從日本進境郵寄物中截獲傷殘短體線蟲

閆世艷， 陳 艷， 邊 勇， 高文娜， 簡 恒， 李倞平， 張繼軍

1北京農學院，北京102206；2中國農業大學，北京100193；3北京出入境檢驗檢疫局，北京100026

?

從日本進境郵寄物中截獲傷殘短體線蟲

閆世艷1，2， 陳 艷1*， 邊 勇3*， 高文娜3， 簡 恒2， 李倞平3， 張繼軍3

1北京農學院，北京102206；2中國農業大學，北京100193；3北京出入境檢驗檢疫局，北京100026

【背景】2015年北京出入境檢驗檢疫技術中心植物實驗室從日本郵寄進境的雞爪槭中檢出一種短體線蟲?！痉椒ā客ㄟ^采用形態學鑒定、rDNA序列測定及系統進化分析，對該線蟲進行鑒定?！窘Y果】將該線蟲的形態特征和測計值與已知種群比較，與Pratylenchusvulnus最為接近；系統進化分析表明，其rDNA-ITS區序列特征與P.vulnus序列相似度為99%;系統發育樹表明,其與P.vulnus聚為一組，證實該線蟲為傷殘短體線蟲P.vulnus?！窘Y論與意義】傷殘短體線蟲是一種重要的植物寄生線蟲,我國進出境檢疫部門曾多次從入境貨物中檢出該線蟲，但從入境郵寄物中檢中尚屬首次。

郵寄物檢疫； 傷殘短體線蟲； 雞爪槭； rDNA-ITS； 系統發育； 鑒定

短體屬Pratylenchussp.線蟲又稱根腐線蟲，是一種寄生于植物根部的內寄生線蟲，已報導的該屬線蟲有近百種，多數能寄生多種植物,可造成作物根系大面積腐爛和壞死(Castillo & Vovlas,2007)。近年來,我國口岸曾多次從進境觀賞植物中截獲咖啡短體線蟲P.coffeae、穿刺短體線蟲P.penetrans、朱頂紅短體線蟲P.hippeastri等(劉筱嘉等，2013； 馬以桂等，2003； 葉為民等，1998)，可見短體線蟲傳入我國的風險很高。隨著網上購物、網上交易等新型貿易方式的發展，越來越多的商品通過郵件以及快遞的形式進入我國，國際郵件已逐漸成為外來有害生物和外來物種傳入的重要渠道。1966年，南京動植物檢疫局首次從荷蘭郵寄進境的郁金香種球中檢出檢疫性有害生物——鱗球莖莖線蟲Ditylenchusdipsaci(kühn) Filijev(萬曉泳等，2012)。近幾年不斷有新的檢疫性有害生物從郵寄進境的植物中被檢出，其中包括大量檢疫性線蟲，由于其個體微小，不易被發現，因此具有較高的檢疫風險。

近日，北京出入境檢驗檢疫局對日本郵寄進境的雞爪槭AcerpalmatumThunb.盆栽樣品進行檢疫時，分離到一種短體屬線蟲。該蟲數量較多，通過顯微鏡觀察、形態測量、rDNA-ITS區序列擴增、測序比對分析，鑒定為傷殘短體線蟲P.vulnus，這是我國首次從入境郵寄物中截獲該線蟲。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

雞爪槭盆景系從日本郵寄入境時被截獲，其根部帶有介質。

1.2 線蟲分離

采用貝曼漏斗法(謝輝，2000)：取一個連接乳膠管的漏斗，下部用止水夾控制膠管關閉，漏斗內注入700 mL清水，用紗布將根部及介質包好后緩慢置于漏斗中，使水浸透，25 ℃左右靜置24 h后，用凹面皿接取分離液10 mL,體視顯微鏡鏡檢。

1.3 形態學鑒定

在潔凈的載玻片上滴一滴無菌水，用挑針在體式顯微鏡下挑取形態大小大致相同的線蟲置于載玻片上，在酒精燈火焰上來回移動加熱幾秒鐘至線蟲死亡，蓋上蓋玻片，用凡士林涂抹四周封片(劉維志，2004)。將載玻片置于光學顯微鏡下，對線蟲的整體形態及內部構造仔細觀察，同時測量及拍照，最后隨機選取5條線蟲使用Deman公式進行形態測試(Reddy,1983)

