連翹藥材的高效液相色譜特征圖譜研究Δ

李月婷，任 易，彭治添，晁凌會，張 媛，李 軍

(1.北京中醫藥大學中藥現代研究中心，北京100029； 2.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102)

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·本期特稿·

連翹藥材的高效液相色譜特征圖譜研究Δ

李月婷1，2*，任 易1，2，彭治添1，2，晁凌會1，2，張 媛2，李 軍1#

(1.北京中醫藥大學中藥現代研究中心，北京100029； 2.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102)

目的：建立連翹藥材的特征圖譜分析方法。方法：采用Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈(A)-水(B)為流動相梯度洗脫，流速1.0 ml/min，檢測波長230 nm，柱溫25 ℃，建立不同產地連翹的高效液相色譜特征圖譜；采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2004 A版)進行相似度評價。結果：通過對14批次不同產地連翹樣品的分析，建立了連翹藥材的特征圖譜，確定了6個共有特征峰，并指認了其中5個特征峰的結構，分別為蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、槲皮素和牛蒡子苷元。結論：本研究建立的連翹藥材特征圖譜的特征性和專屬性強，且方法簡便、可靠，重復性好，為更好地控制連翹藥材的內在質量提供了科學依據。

連翹； 特征圖譜； 高效液相色譜； 質量控制

連翹為木犀科植物連翹Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl的干燥果實，于秋季果實初熟尚帶綠色時采收，除去雜質，蒸熟，曬干，習稱“青翹”；于果實熟透時采收，曬干，除去雜質，習稱“老翹”。連翹具有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱的功效，用于癰疽、瘰疬、乳癰、丹毒、風熱感冒、溫病初起、溫熱入營、高熱煩渴、神昏發斑、熱淋澀痛[1]?；瘜W成分和藥理研究結果表明，連翹中主要含有三萜類、苯乙醇苷類、木脂素類、揮發油類等物質[2-4]，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤及解熱鎮痛等活性[2]。連翹良好的清熱解毒功效推動了以連翹為主藥的中成藥制劑的研發逐年增加，如銀翹解毒片、雙黃連口服液、注射用雙黃連(粉針劑)、抗病毒口服液等?，F行《中華人民共和國藥典：一部》(2015年版)以連翹苷和連翹酯苷A的含量測定來控制連翹藥材的質量，但在醫藥市場上，由于連翹同屬植物秦連翹、金鐘花、麗江連翹、奇異連翹、卵形連翹等也具有相同成分而被混作連翹使用[5-7]。因此，測定2個指標成分的含量在一定程度上難以全面反映藥材的真偽與質量的優劣。中藥特征圖譜是選取中藥指紋圖譜中某些重要的特征信息，作為控制中藥質量的重要鑒別手段，它是近年來中藥質量控制的一個研究熱點[8-9]。本研究采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)建立連翹藥材的特征圖譜，以對照藥材為隨行對照，用于鑒別連翹藥材的真偽，旨在為該藥材的鑒別及質量評價提供方法和依據。

1 材料

1.1 儀器

島津分析型HPLC色譜儀(包括二極管陣列檢測器、二元高壓梯度泵、真空脫氣機、柱溫箱、自動進樣器；Labsolution 色譜工作站)(日本島津公司)；超聲波清洗器(南京壘君達超聲電子設備有限公司)；METTLER XS105型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

14批連翹藥材(藥材來源見表1)經北京大學藥學院屠鵬飛教授鑒定為木犀科植物連翹Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl的干燥果實。連翹對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：120908-201216)；連翹苷、連翹酯苷A、槲皮素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110821-201213、111810-201405、100081-201408)；牛蒡子苷元、蘆丁對照品(上海詩丹德生物技術有限公司，批號：STA-88700000、STA-39507019)；甲醇(北京化工廠，分析純)；甲酸(天津市永大化學試劑有限公司，分析純)；甲醇、乙腈(fisher公司，色譜純)；水為Milli-Q超純水。

表1 14批次連翹樣品的來源和相似度

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脫(0～35 min，12%～20% A；35～45 min，20%～27% A；45～55 min，27%～35% A；55～70 min，35%～54% A)；柱溫25 ℃；進樣量10 μl；流速1.0 ml/min；檢測波長230 nm。理論板數按連翹酯苷A計算應不低于3 000。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、槲皮素和牛蒡子苷元對照品適量，加70%甲醇配成每1 ml含蘆丁100 μg、連翹酯苷A 1 mg、連翹苷100 μg、槲皮素100 μg和牛蒡子苷元100 μg的混合溶液作為對照品參照物溶液，備用；取連翹對照藥材約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇30 ml，密塞，稱定質量，浸泡20 min，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，放至室溫(25 ℃)，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，靜置，取上清液濾過，取續濾液，作為對照藥材參照物溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取連翹粉末(過五號篩)約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇30 ml，密塞，稱定質量，浸泡20 min，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，放至室溫(25 ℃)，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，靜置，濾過，取續濾液，即得。

