小清咽顆粒的高效液相色譜指紋圖譜研究Δ

楊 亮，樸春梅，韓云霞，代 欣，李麗鳳

(1.貴陽中醫學院第二附屬醫院藥學部，貴州 貴陽 550001； 2.貴陽中醫學院藥學系，貴州 貴陽 550025)

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小清咽顆粒的高效液相色譜指紋圖譜研究Δ

楊 亮1*，樸春梅1，韓云霞1，代 欣1，李麗鳳2

(1.貴陽中醫學院第二附屬醫院藥學部，貴州 貴陽 550001； 2.貴陽中醫學院藥學系，貴州 貴陽 550025)

目的：采用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)對小清咽顆粒進行指紋圖譜研究。方法：色譜柱為迪馬Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液，檢測波長為266 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 ml/min。結果：10批小清咽顆粒的HPLC指紋圖譜有10個共有峰，相似度>0.950，整體相似性好。結論：本研究建立的小清咽顆粒指紋圖譜的特征性和專屬性強，且方法簡便、穩定、重復性好，可為小清咽顆粒質量控制提供依據。

小清咽顆粒； 高效液相色譜； 指紋圖譜； 相似度

小清咽顆粒是由桑葉[1-2]、射干[3]、玄參[4]等6味中藥飲片提取、精制而成的醫院制劑[5]，具有滋陰潤肺、消腫利咽之效，用于急喉痹及上呼吸道感染引起的咽喉疼痛，臨床療效確切[6]。參考相關文獻[7-10]，本研究采用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)，建立了小清咽顆粒的指紋圖譜，以期為該制劑的質量控制提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

Aglent 1260 型HPLC儀、二極管陣列檢測器(美國安捷倫科技公司)；分析天平-AG135(瑞士梅特勒托利多公司)；SG820OHPT型超聲震蕩儀(上海冠特超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

小清咽顆粒(批準文號：黔藥制字Z20130007，批號：41101、41201、41202、41203、50101、50102、50301、50302、50401、50402)，由貴陽中醫學院第二附屬醫院藥學部制劑室提供；射干苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111632-200501)。乙腈(美國天地有限公司，色譜純)；甲醇(天津市富宇精細化工有限公司，分析純)；磷酸[重慶川東化工(集團)有限公司，分析純]；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為迪馬Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫[11-12](洗脫程序見表1)；流速1 ml/min，檢測波長266 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液：精密稱取射干苷對照品適量，加甲醇制成1 ml含40 μg射干苷的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液：取小清咽顆粒，研細，混勻，精密稱取粉末2.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入70%乙醇25 ml，搖勻，靜置30 min，稱定質量。超聲處理30 min，放冷，稱質量用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

表1 梯度洗脫程序

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗及參照峰的選擇：取同一批制劑(批號：41202)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續進樣6次進行測定，見圖1?？芍?號色譜峰響應值較大，且已知為射干苷對照品的色譜峰，故設為參照(峰面積設為1)。結果表明，各共有峰相對峰面積的RSD均≤2.73%，共有峰相對保留時間的RSD均≤0.29%，表明本方法的精密度符合要求。

2.3.2 重復性試驗：取同一批制劑(批號：41202)，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續進樣6次進行測定。結果表明，所有共有峰相對峰面積的RSD均≤2.83%，共有峰相對保留時間的RSD均≤0.37%，表明本方法的重復性符合要求。

2.3.3 穩定性試驗：取同一批制劑(批號：41202)，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、8、12、16、24、36、48 h，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。結果表明，所有共有峰相對峰面積的RSD均≤2.48%，共有峰相對保留時間的RSD均≤0.37%，表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.4 指紋圖譜的建立

將10批小清咽顆粒HPLC色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012.130723版)”，以對照譜圖上標示的色譜峰作為匹配點，經多點校正，采用中位數方法，時間窗寬度為0.5，進行自動匹配色譜峰，生成小清咽顆粒色譜指紋圖譜共有模式，標定了10個共有峰，見圖1。10批小清咽顆粒指紋圖譜的相似度為0.951～0.997，平均值為0.969，RSD為1.69%，見圖2、表2。表明各批次小清咽顆粒之間無明顯差異性，本方法可用于鑒別小清咽顆粒的整體質量。

