寧夏水稻品種抗稻瘟病基因Pi—ta、Pi—b和Pi9的檢測分析

張銀霞+張敏+田蕾+楊淑琴+李培富

摘要：為明確寧夏水稻品種中抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和Pi9的分布情況，為寧夏水稻抗穗頸瘟病的分子標記輔助選擇育種奠定基礎。利用Pi-ta、Pi-b和Pi9 3個與抗稻瘟病基因緊密連鎖的功能標記，對94份寧夏水稻品種進行抗稻瘟病基因的分子檢測。結果表明，寧夏水稻品種中含Pi-ta抗性基因的占46.8%，含Pi-b抗性基因的占93.6%，含Pi9抗性基因的占27.7%，同時含有Pi-ta和Pi-b抗性基因的占44.7%，同時含有Pi-ta、Pi-b和Pi9抗性基因的占12.8%。根據報道，Pi-ta、Pi-b基因的聯合效應與穗頸瘟抗性正相關系數為0.71，表明從寧夏水稻品種中選育抗穗頸瘟品種是有基因基礎的。

關鍵詞：水稻品種；稻瘟??；穗頸瘟；Pi-ta基因；Pi-b基因；Pi9基因；抗病基因

中圖分類號： S435.111.4+1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0035-04

水稻（Oryza sativa）是世界上最重要的糧食作物之一，其產生的稻谷是全球半數以上人口的主食。由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae；無性態：Pyriculariagrisea）引起的稻瘟病是水稻生產的主要病害之一[1]，嚴重威脅世界的糧食安全[2-3]。實踐證明，利用抗稻瘟病基因培育抗性品種是防治水稻稻瘟病最經濟、最有效、最環保的手段[4]。

寧夏是我國北方粳稻主產區之一，有悠久的水稻栽培歷史，形成了獨特而豐富的水稻遺傳資源。近年來，隨著全球氣候變暖，稻瘟病的發生越來越嚴重，成為寧夏水稻的常發性病害，也是制約寧夏灌區水稻增產的主要病害，每年都有不同程度的發生，主要以穗頸瘟危害為主，尤其是2006—2007年，局部地區甚至有大發生[5]。然而，這些種質資源卻沒能得到充分利用，其原因首先是這些種質資源的抗稻瘟病基因類型和抗性尚不清楚；其次是常規育種法通常是在抗病性由主效基因控制時才是最有效的，并且存在效率低、工作量大、操作困難等缺點。

近年發展起來的分子標記技術可快速、準確地鑒定出材料中所含的抗性基因類型，并利用與稻瘟病抗性基因緊密連鎖的分子標記進行分子標記輔助選擇育種，這對于培育抗稻瘟病水稻品種有重要意義。目前已定位的抗稻瘟病基因至少有68個位點，總共有83個主效基因，它們成簇地分布在除第3染色體外的所有水稻染色體上[6]，已經有葉瘟、頸瘟、苗瘟共24個抗稻瘟病基因被克?。ǜ鶕袊緮祿行奶峁┑馁Y料），與其緊密連鎖或共分離的分子標記多數都已被開發出來。本研究利用對穗頸瘟抗性貢獻較大且相關性較緊密的抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b、Pi9的緊密連鎖的分子標記[7-9]對寧夏水稻品種的抗病基因進行分子檢測與分析，旨在研究這3個抗性基因在寧夏水稻品種中的分布情況，為通過分子標記輔助選擇育種技術培育抗穗頸瘟的水稻新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用由寧夏大學、寧夏農業科學院等選育出的94份水稻品種作為供試材料：農科843、寧粳3號、寧粳7號、寧粳9號、寧粳12、寧粳15（作）、寧粳16、寧粳18（作）、寧粳19（作）、寧粳23（作）、寧粳25（作）、寧粳26（作）、寧粳27（作）、寧粳28、寧粳29、寧粳31（作）、寧粳32（作）、寧粳33（作）、寧粳34、寧粳35、寧粳36、寧粳37、寧粳38、寧粳39（作）、寧粳40、寧粳41、寧粳42（作）、寧粳43（李）、寧粳44、寧粳45、寧粳46、寧粳47（節7）、寧稻216、寧香稻1號、寧香稻2號、寧香稻3號、寧香優2號、京寧2號、京寧3號、京寧6號、京寧7號、寧資218、寧資460、節9、節12、花92、花96、花98、花117（作）、中花17、鑒17、鑒1310、鑒1320、鑒11、鑒61、鑒24、鑒1342、鑒1346、鑒1360、2007-218、2009XE-588、2001QX-62、2011-173、2012-731、2012-151、2012-162、2012-336、2012.784（航）、2013-1、2013-409、2013P2-36、2013-1104、2013-1120、2013-1134、11NX-2417、11NX-2324、318、05P3、SD-3、SD-4、毛毛糯、寧糯5號、黑蘭稻、小糯稻、養和白皮大稻、大白芒稻、葉盛大皮大稻、小紅板稻、小琥板稻、有芒小琥板稻、小白板稻、有芒大琥板稻、大琥板稻、白皮小稻。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物合成 PCR特異性引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

