IL-17A協同GM-CSF和LPS促進骨髓細胞衍生樹突狀細胞的分化和成熟研究①

劉騰麗　喬　賽　鄭佞波　唐　瑩　趙慧麗　王　悅　梁聚友　孫麗妲　白　虹

(天津醫科大學基礎醫學院免疫學系，天津市細胞和分子免疫學重點實驗室，國家教育部免疫微環境與疾病重點實驗室,天津300070)

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·生物治療·

IL-17A協同GM-CSF和LPS促進骨髓細胞衍生樹突狀細胞的分化和成熟研究①

劉騰麗喬賽鄭佞波唐瑩趙慧麗王悅梁聚友孫麗妲白虹

(天津醫科大學基礎醫學院免疫學系，天津市細胞和分子免疫學重點實驗室，國家教育部免疫微環境與疾病重點實驗室,天津300070)

目的：探討IL-17A對小鼠骨髓細胞衍生樹突狀細胞分化和成熟的影響。方法：分離小鼠骨髓細胞，加入含GM-CSF(20 ng/ml)RPMI1640完全培基培養8 d，誘導小鼠骨髓單個核細胞向DC分化，加入LPS(1 μg/ml)繼續培養36 h,進一步誘導DC成熟，同時在骨髓細胞衍生誘導DC分化及成熟的不同階段加入不同濃度的rmIL-17A(10、100 ng/ml),采用流式細胞術檢測DC表面共刺激分子的表達，ELISA方法檢測DC培養上清中IL-12p40和IL-10水平。結果：rmIL-17A可促進GM-CSF誘導骨髓細胞衍生DC表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表達，且具有劑量依賴性，其中以高濃度rmIL-17A刺激組的CD40及 MHCⅡ表達增加最顯著；在LPS誘導DC成熟階段加入rmIL-17A，骨髓細胞衍生DC共刺激分子CD40、CD80、CD86 和MHCⅡ 的表達均明顯增加，并且隨著rmIL-17A濃度的增加，CD86 和MHCⅡ的表達水平也隨之增高；同時與未加rmIL-17A的對照組相比，低濃度rmIL-17A組LPS刺激骨髓細胞衍生DC 分泌IL-12p40 和IL-10水平均顯著增加(P<0.001)，高濃度rmIL-17A組IL-12p40水平顯著增高(P<0.001)，但IL-10水平沒有變化。結論：IL-17A可促進GM-CSF誘導的骨髓細胞衍生DC前體細胞表型發展，并能協同LPS誘導骨髓衍生DC的分化和成熟。

IL-17A；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子；骨髓衍生樹突狀細胞；脂多糖

樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)是唯一能活化初始T細胞的抗原提呈細胞。成熟DC表達高水平的共刺激分子以及某些黏附分子等，增強DC抗原提呈作用，促進T細胞增殖。成熟DC還能產生IL-12、IL-10、IL-6等細胞因子，影響初始T細胞(Th0)的分化，在機體抗腫瘤、抗感染、移植排斥及自身免疫性疾病的預防與治療中發揮著重要作用[1-3]。體內DC數量非常少，難于收集，所以建立有效的DC體外擴增方法體系對一些疾病的研究非常重要。Rosenzwaig等[4]運用GM-CSF和TNF-α刺激體外培養的CD34+干細胞，DC比例高達20%～38%。另外，在體外培養DC的后期加入LPS能誘導髓系DC的成熟[5]。

