濰縣蘿卜莖葉功效成分分子追蹤及生物活性研究

李桂鳳　張麗　王燕燕　王洪亮　李星星　邱法武

摘要：為探明濰縣蘿卜莖葉的功效成分，追蹤其分子結構，本研究采用硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析及RP-18色譜柱等對濰縣蘿卜莖葉甲醇提取物進行分離和純化，共獲得了18個化合物，分別是芥子油（Mustard oil）、芥子酸甘油酯（脂肪油，Mustard acid glyceride）、芥子堿硫氰酸鹽（脂肪油，Sinapine thiocya-nate）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、γ-谷甾醇（γ-sitosterol）、蘿卜苷（Glucoraphanin）、胡蘿卜苷（Daucosterol）、膽堿（choline）、亞麻酸（Linolenic acid）、萊菔素（sulforaphene）、黃酮（F1avone）、十八碳二烯酸（Octadecadienoicaeid）、十六碳一烯酸（Hexadeeylenic aeid）、十八碳一烯酸（Vaccenic aeid）、十四烷酸（Myristic acid）、亞麻腦苷脂（Linum cerebroside）、十八烷酸（Octadecanoic acid）、二十烷酸（Eicosanoic aeid）。其中，純度達95%的亞麻腦苷脂為首次從植物中獲得，并通過理化性質分析和Ms、NMR等波譜方法對其結構進行了鑒定。另外，萊菔素具有重要的生物活性，1mg/mL萊菔素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有顯著的抑制作用。

關鍵詞：濰縣蘿卜莖葉；功效成分；分子追蹤；生物活性

中圖分類號：S631.101 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）04-0050-04

濰縣蘿卜是一種食藥皆優的常食蔬菜，其莖葉營養豐富，含有大量的活性物質。研究表明，蘿卜莖葉中含有的萊菔素，具有很好的防癌抗癌功效及殺菌消炎解毒等作用；含有的糖化酵素，能分解食物中的亞硝胺，可大大降低其致癌作用；含有較多的木質素，能使體內巨細胞吞噬癌細胞的活力提高2～4倍；含有的芥子油和粗纖維，可促進胃腸蠕動，推動大便排出；含有的萊釀腦、淀粉酶等成分，具寬胸利氣、健胃消食的功能等。

但由于目前家庭保鮮技術相對滯后，以及人們習慣只吃蘿卜而丟掉其莖葉，造成大量資源的浪費，僅濰坊地區每年就有近15×10²kg的蘿卜莖葉成為垃圾，造成環境污染。本研究通過對濰縣蘿卜莖葉的功效成分進行分子追蹤研究，以期為其綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：濰縣蘿卜莖葉于2014年11月18日采于濰坊市寒亭區黃埠村，洗凈后50℃烘干，粉碎過20目篩備用。由山東師范大學生命科學學院李法曾教授鑒定。標本保存于山東綠原農業科技研究院課題組（編號：zxs-188）。

試劑：石油醚、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇，均為分析純。

1.2 儀器與設備

ZF-6型三用紫外線分析儀（254nm UV燈泡，全套旋轉蒸發儀裝置）；超導核磁共振儀Bruker AM-400型；柱層析硅膠（200～300目），薄層層析硅膠GF254（10～40μm）；SephadexLH-20葡聚糖凝膠柱，輔以5%H₂SO₄-乙醇溶液，加熱顯色。

1.3 分離純化

將干燥粉碎的濰縣蘿卜莖葉（10008g）在室溫下用甲醇浸泡提取4次，每次浸泡4天，合并粗提液（約18L），真空減壓濃縮得到粘稠暗綠色浸膏（約108g）。浸膏用蒸餾水稀釋后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，分別合并各萃取液（各相均約1800mL），真空減壓濃縮得到石油醚部位61.85g，乙酸乙酯部位28.91g。

經硅膠柱分離，石油醚部位，拌樣上300目硅膠柱，進行層析，以石油醚-氯仿-甲醇梯度洗脫：石油醚-氯仿（2：1，V：V，下同）洗脫獲得1～5號化合物，石油醚-氯仿（1：1）洗脫獲得6、7號化合物，氯仿-甲醇（100：1）洗脫獲得8、9、10號化合物，氯仿-甲醇（50：1）洗脫獲得11、12號化合物，氯仿-甲醇（25：1）洗脫獲得13、14號化合物，氯仿-甲醇（10：1）洗脫獲得15號化合物。其中石油醚-氯仿（1：1）洗脫下的產物，干燥后呈現黑兼白色球狀固體，將其用丙酮或石油醚或其混合物洗出白色絮狀物質，用甲醇重結晶得到乳白色粉末結晶，命名為X16化合物，經波譜解析被鑒定為新化合物。乙酸乙酯部位，拌樣上300目硅膠柱，經多次硅膠柱層析及氯仿-甲醇（200：1）洗脫，得到17號和18號化合物。

2 結果與分析

2.1 功效成分的分離鑒定

通過結晶與重結晶及色譜純化等方法共分離出18種化合物，經理化鑒定、薄層色譜及四大光譜方法鑒定，確定了17種化合物，分別為芥子油（Mustard oil）、芥子酸甘油酯（脂肪油，Mustardacid glyeeride）、芥子堿硫氰酸鹽（脂肪油，Sinap-ine thiocyanate）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、γ-谷甾醇（γ-sitosterol）、蘿卜苷（Glueoraphanin）、胡蘿卜苷（Daucosterol）、膽堿（Choline）、亞麻酸（Linolenic acid）、萊菔素（Sulforaphene）、黃酮（Flavone）、十八碳二烯酸（Oetadeeadienoie acid）、十六碳一烯酸（Hexadecylenic acid）、十八碳一烯酸（Vaccenic acid）、十四烷酸（Myristie acid）、亞麻腦苷脂（Linum cerebroside）、十八烷酸（Octade-canoic acid）、二十烷酸（Eicosanoic acid）。X16化合物為首次從植物中獲得的化合物，本試驗對其結構進行了進一步的分析、鑒定。