2.4 精密度試驗

取連翹藥材粉末(S6)約1 g，按“2.3”項下的方法制備，在相同色譜條件下連續進樣6次，將所得的色譜圖輸入相似度評價軟件進行相似度比較。以色譜峰2(連翹酯苷A)為參照峰，計算其他5個色譜峰的相對保留時間。結果顯示，連續進樣6次所得的色譜圖相似度均>0.99，RSD<2%，經計算，各色譜峰與峰2的相對保留時間均在規定值的±5%之內，且相對保留時間的RSD<2%，說明該方法的精密度符合分析方法的要求。

2.5 重復性試驗

取連翹粉末(S6)約1 g，按“2.3”項下的方法平行操作6次，制備6份供試品溶液，將所得供試品溶液分別進樣，將所得的色譜圖輸入相似度評價軟件進行相似度比較。以色譜峰2(連翹酯苷A)為參照峰，計算其他5個色譜峰的相對保留時間。結果顯示，各色譜圖的相似度均>0.98，RSD<2%，經計算，各色譜峰與峰2的相對保留時間均在規定值的±5%之內，且相對保留時間的RSD<2%，說明該方法的重復性好。

2.6 穩定性試驗

取連翹粉末(S6)約1 g，按“2.3”項下的方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣10 μl，將所得的色譜圖輸入相似度評價軟件進行相似度比較。以色譜峰2(連翹酯苷A)為參照峰，計算其他5個色譜峰的相對保留時間。各色譜圖的相似度均>0.96，RSD<2%，經計算，各色譜峰與峰2的相對保留時間均在規定值的±5%之內，且相對保留時間的RSD<2%，說明供試品溶液在24 h內穩定。

2.7 特征圖譜的建立

取14批次連翹樣品，按“2.3”項下的方法制備供試品溶液，進樣進行分析。將所得各色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2004 A版)進行數據處理。以S6為參照圖譜，時間窗為0.1 min，中位數法，經多點校正自動匹配生成連翹藥材對照特征圖譜，見圖1。通過對14批次連翹樣品特征圖譜分析，發現圖中1—6號峰為所有樣品溶液色譜圖中共有色譜峰，且峰面積相對較大。因此，確定此6個色譜峰為連翹特征圖譜的共有特征峰。以色譜峰2(連翹酯苷A)為參照峰，計算其他5個色譜峰的相對保留時間，結果見表2。在相同的色譜條件下，將連翹對照藥材按“2.3”項下的方法制備為對照藥材溶液，進樣分析，所得結果見圖2(B)。將標準品溶液進樣分析，并與樣品特征圖譜中相應色譜峰進行比較，確定樣品特征圖譜中的峰1、2、4、5、6分別為蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、槲皮素和牛蒡子苷元，見圖2(C)。

圖1 14批次連翹藥材樣品HPLC特征圖譜與對照特征圖譜疊加圖Fig 1 Overlapped HPLC characteristic fingerprints of 14 batches of Forsythiae Fructus and reference chromatogram

樣品編號1號峰2號峰3號峰4號峰5號峰6號峰S1093771000011514162021791621316S2093961000011535162661798721405S3093861000011519162181792821332S4094281000011515162571798121402S5094221000011519162791800621439S6094191000011515162451796721396S7094191000011522158261797221390S8094431000011543162911801321443S9094411000011552163071803721477S10094341000011538162711799821418S11094311000011538162591798021396S12094291000011536162461796321373S13094281000011522162191792621334S14094121000011525162301794621351平均值094191000011528162231797321391RSD/%0210011073020022

A.樣品；B.對照藥材；C.混合對照品；1.蘆??；2.連翹酯苷A；4.連翹苷；5.槲皮素；6.牛蒡子苷元A.Samples; B.Reference herb; C.mixed standards；1.Rutin; 2.Forsythoside A; 4.Phillyrin; 5. Quercetin; 6.Arctigenin圖2 連翹藥材、對照藥材和對照品的HPLC圖Fig 2 HPLC chromatagrams of Forsythiae Fructus samples, reference herb and mixed standards