IL-17(又稱IL-17A)主要由Th17細胞分泌，作為促炎細胞因子，參與一些疾病相關的炎癥病理反應，如牛皮癬和風濕性關節炎等[6]。IL-17A 也被證實在抵抗胞外菌感染中具有重要作用，例如銅綠假單胞菌[7]、肺炎克雷伯氏菌[8]，其作用機制主要與其對中性粒細胞的趨化作用有關。但在胞內菌感染中，IL-17A作用機制不同于胞外菌，已有報道顯示IL-17A通過調節DC的功能促進CTL對李斯特菌感染的免疫應答[9]。Bai等[10]的研究也顯示，在宿主抗衣原體呼吸道感染中，IL-17A通過調節DC功能促進抗衣原體特異性Th1免疫應答而發揮免疫保護作用。雖然一些體內研究已經證實，IL-17A對DC的分化成熟有影響，但是在體外IL-17A對DC分化和成熟的作用鮮有報道。本研究首先建立小鼠骨髓來源的樹突狀細胞體外擴增模型，在骨髓衍生DC 誘導分化的不同階段加入不同濃度的rmIL-17A，采用流式細胞術和ELISA方法分別檢測不同實驗條件下骨髓衍生DC 表面分子的表達以及細胞因子分泌狀態，探討IL-17A對骨髓衍生DC分化和成熟的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1 小鼠骨髓細胞的分離在Lutz方法[11]的基礎上加以改進。無菌狀態下分離6～8周齡雌性BALB/c小鼠(購自軍事醫學科學院實驗動物中心)脛骨和股骨，用0.45 mm針頭的注射器吸取冷RPMI1640(Hyclone,美國)沖出骨髓細胞，離心、棄上清后向沉淀細胞中加ACK(150 mmol/L NH4Cl,10 mmol/L KHCO3,0.1 mmol/L EDTA)破除紅細胞，洗去ACK，沉淀細胞用含10%FBS(Hyclone,美國)的RPMI1640完全培基重懸，調節細胞終濃度為2×106ml-1。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓細胞衍生誘導DC的分化和成熟取上述骨髓細胞懸液1 ml放入培養皿中，加入9 ml [含rmGM-CSF(20 ng/ml，Pepro Tech Inc公司)和/或 rmIL-17A(10 ng/ml or 100 ng/ml，Biolegend公司)]RPMI1640完全培基，培養8 d。分別于培養第3天和第6天補充新鮮完全培基[含rmGM-CSF(20 ng/ml)和/或rmIL-17A(10 ng/ml or 100 ng/ml)]，于培養第8天收集非貼壁細胞，使用MACS方法分離純化CD11c+骨髓細胞衍生DC。取純化后的DC放入24孔培養板中(8×105細胞/孔)繼續培養36 h，加入1 μg/ml LPS(Pepro Tech Inc公司)和/或rmIL-17A(10、100 ng/ml)。收獲培養上清液檢測IL-12p40及IL-10水平，沉淀細胞檢測DC表面分子表達。

1.2.2流式細胞術檢測骨髓細胞衍生DC表面分子的表達取各組CD11c+骨髓細胞衍生DC，調整細胞濃度為106ml-1，加入1 μl抗鼠APC-CD11c抗體(BD公司)，及1 μl FITC標記的抗鼠CD40、MHCⅡ、CD80、CD86抗體(BD公司)，4℃避光孵育30 min，用staining buffer洗滌2次，用200 μl 2%多聚甲醛固定后，用流式細胞儀(CantoⅡ,BD公司)檢測。采用BD公司的CellQuest 軟件分析。

1.2.3ELISA檢測骨髓細胞衍生DC細胞因子的分泌用雙抗夾心法檢測細胞培養上清中細胞因子的水平，用全自動酶標儀(Bio-Rad，美國)讀取405 nm OD值。ELISA抗體和標準品均購自eBioscience公司。

1.3統計學分析用SPSS12.0 版的統計軟件分析數據，用Student′t檢驗進行組間比較，以P<0.05為有統計學意義。

2　結果

2.1IL-17A可促進GM-CSF誘導骨髓細胞衍生DC前體細胞表型的發展在GM-CSF誘導的骨髓細胞衍生DC分化階段，加入低濃度rmIL-17A(10 ng/ml)及高濃度rmIL-17A(100 ng/ml)，與未加rmIL- 17A對照組相比，骨髓細胞衍生DC表面分子 CD40、CD80、CD86和 MHCⅡ的表達水平均增加，且具有劑量依賴性，以高濃度rmIL-17A刺激組的CD40及 MHCⅡ表達增加最顯著，見圖1。