1.2.2 基因組總DNA的提取 利用SDS法提取總DNA，并用瓊脂糖電泳檢測DNA的質量。以總DNA為模板，按下列反應體系（20 μL）進行PCR擴增：2.0 μL 10×緩沖液（含Mg2+）、0.4 μL dNTP（2.5 mmol/μL）、每種引物各1.0 μL （2 mmol/L）、0. 2 μL Taq酶、2.0 μL 模板DNA，用ddH2O補足至20 μL。PCR反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，退火（溫度依據引物說明而定），72 ℃ 1.5 min，35個循環；72 ℃10 min。擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，核酸染料染色，紫外燈下觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 Pi-ta、Pi-b和Pi9基因功能標記的檢測和驗證

利用Pi-ta、Pi-b和Pi9抗性基因的功能標記特異性PCR引物對94份寧夏水稻品種進行抗病基因檢測。圖1為Pi-ta基因的檢測結果，可以看出，攜帶Pi-ta抗性基因的品種利用Pi-ta引物YL183/YL87能擴增出1 042 bp的片段，不含抗性基因Pi-ta的不能擴出1 042 bp的片段。圖2為Pi-b基因的檢測結果，可以看出，攜帶Pi-b抗性基因的品種利用Pi-b引物Lys145能擴增出803 bp的片段。圖3為Pi9基因的檢測結果，可以看出，攜帶Pi9抗性基因的品種利用Pi9引物M-Pi9能擴增出291 bp的片段，不攜帶Pi9抗性基因的品種擴增出的片段為397 bp。

2.2 寧夏水稻品種抗稻瘟病基因分子檢測結果

通過對寧夏水稻品種抗稻瘟病基因的分子檢測，表2結果表明：94份寧夏水稻品種中含有Pi-ta抗性基因的有44份，占46.8%，根據報道，Pi-ta抗性基因與抗穗頸瘟有正相關關系[7，13]，在寧夏水稻品種中含有Pi-ta抗性基因占46.8%，說明從寧夏當地品種中培育抗穗頸瘟的品種是有基因基礎的；含有Pi-b抗性基因的有88份，占93.6%，說明寧夏水稻品種中大多數都含有Pi-b基因；含有Pi9抗性基因的有26份，占27.7%，Pi9抗性基因為光譜抗性基因，而在寧夏水稻品種中單獨含Pi9抗性基因的材料較少。94份材料中同時含有Pi-ta和Pi-b抗性基因的有42份，占44.7%，根據報道，Pi-ta、Pi-b基因的聯合效應與穗頸瘟抗性正相關系數為0.71[7，13]。因此，攜帶這2個抗病基因可以大大提高穗頸瘟抗性，這也說明從寧夏當地品種中培育抗穗頸瘟的品種是有基因基礎的。由表2還可見，同時含有Pi-ta和Pi9抗性基因的有14份，占14.9%；同時含有Pi-b和Pi9抗性基因的有23份，占24.5%；同時含有Pi-ta、Pi-b和Pi9抗性基因的有12份，占12.8%。

3 討論與結論

由于稻瘟病的發生逐年在增加，尤其是穗頸瘟危害最為嚴重，嚴重時可導致顆粒無收[14]。而近幾年發展的通過分子標記輔助選擇育種（MASB）在水稻抗稻瘟病育種上應用回交轉移抗性基因并進行多個抗性基因的聚合，從而達到增加品種的抗性和抗譜，培育出多抗品種的事例越來越多，比如董巍等通過MASB方法將供體BL6的Pi1、Pi2抗性基因聚合到培矮64S水稻品種中，篩選出10株對稻瘟病的葉瘟和穗頸瘟抗性明顯增強的改良株系[15]。表明多個抗性基因聚合后，抗性基因之間表現為極顯著的基因互作，協同抵抗單個抗病基因不能抵抗的生理小種[16]，這是多基因聚合后抗譜拓寬、抗性增強的重要原因，因此基因聚合是培育稻瘟病持久抗性的有效方法。在聚合雜交中，應用目標性狀緊密連鎖的分子標記進行輔助選擇，可以快速準確地將多個目標基因聚合于一個重組體。比如王軍等研究表明，Pi-ta、Pi-b基因的聯合效應與穗頸瘟抗性呈正相關，并且這種相關性比Pi-ta和Pi-b單獨存在與穗頸瘟抗性的相關性要緊密[7]。

本研究應用3個抗稻瘟病基因緊密連鎖的分子標記對寧夏水稻品種進行檢測，結果表明，46%的寧夏水稻品種中含有抗稻瘟病基因Pi-ta，而Pi-ta基因與穗頸瘟抗性的相關性為0.5[7]；44%的寧夏水稻品種中含有抗稻瘟病基因Pi-ta和Pi-b，而這2種基因與穗頸瘟抗性的相關性為0.7[13，7]，所以這2種抗性基因的存在，可以為寧夏水稻選育抗穗頸瘟品種奠定基因基礎。Pi9為廣譜抗性的基因[17]，而寧夏水稻品種中缺乏Pi9基因，若以此為主效基因，可以聚合其他抗性基因以拓寬抗譜、提高持久抗稻瘟病的能力。目前在寧夏地區最嚴重的稻瘟病危害為穗頸瘟，可以利用品種中含有Pi-ta基因的品種與其他品種進行MASB，選育抗穗頸瘟的品種。所以本研究為寧夏水稻抗稻瘟病以及抗穗頸瘟的分子標記輔助育種奠定了基礎。

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