2.2 X16化合物理化性質及結構鑒定

經提取、分離、純化至純度達95%時，采用Bruker AM-400型超導核磁共振儀測定X16化合物的C、H圖譜，見表1。

經波譜解析，X16化合物為白色結晶狀粉末，10%硫酸乙醇溶液顯色呈現紫黑色斑點。溶于甲醇，微溶于氯仿，不溶于石油醚或丙酮。高分辨電噴霧質譜表明其分子式為C₄₈H₉₁NO₁₀，精確分子量842.6738（計算值842.6716，C₄₈H₉₂NO₁₀）。在化合物的核磁共振碳譜中化學位移為103.4（C-1″）、73.3（C-2″）、76.4（C-3″）、69.9（C-4″）、76.8（C-5″）和60.9（C-6″）的6個碳信號表明分子中存在葡萄糖基。氫譜中化學位移4.14的端基氫（1H，d，J=7.8 Hz，H-1″），表明該葡萄糖為B構型。氫譜中化學位移1.24處顯示多個亞甲基質子信號，碳譜中28.4～29.1處也有多個亞甲基碳信號，表明結構中含有長脂肪鏈；但氫譜和碳譜均只有兩個甲基信號，表明脂肪鏈沒有支鏈。碳譜中化學位移49.7的碳與胺基（-CH-NH-）相連，表明兩條長脂肪鏈通過胺基相連。

通過以上分析，推測X16為腦苷脂類化合物，其結構為一條長脂肪鏈與一條長脂肪胺鏈相連（見圖1）。核磁共振譜亦顯示存在兩個雙鍵（譜圖中8和9之間對應C為129.2和130.2，H對應為5.37（2H，m）；15，16之間對應C為129.3和129.5，H對應為5.32（2H，m），由此可確定兩個雙鍵的具體位置，經與文獻對比，該化合物最終被確定為1-氧-（β-D-葡萄糖）-（2S，3S，4R，8E）-2-[（2R）-2-羥基-24酸-15-烯酰胺]-8-18烯-1，3，4-三醇，即亞麻腦苷脂。

2.3 萊菔素的抑菌試驗

萊菔素是一種天然植物抗生素，主要存在于蘿卜種子中，對金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、肺炎球菌、白喉桿菌、分枝桿菌、百日咳桿菌及大腸桿菌等細菌以及某些致病性真菌具有明顯的抑制作用。本研究結果顯示，濰縣蘿卜莖葉中也含有一定數量的萊菔素，提取后對其抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的效果進行了試驗研究，具體如下。

2.3.1 萊菔素的抑菌試驗方法 萊菔素的抑菌效果采用紙碟法進行測定。將保存的菌株移到LB固體培養基（胰蛋白胨粉10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，瓊脂粉3.5g/L，pH7.0）上進行活化培養，再在LB固體培養基上進行批量培養，用無菌水配制成10⁵～10⁶個/mL的菌懸液，在無菌環境下向每套培養皿（D=9cm）中加入菌懸液1.5mL，迅速倒入約12mLLB培養基。搖勻后冷卻成平板，將蘸有不同濃度酒精（1：2、1：4、1：8、1：16，V：V）稀釋的萊菔素無菌吸水紙片（D=5mm）放置于平板上，并用浸酒精的吸水紙做陰性對照，以鏈霉素做陽性對照，置28℃恒溫培養箱內培養，每個濃度處理重復3次。分別于24、48h測量抑菌圈大小，評價抑菌效果。

2.3.2 萊菔素的抑菌效果 不同濃度萊菔素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果見表2。濃度越大，抑菌圈越大，抑菌效果越好。1.0mg/mL萊菔素基本可以完全抑制菌體生長。

3 結論與討論

濰縣蘿卜的莖葉經50℃烘干，粉碎，浸提，30℃蒸干，萃取，分離，純化，獲得芥子油（Mustardoil）、芥子酸甘油酯（脂肪油，Mustard acid glyeer-ide）、芥子堿硫氰酸鹽（脂肪油，Sinapine thiocya-nate）、β-谷甾醇（β-sitoster01）、γ-谷甾醇（γ-sitosterol）、蘿卜苷（Glucoraphanin）、胡蘿卜苷（Daucosterol）、膽堿（Choline）、亞麻酸（Linolenicacid）、萊菔素（Sulforaphene）、黃酮（Flavone）、十八碳二烯酸（Octadecadienoic acid）、十六碳一烯酸（Hexadecylenic acid）、十八碳一烯酸（Vaccenicacid）、十四烷酸（Myristic acid）、亞麻腦苷脂（Li-Hum cerebroside）、十八烷酸（Octadecanoic acid）、二十烷酸（Eicosanoic acid）18個化合物。其中亞麻腦苷脂具有重要的生物活性，本試驗為亞麻腦苷脂首次從植物中獲得。此外，萊菔素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果試驗顯示0.6～1.0mg/mL萊菔素的抑菌效果明顯。