圖1　rmIL-17A對GM-CSF誘導的骨髓細胞衍生DC前體細胞表型的影響Fig.1　Effects of rmIL-17A on phenotype of BMDC progenitors propagated in GM-CSF

圖2　rmIL-17A對LPS誘導的骨髓細胞衍生DC表面分子表達的影響Fig.2　Effects of rmIL-17A on surface molecules expression of BMDC induced by LPSNote: n=4/group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

2.2IL-17A可協同LPS上調骨髓細胞衍生DC表面分子的表達骨髓細胞衍生DC 經GM-CSF刺激培養8 d后，加入含LPS(1 μg/ml)和/或rmIL-17A(10、100 ng/ml)的RPMI1640完全培基中繼續培養36 h，與誘導成熟過程中不加rmIL-17A的對照組比較，低濃度rmIL-17A刺激組骨髓細胞衍生DC共刺激分子CD80、CD86 和MHCⅡ的表達水平均明顯增加(P<0.01,P<0.001,P<0.001)，并且隨著rmIL-17A濃度的增加，CD86和MHCⅡ的表達水平也隨之增高(P<0.01,P<0.001),但CD40的表達水平只有在高濃度rmIL-17A刺激組顯著增加(P<0.05)，見圖2。

圖3　rmIL-17A對LPS刺激的骨髓細胞衍生DC細胞因子分泌的影響Fig.3　Effects of rmIL-17A on cytokines secreted by BMDC with stimulation of LPSNote: n=4/group,**.P<0.01,***.P<0.001.

2.3IL-17A可協同LPS上調骨髓細胞衍生DC細胞因子IL-12p40 和IL-10的分泌用LPS誘導DC發育成熟過程中，與未加rmIL-17A的對照組相比，低濃度rmIL-17A(10 ng/ml)組LPS刺激骨髓細胞衍生DC分泌IL-12p40和IL-10水平均顯著增加(P<0.001)；高濃度rmIL-17A(100 ng/ml)組DC 分泌IL-12p40水平顯著增高(P<0.001)，但IL-10沒有變化，見圖3。

3　討論

IL-17A作為炎癥介質，與炎癥反應、自身免疫性疾病及移植排斥反應的發生和發展密切相關，主要通過刺激靶細胞釋放前炎癥細胞因子及動員中性粒細胞發揮作用[12]。我們先前的研究結果顯示，IL-17A通過直接調節DC的功能促進Th1細胞在小鼠衣原體感染中的免疫應答[10]，本研究通過體外實驗進一步闡述了IL-17A對DC不同分化階段的影響。首先，探討了IL-17A對骨髓細胞衍生DC前體表型的影響，用含rmIL-17A及GM-CSF的完全培基聯合培養小鼠骨髓細胞衍生DC 前體細胞，結果顯示，IL-17A可促進GM-CSF誘導的骨髓細胞衍生DC前體表面分子CD40、CD86和MHCⅡ的表達。其次，探討了IL-17A對培養后期LPS刺激骨髓細胞衍生DC成熟的影響。骨髓細胞經GM-CSF誘導分化后，加入LPS，聯合或者不聯合rmIL-17A(10、100 ng/ml)刺激骨髓衍生DC， IL-17A上調了LPS刺激的骨髓細胞衍生DC 共刺激分子的表達，同時也增加了骨髓衍生DC IL-12p40和IL-10產生水平。

作為專職APC，DC除具有提呈抗原，激發機體產生免疫應答的重要功能外，成熟DC還能產生大量的細胞因子，調節免疫應答。DC分泌的細胞因子作為T細胞活化的第三信號在很大程度上決定了免疫反應的類型，如DC通過分泌IL-12和IFN-γ等誘導Th0向Th1細胞分化，通過分泌IL-10抑制抗原特異性T細胞增殖，誘導Treg和CD8+T細胞分化，在維護機體免疫平衡中發揮了重要作用[13]。本文結果顯示，在體外IL-17A能夠促進LPS誘導的骨髓細胞衍生DC 分泌高水平IL-12p40和IL-10，提示IL-17A可能對Th1以及Treg分化有影響。Duan等[14]體內研究結果證實，在同種異體器官移植排斥反應中IL-17通過調節DC的功能促進Th1細胞應答。以上研究結果為進一步開展對DC的深入探討以及臨床應用奠定了基礎。

