]的DNA條形碼有效性的檢測標準.因此，COI序列在蜘蛛目蟹蛛科的鑒定中具有較高的準確性，可以作為鑒定小五臺山蟹蛛的DNA條形碼.

在某些類群中由于線粒體基因置換速率不同，出現了種內和種間遺傳距離出現重疊現象，導致難以界定種內和種間差異的閾值標準[2].ABGD方法能成功解決上述難題，因為ABGD是基于一定范圍的先驗值P自動的探測給定數據集的“barcoding gap”,在一定程度上能降低閾值定義的人為因素，減少了基于距離分類的主觀性，并且擁有很高的準確性.在本研究中顯示出ABGD的分組結果與形態分種結果完全一致.由于DNA條形碼技術能夠快速準確地鑒別物種，并能發現新種與隱存種而被廣泛應用.目前這種技術也廣泛地應用到蛛形綱動物中，如Zhang等[26]于2014年利用COI和其他基因片段來研究洞穴蜘蛛隱存種的多樣性；Huber等[27]于2009年利用形態與分子結合的方法對幽靈蛛科的Tainonia屬進行了修訂.Franzini 等[28]利用COI和H3基因片段構建系統發育樹并且與形態學相結合的方法發現了園蛛科的新種.Zhang等[29]利用COI及其他基因片段研究了跳蛛科斑蛛亞科的分子系統學、分歧時間和生物地理分布，結果顯示采用的263頭標本通過貝葉斯法、最大似然法和簡約法構建的系統發育樹中支持斑蛛亞科為單系的有85屬，進而對斑蛛亞科進行了屬級修訂.

不可否認，DNA數據具有很強的可靠性，但如果只依靠DNA數據而忽略其他因素，得到的僅僅是序列相似性模式，而不是進化模式.因此，用DNA條形碼技術進行分析時不能脫離形態學手段.除此以外，由于單分子標記的局限性，應該將其他基因片段與COI一起作為DNA條形碼的標記基因，以適應物種鑒定的需要[30].

雖然條形碼技術受到一些專家的質疑，但DNA信息的豐富性和獨一無二的可重復性，以及在動物、植物和微生物中已經取得的豐富的研究成果，明顯推動了生物分類學的發展.事實上，DNA 條形碼與進化分類學相輔相成，彼此促進，共同推動生物分類和系統學研究[31].

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(責任編輯：趙藏賞)

Molecular identification of crab spiders from Xiaowutai Mountains,China with DNA barcoding

HE Jingchao,HU Lanlan,GUO Chenhui,ZHANG Feng

(College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China)

In order to explore the feasibility of DNA barcoding in the species identification of crab spiders,the COI gene of 110 thomisid samples belonged to 25 species in Xiaowutai Mountains,China,was applied; the phylogenetic trees were reconstructed by neighbor-joining (NJ) and Bayesian Inference (BI) methods,and with ABGD(automatic barcode gap discovery) software to divide the samples.The results showed that the samples belonging to the same species clustered in one monophyly and all species were successfully distinguished by the phylogenetic trees,and the groups automatically defined by ABGD perfectly matched the groups defined by morphological characters,and accorded with phylogenetic trees.We believe DNA barcoding can be used as an effective tool in the molecular identification of crab spiders.

Thomisidae; DNA barcoding; phylogenetic trees; ABGD

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.03.011

2015-09-12

科技部科技基礎性工作專項基金資助項目(2012FY110803);河北省自然科學基金資助項目(C2014201041)

何靜超(1989-)，女，河北保定人，河北大學在讀碩士研究生.E-mail:hejingchao2014@163.com

張鋒(1971-)，男，河北蔚縣人，河北大學教授，博士生導師，主要從事蛛形動物學研究.

E-mail:zhangfeng@hbu.cn

Q959.2262

A

1000-1565(2016)03-0286-07