1.4 線蟲的分子鑒定

1.4.1 單條線蟲DNA的提取 參照王金成等(2012)和王江嶺等(2011)的方法并適當改進，取潔凈的載玻片，滴一滴無菌水，將線蟲挑入無菌水中漂洗3次后挑入內置5 μL 10×PCR-buffer的200 μL PCR管中，加入10 μL ddH2O，置于離心機離心120 s后，于-80 ℃冰箱中存放30 min，取出后用液氮冷凍PCR管底1 min，重復凍融過程2～3次，然后迅速轉移到85 ℃水浴鍋中加熱2 min,使細胞充分裂解，向管中加入1 μL的蛋白酶 K(1 mg·mL-1),置于PCR儀中56 ℃溫浴30 min以降解脫氧核糖，95 ℃加熱10 min，使蛋白酶K失活，最后將PCR管置于離心機12000 r·min-1離心120 s, 離心后取上清液用于PCR擴增。

1.4.2 PCR擴增 采用引物對上游ITS1:5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′和下游ITS2:5′-GCTGCGTTCTTCATCGAT-3′(王揚等，2007)進行擴增。

PCR的反應體系50 μL，包括10×PCR-buffer5 μL，5 U·μL-1TaqDNA 0.25 μL，10 mmol·L-1dNTP 1μL，10 μmol·L-1上下游引物各3 μL，線蟲粗提取液5 μL，加入純水定容至50 μL。PCR反應程序參照Maafietal. (2003)的方法，94 ℃預變性4 min，94 ℃ 40 s,52 ℃ 1 min,72 ℃ 1.5 min，36個循環，最后72 ℃保溫8 min，使反應物充分延伸。

1.4.3 PCR產物的檢測、測序及序列分析 取5 μL PCR產物于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳20 min,采用凝膠成像系統成像,觀察電泳結果,拍照并記錄，如條帶清晰明顯即送至北京天一輝遠公司測序。將測序結果做BLAST相似性比對,從比對結果中選取同源性較高的13種短體屬線蟲的rDNA-ITS區序列進行系統發育分析, 選取美洲劍線蟲XiphinemaamericanumCobb的部分ITS序列作為外群(outgroup)對照。通過軟件MEGA 4.0對所測序列以及下載的短體線蟲ITS序列進行比對分析，選用臨接法(neighbor-joining)距離模型構建系統發育樹并做自展檢驗(bootstrap)以獲得分支的支持率，自展檢驗重復抽樣次數1000次(陳曉玲等，2009)。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定

在顯微鏡下觀察雞爪槭中分離出的線蟲形態(圖1)，雌蟲蟲體細長，唇區有3條環紋，口針發達，長15～18 μm；基球寬圓形，中食道球卵形，較窄，排泄孔位于食道與腸交界處相對的位置；食道腺從腹面以一長葉狀覆蓋腸的前端，側區具4條側線。V值80%～82%, 尾錐形，尾尖亞銳尖。見少量雄蟲。

2.2 形態測計值

從日本進境郵寄雞爪槭中分離的短體線蟲，形態特征和測計值與Doucet & Lax (1997)和Loofetal. (1985)的描述最為接近(表1)。故初步將其定為傷殘短體線蟲。

2.3 rDNA-ITS區序列特征

經過PCR擴增、測序(魏亞東等，2013)，通過比對，除去18S和28S，得到大小為800 bp的2條序列，將序列與NCBI數據庫中的序列比對后發現,這2條線蟲的ITS序列與編號為FR692321.1、LC030340.1、FR692320.1、JQ003990.1的P.vulnus序列相似度為99%。系統發育樹也可看出,該線蟲與P.vulnus聚為一組(圖2),與其他線蟲差異明顯。綜合上述形態學及所分子水平的分析結果，將截獲的短體線蟲鑒定為傷殘短體線蟲。