Lubberts等[15]使用表達IL-17R的BM嵌合體小鼠，證明在誘導關節炎模型的佐劑中，非造血細胞上IL-17R信號對慢性破壞性滑膜炎的形成非常重要，該研究結果提示，IL-17通過與受體特異性結合，激活相應的信號通路，發揮促進炎癥發展、免疫排斥、造血等功能。Mary等[16]研究結果顯示，20%的骨髓細胞衍生DC前體細胞表達IL-17R，但是，充分分化的骨髓衍生DC上IL-17R表達較少。這與本文結果中IL-17A促進骨髓衍生DC前體細胞表型發育，但對充分分化的骨髓細胞衍生DC的成熟無影響(數據未顯示)相符。

總之，本次體外實驗不僅成功構建了骨髓細胞衍生DC體外擴增模型，還揭示了在體外IL-17A可通過協同GM-CSF和LPS影響骨髓細胞衍生DC的發育和成熟,但具體機制還需要進一步的研究。

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[收稿2015-11-11修回2015-12-11]

(編輯倪鵬)

IL-17A promotes differentiation and maturation of bone marrow-derived dendritic cells by cooperating with GM-CSF and LPS

LIU Teng-Li,QIAO Sai,ZHENG Ning-Bo,TANG Ying,ZHAO Hui-Li,WANG Yue,LIANG Ju-You,SUN Li-Da,BAI Hong.

Key Laboratory of Cellular and Molecular Immunology of Tianjin,Department of Immunology,School of Basic Medical Science,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China

Objective:To investigate the effect of IL-17A on the differentiation and maturation of murine bone marrow-derived dendritic cells(BMDCs).Methods: Murine bone marrow cells were isolated and cultured in RPMI1640 complete medium in the presence of GM-CSF(20 ng/ml) for 8 days to induce differentiation of murine bone marrow cells to DC progenitors.Then these cells were treated with LPS(1 μg/ml) for 36 h which polarized immature DCs into mature DCs.Different concentrations of rmIL-17A(10 or 100 ng/ml) was added to the culture medium at different stages of BMDC differentiation and maturation.Co-stimulatory molecules expression on BMDC were analyzed by flow cytometry,and the culture supernatants were analyzed for IL-12p40 and IL-10 level by ELISA.Results: rmIL-17 could promote co-stimulatory molecules( CD40,CD80,CD86 and MHCⅡ) expression on BMDCs in a does-dependent manner,especially,the expression of CD40 and MHCⅡ had a significant increase in high concentration of rmIL-17A group;rmIL-17A was added while LPS induced maturation of BMDCs.CD40,CD80,CD86 and MHCⅡ expression on BMDC increased sharply in LPS plus rmIL-17A stimulation group,besides,CD86,MHCⅡ showed a higher level expression on BMDC with the increase of concentration of rmIL-17A.Furthermore,secretion of IL-12p40 and IL-10 increased significantly in the group of DCs treated with LPS plus low concentration of rmIL-17 compared with the group without rmIL-17(P<0.001).However,high concentration of rmIL-17A group showed significantly higher levels of IL-12p40(P<0.001),but there was no difference in IL-10.Conclusion: IL-17A promotes the phenotypic development of BMDC progenitors propagated in GM-CSF and cooperate with LPS to induce BMDC differentiation and maturation.

IL-17A;GM-CSF;BMDC;LPS

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.015

①本文受國家自然科學基金(31070797)、天津市應用基礎及前沿技術研究計劃重點項目基金(15JCZDJC34900，11JCZDJC16200)及教育部博士點基金(20121202110012)資助。

劉騰麗(1990年-)，女，碩士，主要從事感染免疫方面的研究，E-mail：liutengli_27@126.com。

及指導教師：白虹(1962年-)，女，教授，博士生導師，主要從事感染免疫方面的研究，E-mail：hongbai25@163.com。

R392.12

A

1000-484X(2016)10-1477-04