消化道腫瘤淋巴結轉移灶P53、bcl—2、survivin與化療藥敏性的關系研究

陳希++趙建華

[摘要] 目的 研究消化道腫瘤淋巴結轉移灶P53、bcl-2、survivin與化療藥敏性的關系。 方法 選擇62例消化道惡性腫瘤患者的原發灶及轉移淋巴結的腫瘤組織，進行四氮唑鹽（MTT）法原代細胞培養體外化療藥敏性實驗，對腫瘤細胞對順鉑（DDP）、長春新堿（VCR）、紫杉醇（PTX）、甲氨蝶吟（MTX）4種常用化療藥物的體外化療藥敏性進行檢測，并采用免疫組織化學法（SP）對原發灶及轉移灶中的P53、bcl-2、survivin的表達進行檢測。 結果 P53與bcl-2在原發灶和轉移灶間的表達呈顯著相關性（P<0.05），而survivin無顯著相關性（P>0.05）。DDP、VCR、MTX對轉移灶的腫瘤細胞抑制率顯著低于原發灶（P<0.05），而PTX在原發灶與轉移灶對腫瘤細胞的抑制情況無顯著差異（P>0.05）；原發灶中的化療藥物抑制率均與P53、bcl-2、survivin不相關（P>0.05）；而在淋巴結轉移灶中，P53與DDP對腫瘤細胞的抑制率呈負相關（P<0.05），survivin及bcl-2均與PTX抑制率呈負相關（P<0.05）。 結論 消化道腫瘤淋巴結轉移灶中P53、bcl-2、survivin的表達情況及化療藥敏性均體現出異質性，術后化療應盡量避免化療靶目標的偏差，以提升癌癥綜合治療的效果。

[關鍵詞] 消化道腫瘤；淋巴結；凋亡抑制蛋白；化療藥敏性

[中圖分類號] R735 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）25-0012-03

Research of relationship between expression of P53， bcl-2， survivin and chemosensitivity in lymph node metastases of gastrointestinal tumors

CHEN Xi ZHAO Jianhua

Department of Oncology， the First Peoples Hospital of Jingdezhen City in Jiangxi Province， Jingdezhen 333000， China

[Abstract] Objective To explore the relationship between expression of P53， bcl-2， survivin and chemosensitivity in lymph node metastases of gastrointestinal tumors. Methods The tumor tissue and metastasis lymph nodes of 62 patients with gastrointestinal tumors were collected， and the tumor cells chemosensitivity to DDP， VCR， PTX， MTX were detected by MTT assay，meanwhile the expression of P53， bcl-2 and survivin in primary tumors and lymph node metastases were detected by immunohistochemically. Results The expression of P53 and bcl-2 in primary tumors and lymph node metastases were significant correlation（P<0.05），while survivin were not（P>0.05）. The inhibition of tumor cells of DDP， VCR， MTX in lymph node metastases were significantly lower than those in primary tumors（P<0.05）， while PTX were not（P>0.05）. There were no correlation between expression of P53， bcl-2， survivin and inhibition rate of tumor cells（P>0.05）， but in lymph node metastases，the expression of P53 was negative correlation with inhibition rate of tumor cells for DDP inhibition（P<0.05）， and both of survivin and bcl-2 were negative correlation for PTX（P<0.05）. Conclusion The expression of P53， bcl-2， and survivin chemosensitivity in lymph node metastases of gastrointestinal tumors are different from primary tumors， so it is necessary to avoid the deviation of chemotherapy target postoperative as far as possible to improve the comprehensive curative effect.