圖1 雞爪槭上截獲的短體線蟲雌蟲顯微照片

樣本Sample數量NumberL(mm)abb'cc'VSt(μm)本試驗Thisresearch50.66～0.7031.2～38.35.8～6.44.3～5.117.3～20.42.3～2.680～8215～18已報道種群ⅠReportedpopulationⅠ①800.43～0.6124.9～37.34.7～7.03.2～5.216.2～25.12.0～3.077～8414～16已報道種群ⅡReportedpopulationⅡ②140.47～0.7227.8～37.65.7～7.7-18.4～24.7-77～8213～19

①參見Doucet & Lax (1997);②參見Loofetal. (1985);L=體長；a=體長/最大體寬；b=體長/體前端至食道與腸連接處的距離；b′=體前端至食道腺末端的距離；c=體長/尾長；c′=體長/肛門處體寬；V=體前端至陰門的距離×100/體長； St=口針。

①refer to Doucet & Lax (1997);②refer to Loofetal. (1985); L=Body length; a=Body length/maximum body width; b= Body length/the distance from body front to esophagus and intestines junction; b′=The distance of body front to the end of the esophagus gland; c= Body length/tail length; c′= Body length/anus body width; V=The distance of body front to vulva×100/body length. St=Stylet.

3 討論

由于短體線蟲形態差異大，且一種樣品中可能存在多種短體線蟲，因此鑒定時必須選取大量樣本(顧建鋒等，2013)。隨著分子技術的發展，以核糖體ITS、18S rRNA、28S rRNA-D2D3區序列作為分子標記在短體線蟲的鑒定中起到了重要的作用，分類鑒定也從形態學鑒定發展為形態學和分子生物技術相結合(王金成等，2012)。本研究通過形態特征及測量值初步將截獲的線蟲鑒定為傷殘短體線蟲，為確保準確性，通過構建系統發育樹進一步確認。

傷殘短體線蟲目前主要分布在美國、歐洲、澳大利亞、古巴、埃及等地,在我國云南省曾有報道。該線蟲寄主范圍廣泛、易遷移，且世代短、繁殖快，對植物危害嚴重，在田間可引起病株地上部葉片發黃、植株矮小，受害嚴重時造成死苗、缺苗、斷壟等現象。傷殘短體線蟲曾為我國三類檢疫性有害生物(中華人民共和國農業部，1993),2007年我國發布《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》，將全部短體線蟲非中國種列為檢疫對象(劉剛，2007)。由于該線蟲在我國一些地區已有分布，按照名錄規定，已不屬于我國對外檢疫性有害生物，但鑒于傷殘短體線蟲的危害性，目前仍屬我國官方管制的非檢疫性有害生物(RNQP)。

圖2 基于rDNA ITS 區序列的臨接法(NJ)構建系統發育樹

本研究通過形態學與分子生物學相結合的方法彌補了傷殘短體線蟲傳統形態鑒定的不足,為其他種類線蟲的單條分子鑒定提供了參考,對線蟲的檢疫鑒定工作具有重要意義。

陳曉玲, 陳永紅, 張洪玲, 武目濤, 鐘國強, 方羽生, 2009. 咖啡短體線蟲分子鑒定. 植物檢疫， 23(2)： 7-9.

顧建鋒, 王江嶺, 何潔, 陳先鋒, 2013. 4種常見短體線蟲形態特征比較鑒別. 植物檢疫, 27(6): 69-71.

劉剛, 2007. 《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》發布. 農藥市場信息 (13): 38-39.

劉維志, 2004. 植物線蟲志. 北京: 中國農業出版社.

劉筱嘉, 陳吳建, 武揚, 2013. 我國首次截獲朱頂紅短體線蟲. (2013-03-22)[2016-02-17]. http:∥www.aqsiq.gov.cn/zjxw/dfzjxw/dfftpxw/201303/t20130322_348217.htm.

馬以桂, 劉 鵬, 崔鐵軍, 2003. 天津口岸在日本牡丹苗中截獲穿刺短體線蟲. 植物檢疫, 17(4): 197.

萬曉泳, 王允榮, 李曉慶, 柯俊凡， 2012. 淺談郵包中的植物產品檢疫. 商場現代化 (31): 43.王金成, 魏亞東, 顧建鋒, 張瑞豐, 黃國明, 王暄, 李紅梅, 孫建華, 2012. 基于核糖體ITS區和28S rRNA D2～D3區的短體線蟲系統發育研究. 動物分類學報, 37(4): 687-693.