圖1 小清咽顆粒對照指紋圖譜Fig 1 Fingerprint and its common fingerprint peaks of Xiaoqingyan granules

圖2 10批小清咽顆粒HPLC指紋圖譜疊加圖Fig 2 HPLC fingerprint chromatogram of 10 batches of Xiaoqingyan granules

批次S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10RS11——————————S209871—————————S3096709751————————S40960096309681———————S509510958096309861——————S6097909870985096009561—————S70953095809730983098109641————S809510955097109790976096009811———S9097809870984096409600997096809651——S100979098709820969096609940974097109971—R09790987099009770974099409810977099609971

3 討論

3.1 檢測波長的確定

本研究分別考察了檢測波長為358、266、245、237、210 nm時的指紋圖譜。結果表明，在266、245、237 nm檢測波長下所得色譜峰紫外吸收較大，其中又以266 nm波長所得色譜基線較平穩，吸收最大，故檢測波長確定為266 nm。

3.2 流動相的選擇

在梯度洗脫程序初步確定的條件下，參考相關文獻[13-15]選用不同比例的乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-水等作為不同流動相組合進行對比試驗。結果表明，采用乙腈-0.1%磷酸溶液進行系統洗脫，色譜峰信息較多，且峰型和分離度較好，故流動相確定為乙腈-0.1%磷酸溶液。

3.3 色譜柱的選擇

采用反相色譜十八烷基硅烷鍵合相色譜柱。不同生產廠家不同牌號的色譜柱存在填料及性能上的差異，實驗中分別比較了4種牌號色譜柱的分離情況，該4種色譜柱分別為：(1)Thermo Hypersil Gold(250 mm×4.6 mm，5 μm)；(2)Phenomenex Synergi Hydro-RP 80A(250 mm×4.6 mm，5 μm)；(3)Agilent ZOBX C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；(4)迪馬Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。結果表明，色譜柱(1)和(3)的分離效果較好，但極性大的成分無法分離。色譜柱(4)可以達到良好的分離效果，故最終采用迪馬Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱。

3.4 柱溫的選擇

在不同的溫度下按同樣的洗脫程序進行試驗，選擇分離效果適宜的柱溫條件，確保圖譜有良好的分離度和穩定性。結果表明，在柱溫25和30 ℃條件下，色譜峰的保留時間最大相差3 min，且柱溫25 ℃下部分色譜峰分離度較差。因此，為了減少柱溫對色譜峰分離的影響，確定柱溫為30 ℃。

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Study on Fingerprint of Xiaoqingyan Granules by HPLCΔ

YANG Liang1, PU Chunmei1, HAN Yunxia1, DAI Xin1, LI Lifeng2

(1.Dept.of Pharmacy, the Second Hospital Affiliated to Traditional Chinese Medicine College of Guiyang, Guizhou Guiyang 550001, China; 2.Dept.of Pharmacy, Traditional Chinese Medicine College of Guiyang, Guizhou Guiyang 550025, China)

OBJECTIVE：To establish the fingerprint of Xiaoqingyan granules by HPLC. METHODS: Dikma Diamonsil Plus C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) was adopted; acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution was used as the mobile phase for the gradient elution; the wavelength was set at 266 nm; the column temperature was at 30℃ with the flow rate of 1.0 ml/min. RESULTS: 10 common peaks were confirmed and similarity of 10 batches of Xiaoqingyan granules was more than 0.950; the overall similarity was good. CONCLUSIONS: The established method has characteristic and strong specificity, which is sensitive, accurate and simple, and can provide basis for the quality control of Xiaoqingyan granules.

Xiaoqingyan granules; HPLC; Fingerprint; Similarity

貴州省中醫藥、民族醫藥科學技術研究課題計劃(No.QZYY2013-70號)；貴州省科學技術廳貴陽中醫學院科學技術聯合資金(No.黔科合LH字[2014]7323號)

R927.11

A

1672-2124(2016)10-1318-03

2016-07-09)

*主管中藥師，碩士。研究方向：中藥臨床藥學、中藥質量控制。E-mail:brightnet@qq.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.10.007