2.8 特征圖譜相似度評價

將14批次樣品色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2004 A版)進行數據處理，得到對照圖譜，繼而得到樣品與對照圖譜的匹配圖，見圖1。計算14批次供試品色譜圖和對照圖譜之間的相似度數據，結果見表1，14批次樣品相似度均>0.90，說明本實驗收集的14批次連翹藥材質量均較好，一定程度上反應了市場上流通的連翹藥材質量較好。

3 討論

在14批次樣品中，S6連翹藥材樣品的色譜峰最多，因此用S6樣品進行色譜條件、提取方法及方法學的考察；由相似度軟件得到的14批連翹的色譜圖中共有峰較多，但由于有的色譜峰對應的成分在某些批次的藥材中含量較小或檢測不到，故選擇出峰時間基本一致、峰面積較大的6個峰為共有特征色譜峰。

實驗過程中考察了不同色譜條件，包括色譜柱、檢測波長、流動相、洗脫梯度、進樣量、柱溫、流速對分析方法建立的影響。最后確定的色譜條件為：Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈-水梯度洗脫；柱溫25 ℃；進樣量10 μl；流速1.0 ml/min；檢測波長230 nm。

在提取方法的選擇上，分別用30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和100%甲醇作為提取溶劑，15、30、60和90 min作為提取時間，超聲(30 min)、加熱回流(30 min)和浸泡提取(24 h)作為提取方式，20、30和40 ml作為提取體積，考察不同提取條件所獲得的圖譜。結果表明，70%甲醇30 ml超聲提取30 min的提取效率高且方法簡便。實驗中發現，超聲提取前浸泡20 min，實驗重復性好，有利于更充分地提取樣品。

本實驗通過對市場上采集的14批次連翹藥材的圖譜分析，建立了連翹藥材的特征圖譜，14批次不同產地的連翹藥材特征圖譜相似度較高，均>0.90，說明不同產地連翹藥材的化學成分較一致，但應注意色譜峰對應的成分在含量上有一定的差異。通過對14批次樣品特征圖譜中色譜峰的分析，確定了6個共有特征峰；通過與混合對照品溶液對照，鑒定其中5個共有特征峰的結構分別為蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、槲皮素和牛蒡子苷元。其中，2號峰的峰面積較大，且分離度與對稱性均良好，因此將2號峰作為參照峰S，計算各批次樣品中共有特征峰的相對保留時間。結果峰1、3、4、5、6的相對保留時間分別為0.942、1.153、1.622、1.797、2.139。在相同的色譜條件下，連翹對照藥材的色譜圖中也呈現與對照特征圖譜中共有特征峰相應的6個色譜峰。在連翹藥材的鑒別檢測中，通過對照藥材隨行對照，采用特征圖譜能夠實現對連翹藥材的真假鑒別。因此，在藥材的質量評價過程中，應將特征圖譜與《中華人民共和國藥典》的檢測項目結合起來，真正做到控制連翹藥材及其相關制劑的質量。

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Study on the Characteristic Fingerprint of Forsythiae Fructus by HPLCΔ

LI Yueting1,2, REN Yi1,2, PENG Zhitian1,2, CHAO Linghui1,2, ZHANG Yuan2, LI Jun1

(1.Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China; 2.School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

OBJECTIVE：To establish the HPLC characteristic fingerprint for the quality control of Forsythiae Fructus. METHODS: Diamonsil C18column(250 mm×4.6 mm, 5 μm) was adopted, the mobile phase was composed of acetonitrile(A) and water(B) with a gradient elution solvent system with flow rate of 1.0 ml/min. The detection wavelength was 230 nm and the column temperature was 25 ℃. The Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine (version 2004A) was used to calculate the similarity of the HPLC characteristic fingerprint of Forsythiae Frucuts from different habitats. RESULTS: HPLC characteristic fingerprint was established with six common characteristic peaks based on the analysis of 14 batches of Forsythiae Frucuts Five common characteristic peaks were identified as rutin, forsythoside A, forsythin, quercetin, and arctigenin. CONCLUSIONS: The established method shows good characteristics, specificity, and repeatability, which can provide a scientific basis for the identification and quality control of Forsythiae Frucuts.

Forsythiae Fructus; Characteristic fingerprint; HPLC; Quality control

國家工信部中藥材扶持項目；教育部新世紀優秀人才支持計劃資助項目(No.NCET-13-0693)

R931

A

1672-2124(2016)10-1297-03

2016-08-26)

*碩士研究生。研究方向：中藥藥效物質基礎和質量評價。E-mail：yuetingli1111@163.com

#通信作者：副研究員，碩士生導師。研究方向：中藥藥效物質、作用機制和質量評價。 E-mail：drlj666@163.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.10.001