王江嶺, 張建成, 顧建鋒, 2011. 單條線蟲DNA提取方法. 植物檢疫, 25(2): 32-35.王揚, 李婭瓊, 浦衛瓊, 胡先奇, 喻盛甫， 2007. 云南省柑桔根際短體線蟲種類的鑒定. 華中農業大學學報, 26(6): 775-779.魏亞東, 容萬韜, 趙立榮, 王金成， 黃國明， 郭京澤， 孫建華, 2013. 五種短體線蟲DNA 條形碼鑒定方法. 華北農學報, 28(6): 136-139.

謝輝, 2000. 植物線蟲分類學. 合肥: 安徽科學技術出版社.葉為民, 陳雪嬌, 李一農, 李建生， 鄒子興, 1998. 從進口天堂小鳥種苗中截獲咖啡短體線蟲. 中國進出境動植檢 (3): 20.

中華人民共和國農業部， 1993. 中華人民共和國農業部頒布的《危險性病、蟲、雜草名錄》和《禁止進境物名錄》. 植物檢疫, 1: 1-5.

Castillo P and Vovlas N， 2007.Pratylenchus(NematodaPratylenchidae):Diagnosis,Biology,PathogenicityandManagement(NematologyMonographsandPerspectives). Leiden, The Netherlands: Brill Academic Publisers.Doucet M E and Lax P, 1997. Caracterizacioon de una población y un aisladodePratylenchusvulnusAllen et Jensen, 1951 (Nematoda: Tylenchida) provenientes de la Provincia de Córdoba. Argentina.NematologiaMediterranea， 25: 287-298.

Loof P A A, 1985.Pratylenchusscribneri∥Muller R, Gooch P S, Siddiqi M R and Hunt D J.CIHDescriptionsofPlantParasiticNematodes. St Albans, UK: Commonwealth Agricultural Bureaux, 8: 4.

Maafi Z T, Subbotin S A and Moens M， 2003. Molecular identification of cyst-forming nematodes (Heteroderidae) from Iran and a phylogeny based on ITS-rDNA sequences.Nematology, 5(1): 99-111.

Reddy P P, 1983.PlantNematology. New Delhi: Pratibha Printing Press.

(責任編輯:郭瑩)

Root-lesion nematode,Pratylenchusvulnus, on imported mails from Japan

Shi-yan YAN1，2， Yan CHEN1*， Yong BIAN3*， Wen-na GAO3，Heng JIAN2, Jing-ping LI3, Ji-jun ZHANG3

1BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China;2ChinaAgricultureUniversity,Beijing100193，China;3BeijingEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Beijing100226,China

【Background】 In 2015,onePratylenchuspopulation was collected in the roots and growing media ofAcerpalmatumimported from Japan by plant quarantine lab of Beijing entry-exit inspection and quarantine bureau, China. 【Method】 In the study the population was identified by morphological measurements, rDNA sequence and phylogenetic analysis. 【Result】 Comparing the morphological characteristics and measurements with known species, the nematode is phylogenetically close toPratylenchusvulnus, accroding to the sequence of rDNA-ITS region with 99%. The results confirmed that this population wasP.vulnus. 【Conclusion and significance】P.vulnusis an important plant parasitic nematodes that has been intercepted from the entry of goods many times by our entry-exit inspection and quarantine departments, but it is the first time in the mail quarantine.

mail quarantine;Pratylenchusvulnus;Acerpalmatum; rDNA-ITS; phylogenetic analysis; identification

2016-03-01 接受日期(Accepted)： 2016-05-06

北京市教委2015年度科研計劃項目(KM201510020004)； 國家質檢總局科技計劃項目(2015IK023)

閆世艷， 女， 碩士研究生。 研究方向: 植物病理學。 E-mail: 1636824522@qq.com

*通訊作者(Author for correspondence), 陳艷， E-mail: cheny@bua.edu.cn； 邊勇， E-mail: biany@bjciq.gov.cn

10. 3969/j.issn.2095-1787.2016.04.010