蘿卜離體再生體系的建立

黃俊豪　徐文玲　劉賢嫻　劉辰　王淑芬　楊建平

摘要：以8種不同基因型的蘿卜為試驗材料進行帶柄子葉離體培養，篩選誘導不定芽和不定根的最佳培養基配方。結果表明：喜諾曉青和翠綠蘿卜具有高頻再生潛力，由其帶柄子葉誘導不定芽的最佳培養基為：Ms培養基+30g·L^-1蔗糖+0.7%瓊脂+5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1NAA，誘導不定根的最佳培養基為：Ms培養基+30g·L^-1蔗糖+0.7%瓊脂+5mg·L^-16-BA+0.10mg·L^-1NAA。

關鍵詞：蘿卜；愈傷組織；不定芽；不定根；激素

中圖分類號：S631.104⁺.3 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）04-0021-03

蘿卜（Raphanus sativus L.）又名萊菔，是十字花科蘿卜屬的二年生草本植物。作為一種以肉質根為主要食用部位的蔬菜作物，蘿卜深受廣大群眾喜愛，在我國南北各地普遍栽培。隨著生活水平的提高，人們對蘿卜品質的要求也日益增長，這就對盡快育成優質抗病的蘿卜新品種提出了迫切要求。建立高效的離體再生體系是親本無性快繁和基因工程育種的基礎環節，然而蘿卜一直以來被認為是一種再生頑拗型植物，再生難度大、廣泛適應性不強。本試驗選用不同基因型蘿卜為材料，從培育無菌苗到誘導愈傷組織、不定芽、不定根，再到最后煉苗移栽，擬建立起完整的具有廣泛適應性的蘿卜離體再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

濰縣青、青圓脆、滿堂紅、沙窩青、堤東、花葉紅玉春、喜諾曉青和翠綠蘿卜8個蘿卜品種。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗培育 將蘿卜種子于超凈工作臺上用75%酒精處理30s，再用4%次氯酸鈉溶液滅菌3min，最后用蒸餾水沖洗3遍，接種于1/2MS培養基上，室溫25℃、光照時間16h·d^-1條件下培養，得到無菌苗。

1.2.2 愈傷組織和不定芽的誘導 取生長3～5d的無菌苗，切取子葉，留葉柄并將生長點去除干凈，接種于不同激素配比的MS培養基上，在室溫25℃、光照時間16h·d^-1條件下培養15～20d，統計愈傷組織和不定芽的誘導率。通過記錄每種培養基內蘿卜帶柄子葉的再生情況，確定適宜的愈傷組織和不定芽誘導激素配比和誘導天數。

1.2.3 不定根的誘導 取誘導出的不定芽，接種于不同激素配比的MS培養基上，在室溫25℃、光照時間16h·d^-1條件下培養15～20d，統計不定根誘導率。通過記錄每種培養基內不定芽的生根情況，確定適宜的不定根誘導激素配比和誘導天數。

1.2.4 煉苗移栽 將不定根誘導成功的再生植株培養瓶的蓋子揭開，注意適當保濕，使再生苗的生長環境接近于田間，進行煉苗培養。2～3d后將再生苗移栽于營養缽中，于煉苗室內緩苗培養15d左右，再移栽到大田中。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織誘導培養基的篩選

以MS培養基+30g·L^-1蔗糖+0.7%瓊脂+不同配比激素，在pH5.7左右誘導蘿卜帶柄子葉再生愈傷組織效果明顯，8個蘿卜品種分別經由2，4-D、IBA和NAA配合6-BA均能誘導出愈傷，其中，2，4-D配合6-BA誘導愈傷組織的效果最佳（表1）。

雖然8個蘿卜品種的帶柄子葉均誘導形成了愈傷組織，但是愈傷進一步分化形成不定芽卻極其困難。在各種激素的誘導下，愈傷組織極易先生根，卻難以誘導出芽，僅喜諾曉青和翠綠蘿卜在NAA配合6-BA誘導培養基中不僅再生出了愈傷組織，還再生出了不定芽，但誘導率卻很低。