[Key words] Gastrointestinal tumors； Lymph node； Apoptosis inhibiting protein； Chemosensitivity

消化系統惡性腫瘤在我國各類系統腫瘤的發病率中占首位，其中胃癌、食管癌、結直腸癌、肝癌的死亡總數占前10位，在惡性腫瘤中的比例占到40.75%[1]。術后輔助化療是治療消化道惡性腫瘤的重要手段。研究表明，多數化療藥物抗腫瘤的機制都是通過對凋亡相關基因或腫瘤細胞DNA發揮作用、誘導細胞凋亡來實現的[2，3]。然而化療藥物誘導的腫瘤細胞凋亡卻會受凋亡抑制蛋白的抑制作用，產生多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR）表型，從而嚴重影響化療的效果。P53是一種重要的凋亡調節基因，bcl-2與survivin是兩種新發現的耐藥基因蛋白。本研究對消化道腫瘤淋巴結轉移灶P53、bcl-2、survivin與化療藥敏性的相關性進行了探討，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

選擇2015年1月～2016年5月的62例消化道惡性腫瘤并伴淋巴結轉移患者，疾病診斷均經手術及病理證實，排除術前放、化療者。其中男35例，女27例；年齡29～78歲，平均（59.44±4.16）歲；胃癌28例，食管癌17例，大腸癌17例。本研究符合醫學倫理要求，且取得所有患者的知情同意。

1.2 腫瘤細胞培養及化療藥敏性實驗

采集患者的原發灶及轉移淋巴結的腫瘤組織置于雙抗培養液中，在2 h內進行四氮唑鹽（MTT）法原代細胞培養體外化療藥敏性實驗。選用4種常用化療藥物：順鉑（DDP）、長春新堿（VCR）、甲氨蝶吟（MTX）、紫杉醇（PTX），藥物終濃度以血漿峰值藥物濃度為準，以不加藥物的細胞為對照，每種藥物均設3個復孔，接種細胞懸液200 μL/孔，振蕩混勻后加入5%CO2飽和濕度的培養箱培養48 h，溫度控制在37℃，加5 g/L噻唑藍（MTT）20 μL/孔再進行3～24 h的培養。終止培養后進行離心處理棄上清，之后加入二甲基亞礬（DMSO）100 μL/孔，混勻后使用酶標儀570 nm對各孔吸光度（A）進行測試。腫瘤細胞生長抑制率（IR）=（1-給藥孔A/對照組A）×100%。

1.3免疫組織化學法（SP）測定

采用SP法對原發灶及轉移淋巴結的P53、bcl-2、survivin進行測定，嚴格按試劑盒說明書操作。由深圳市國賽生物技術有限公司提供鼠抗人P53、bcl-2、survivin單克隆抗體及免疫組織化學染色試劑盒。用已知陽性切片作陽性對照，用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照。每張切片取5個高倍視野，各計數100個細胞，P53染色陽性表現為胞核著黃色，bcl-2與survivin均為胞膜和（或）胞質著黃色。著色強度計分標準與陽性細胞率計分標準參考李勇[4]的研究，根據二者的積分乘積判斷陰陽性，即乘積=1為（-）；乘積2～3為（+）；乘積4～7為（++）；乘積≥8為（+++）。

1.4 統計學方法

采用SPSS18.0統計學軟件進行數據處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用配對t檢驗及直線相關分析，等級資料采用Wilcoxon配對秩和檢驗與Spearman等級相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 原發灶和淋巴結轉移灶的P53、bcl-2、survivin表達情況

P53在原發灶和淋巴結轉移灶中的表達一致率為68.04%（36/62），survivin為25.81%（16/62），bcl-2為43.55%（27/62）；P53與bcl-2的表達一致率較高，而survivin較低。三者在原發灶和淋巴結轉移灶中的表達強度無顯著差異（P>0.05）。P53與bcl-2在原發灶和淋巴結轉移灶間的表達呈顯著相關性（P<0.05），而survivin無顯著相關性（P>0.05）。

2.2 4種化療藥物對原發灶和淋巴結轉移灶的腫瘤細胞抑制率比較

PTX對原發灶和淋巴結轉移灶的腫瘤細胞抑制率無明顯差異（P>0.05），但DDP、VCR、MTX對淋巴結轉移灶腫瘤細胞抑制率顯著低于原發灶（P<0.05）。直線相關分析顯示，MTX對原發灶和淋巴結轉移灶的腫瘤細胞抑制率呈正相關性。