2.2 不定芽誘導培養基的進一步篩選

以喜諾曉青和翠綠蘿卜為試材，進一步細化NAA和6-BA激素配比進行不定芽的誘導。發現隨激素濃度的增加，蘿卜不定芽誘導率有先增加后降低的趨勢（表2）。6-BA和NAA濃度比值為100時，不定芽的誘導率較高，比值過高或過低會導致不定芽的誘導率下降。綜合比較，5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1NAA對于喜諾曉青和翠綠蘿卜誘導不定芽較適宜。翠綠的不定芽誘導率明顯高于喜諾曉青，說明翠綠的基因型易再生培養。

2.3 不定根誘導培養基的篩選

在誘導不定芽的基礎上，進一步試驗不同濃度6-BA與NAA配比對喜諾曉青和翠綠蘿卜不定根再生的影響，發現不定根的誘導與NAA濃度密切相關，NAA濃度過低時無法生成不定根，而NAA濃度過高時，生根率也會降低?？傮w來看，以5mg·L^-16-BA+0.10mg·L^-1NAA對于喜諾曉青和翠綠蘿卜誘導不定根比較適宜（表3）。翠綠比喜諾曉青更易于再生出不定根，說明易于誘導出不定芽的基因型也同樣適宜進一步誘導不定根，蘿卜的再生頻率高低和其基因型密切相關。

3 結論與討論

植物組織培養過程中，不定芽有通過外植體直接誘導出芽和經愈傷組織誘導出芽兩種途徑，2，4-D、IBA和NAA配合6-BA誘導愈傷組織、再經愈傷組織誘導出芽在番茄、黃瓜等蔬菜作物中均有報道。關于蘿卜的離體培養，僅有誘導出愈傷組織和直接誘導出不定芽的報道，并沒有從愈傷組織再誘導出芽的報道，所以，蘿卜離體再生誘導的關鍵是直接誘導不定芽的分化和增殖。

本試驗選用濰縣青、青圓脆、滿堂紅、沙窩青、堤東、花葉紅玉春、喜諾曉青和翠綠共8份試驗材料，多數材料僅能再生出愈傷組織，難以進一步分化再生出不定芽，其中僅有喜諾曉青和翠綠蘿卜誘導出了不定芽并進而形成不定根。說明蘿卜的再生能力較弱，其再生能力在不同基因型間差異十分顯著。

外植體的選擇也是影響蘿卜再生誘導效果的關鍵因素之一。本試驗初期選用了下胚軸、子葉、子葉橫切、子葉縱切和帶柄子葉這幾種外植體材料，其中再生效果最差的是下胚軸，效果最好的是帶柄子葉，所以后期試驗都采用帶柄子葉作為外植體。本研究發現蘿卜帶柄子葉離體培養的再生方式相對特殊，在不定芽誘導過程中先是子葉葉柄基部膨大產生少量愈傷組織后再生成大量不定芽，若外植體接種后產生大量愈傷組織就不能有效產生不定芽，說明誘導愈傷組織的多少對不定芽再生有重要影響，這可能與其再生頑拗有所關聯，關于產生愈傷組織的多少對于有效誘導不定芽的影響機制有待進一步深入研究。

生長激素的配比也是植物再生至關重要的因素，不同的植物對生長激素有不同的要求。本試驗在MS培養基中分別添加2，4-D、IBA、NAA和6-BA，最終發現僅有NAA配合6-BA能夠直接誘導蘿卜帶柄子葉生成不定芽和不定根。通過多組試驗，確定其誘導不定芽的最佳培養基為MS培養基+30g·L^-1蔗糖+0.7%瓊脂+5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1NAA，誘導不定根的最佳培養基為MS培養基+30g·L^-1蔗糖+0.7%瓊脂+5mg·L^-16-BA+0.10mg·L^-1NAA。