2.3原發灶和淋巴結轉移灶P53、bcl-2、survivin表達與化療藥物抑制率的關系

原發灶中的P53、bcl-2、survivin均與化療藥物抑制率無明顯相關性（P>0.05）。而在淋巴結轉移灶中，P53與DDP對腫瘤細胞的抑制率呈負相關（r=-0.426，P<0.05）；survivin及bcl-2均與PTX抑制率呈負相關（r=-0.399，r=-0.483，P<0.05）。

3討論

淋巴結轉移是影響惡性腫瘤預后的獨立危險因素[5]，消化系統惡性腫瘤發生淋巴結轉移的比例達到60%～80%[6，7]。在腫瘤進展過程中，亞克隆細胞群的侵襲能力、化療藥敏性等部分細胞學特性可能會發生異質變化。腫瘤的MDR與不同信號轉導通路協調的級聯樣網絡式調節機制及多種基因/蛋白的表達有密切聯系[8]，其呈現的明顯異質性變化涉及到腫瘤進展過程中不同細胞亞群發生的基因及大分子改變[9]，但目前國內尚缺乏有關消化道腫瘤轉移灶凋亡抑制蛋白的表達與化療耐藥性的關系的研究報道。

P53、bcl-2及survivin是三種具有細胞凋亡調節功能的凋亡抑制蛋白，也是與消化道腫瘤耐藥相關的因子之一。本研究顯示，P53與bcl-2在原發灶和淋巴結轉移灶中的表達一致率較高，而survivin較低，提示消化道腫瘤淋巴結轉移灶凋亡抑制蛋白的表達發生了異質性變化；4種常用化療藥物對原發灶與轉移灶腫瘤細胞的抑制率有明顯差異，提示轉移灶的化療藥敏性也具有異質性。

目前認為，MDR形成機制至少包括兩個途徑，其一為經典耐藥途徑，其二為化療藥物作用于腫瘤細胞后產生的凋亡抵抗[10，11]?；熕幬锟蓪δ[瘤細胞DNA構成破壞，細胞可通過P53通路反式激活P21WAF/CIP1基因程序而誘導細胞凋亡，與野生型P53不同，突變型P53不具有對bcl-2及survivin負反饋調節作用[12]；bcl-2可通過影響自擾細胞色素線粒體正常釋放而干擾蛋白酶級聯反應激活，是最終凋亡調控點；而survivin可通過直接抑制caspase阻斷細胞凋亡。故化療藥物作用于靶點時，bcl-2與survivin這兩種抗凋亡蛋白可對化療藥物誘導的腫瘤細胞凋亡產生抑制作用，從而出現MDR表型[13，14]。

相關性分析提示原發灶中的P53、bcl-2、survivin均與化療藥物抑制率無明顯相關性，而在淋巴結轉移灶中卻與不同化療藥物的抑制率呈負相關，提示轉移灶與原發灶具有MDR異質性，主要耐藥相關因子不同而使化療藥物的抑制率有所差異，這可能與腫瘤細胞對化療藥物的MDR是涉及多種基因/蛋白共同參與、機制復雜的多環節網絡化調節有關。孫延霞[15]研究指出，腫瘤組織耐藥相關因子表達與某種化療藥物對腫瘤細胞的抑制率表現出負相關的關系，說明該耐藥相關因子高表達時對某種藥物敏感性下降表現出相對化療耐藥。

綜上所述，消化道腫瘤淋巴結轉移灶中P53、bcl-2、survivin的表達情況及化療藥敏性均體現出異質性，提示術后化療應盡量避免化療靶目標的偏差，以提升癌癥綜合治療的效果。

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（收稿日期：2016-06-22）